斑马鱼心脏收缩的 4D 光片成像

摘要

该协议利用光片成像来研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞跟踪和交互式分析深入了解心脏力学。

摘要

斑马鱼是一种有趣的模式生物，以其非凡的心脏再生能力而闻名。 在体内 研究收缩的心脏对于深入了解损伤引起的结构和功能变化至关重要。然而，获得斑马鱼心脏的高分辨率和高速 4 维（4D、3D 空间 + 1D 时间）图像以评估心脏结构和收缩力仍然具有挑战性。在这种情况下，使用内部光片显微镜（LSM）和定制的计算分析来克服这些技术限制。该策略涉及LSM系统构建、回顾性同步、单细胞跟踪和用户导向分析，使人们能够以单细胞分辨率研究转基因 Tg（myl7：nucGFP） 斑马鱼幼虫的整个心脏的微观结构和收缩功能。此外，我们能够进一步结合小分子化合物的显微注射，以精确和可控的方式诱导心脏损伤。总体而言，该框架允许人们跟踪生理和病理生理变化，以及心脏形态发生和再生过程中单细胞水平的区域力学。

引言

斑马鱼 （Danio rerio） 是一种广泛使用的模式生物，用于研究心脏发育、生理学和修复，因为它具有光学透明度、遗传可处理性和再生能力 1,2,3,4。心肌梗死后，虽然结构和功能变化会影响心脏射血和血流动力学，但技术限制继续阻碍以高时空分辨率研究心脏再生过程中动态过程的能力。例如，传统的成像方法，如共聚焦显微镜，在成像深度、时间分辨率或光毒性方面存在局限性，无法捕捉多个心动周期期间的动态变化和评估心脏收缩功能⁵。

光片显微镜代表了一种最先进的成像方法，它通过快速扫描激光扫过心脏的心室和心房，获得具有增强的时空分辨率和可忽略不计的光漂白和光毒^性效应的详细图像，从而成功地解决了这些问题6,7,8,9,10,11。<....

研究方案

这项研究的批准由德克萨斯大学达拉斯分校的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，协议编号为 #20-07。本研究采用 Tg（myl7：nucGFP） 转基因斑马鱼幼虫¹² 。所有数据采集和图像后处理均使用具有研究或教育许可证的开源软件或平台进行。这些资源可根据作者的合理要求获得。

1. 斑马鱼繁殖和胚胎显微注射

定时：2天

1. 通过标准护理和繁殖程序维护和繁殖成年斑马鱼。详细方法见上一份报告¹³。
2. 按照既定方案¹⁴进行显微注射。在本研究中，显微注射在 1-2 细胞（受精卵）阶段进行。
   注意：准确识别此阶段对于有效的显微注射并确保发育一致性至关重要。在单细胞阶段，卵黄顶部形成一个小圆顶，该阶段通常持续约 12 分钟。在进展到双细胞阶段时，两个相邻的圆顶变得可见，并且该阶段在受精后持续约 45 分钟¹⁵。有关系统构建的更详细信息，请参阅其他报告或协议12,16,17。

讨论

斑马鱼模型与工程方法的整合对于心肌梗塞、心律失常和先天性心脏缺陷的体内探索具有巨大的潜力。利用其光学透明度、再生能力以及与人类的遗传和生理相似性，斑马鱼胚胎和幼虫已被广泛用于研究 ^1,2,4。光片成像卓越的时空分辨率、最小的光损伤和光学切片能力使其在斑马鱼幼虫心脏形态和收缩功能的 4D 研究中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S