4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

Summary

يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.

Abstract

الزرد هو كائن نموذجي مثير للاهتمام معروف بقدرته الرائعة على تجديد القلب. تعد دراسة القلب المنقبض في الجسم الحي أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية والوظيفية استجابة للإصابات. ومع ذلك ، فإن الحصول على صور عالية الدقة وعالية السرعة رباعية الأبعاد (4D ، 3D المكانية + 1D الزمانية) لقلب الزرد لتقييم بنية القلب وانقباضه لا يزال يمثل تحديا. في هذا السياق ، يتم استخدام مجهر الصفيحة الضوئية الداخلي (LSM) والتحليل الحسابي المخصص للتغلب على هذه القيود التقنية. هذه الاستراتيجية ، التي تنطوي على بناء نظام LSM ، والتزامن بأثر رجعي ، وتتبع الخلية الواحدة ، والتحليل الموجه للمستخدم ، تمكن المرء من التحقيق في البنية الدقيقة ووظيفة الانقباض عبر القلب بأكمله بدقة الخلية الواحدة في يرقات الزرد Tg (myl7: nucGFP) المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، نحن قادرون على دمج الحقن المجهري لمركبات الجزيئات الصغيرة للحث على إصابة القلب بطريقة دقيقة ومضبوطة. بشكل عام ، يسمح هذا الإطار للمرء بتتبع التغيرات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، بالإضافة إلى الميكانيكا الإقليمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء تكوين القلب وتجديده.

Introduction

الزرد (Danio rerio) هو كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وعلم وظائف الأعضاء والإصلاح بسبب شفافيته البصرية وقابليته للسحب الجيني وقدرته على التجدد^1،2،3،4. عند احتشاء عضلة القلب ، بينما تؤثر التغيرات الهيكلية والوظيفية على طرد القلب وديناميكا الدم ، تستمر القيود التقنية في إعاقة القدرة على التحقيق في العملية الديناميكية أثناء تجديد القلب بدقة مكانية زمانية عالية. على سبيل المثال ، طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود من حيث عمق التصوير أو الدقة الزمنية أو السمية الضوئية لالتقاط التغييرات الدي....

Protocol

تم منح الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة تكساس في دالاس ، بموجب البروتوكول رقم # 20-07. Tg(myl7:nucGFP) تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا¹² في هذه الدراسة. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.

1. تربية الزرد والحقن المجهري للأجنة

التوقيت: 2 أيام

1. الحفاظ على وتربية الزرد البالغ من خلال إجراءات الرعاية القياسية والتكاثر. وللاطلاع على الأساليب التفصيلية، يرجى الرجوع إلى ال....

النتائج

يتكون البروتوكول الحالي من ثلاث خطوات رئيسية: إعداد الزرد والحقن المجهري ، والتصوير بالضوء وإعادة بناء الصور 4D ، وتتبع الخلايا وتفاعل الواقع الافتراضي. سمح لأسماك الزرد البالغة بالتزاوج ، وتم جمع البيض المخصب ، وإجراء الحقن المجهري حسب الحاجة للتجارب المقترحة (الشكل 1). تو.......

Discussion

إن دمج نموذج الزرد مع الأساليب الهندسية يحمل إمكانات هائلة لاستكشاف احتشاء عضلة القلب في الجسم الحي ، وعدم انتظام ضربات القلب ، وعيوب القلب الخلقية. من خلال الاستفادة من شفافيتها البصرية وقدرتها على التجدد والتشابهات الجينية والفسيولوجية مع البشر ، أصبحت أجنة الزرد واليرقات تستخدم .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S