A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.

Abstract

الزرد هو كائن نموذجي مثير للاهتمام معروف بقدرته الرائعة على تجديد القلب. تعد دراسة القلب المنقبض في الجسم الحي أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية والوظيفية استجابة للإصابات. ومع ذلك ، فإن الحصول على صور عالية الدقة وعالية السرعة رباعية الأبعاد (4D ، 3D المكانية + 1D الزمانية) لقلب الزرد لتقييم بنية القلب وانقباضه لا يزال يمثل تحديا. في هذا السياق ، يتم استخدام مجهر الصفيحة الضوئية الداخلي (LSM) والتحليل الحسابي المخصص للتغلب على هذه القيود التقنية. هذه الاستراتيجية ، التي تنطوي على بناء نظام LSM ، والتزامن بأثر رجعي ، وتتبع الخلية الواحدة ، والتحليل الموجه للمستخدم ، تمكن المرء من التحقيق في البنية الدقيقة ووظيفة الانقباض عبر القلب بأكمله بدقة الخلية الواحدة في يرقات الزرد Tg (myl7: nucGFP) المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، نحن قادرون على دمج الحقن المجهري لمركبات الجزيئات الصغيرة للحث على إصابة القلب بطريقة دقيقة ومضبوطة. بشكل عام ، يسمح هذا الإطار للمرء بتتبع التغيرات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، بالإضافة إلى الميكانيكا الإقليمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء تكوين القلب وتجديده.

Introduction

الزرد (Danio rerio) هو كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وعلم وظائف الأعضاء والإصلاح بسبب شفافيته البصرية وقابليته للسحب الجيني وقدرته على التجدد1،2،3،4. عند احتشاء عضلة القلب ، بينما تؤثر التغيرات الهيكلية والوظيفية على طرد القلب وديناميكا الدم ، تستمر القيود التقنية في إعاقة القدرة على التحقيق في العملية الديناميكية أثناء تجديد القلب بدقة مكانية زمانية عالية. على سبيل المثال ، طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود من حيث عمق التصوير أو الدقة الزمنية أو السمية الضوئية لالتقاط التغييرات الدي....

Protocol

تم منح الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة تكساس في دالاس ، بموجب البروتوكول رقم # 20-07. Tg(myl7:nucGFP) تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا12 في هذه الدراسة. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.

1. تربية الزرد والحقن المجهري للأجنة

التوقيت: 2 أيام

  1. الحفاظ على وتربية الزرد البالغ من خلال إجراءات الرعاية القياسية والتكاثر. وللاطلاع على الأساليب التفصيلية، يرجى الرجوع إلى ال....

النتائج

يتكون البروتوكول الحالي من ثلاث خطوات رئيسية: إعداد الزرد والحقن المجهري ، والتصوير بالضوء وإعادة بناء الصور 4D ، وتتبع الخلايا وتفاعل الواقع الافتراضي. سمح لأسماك الزرد البالغة بالتزاوج ، وتم جمع البيض المخصب ، وإجراء الحقن المجهري حسب الحاجة للتجارب المقترحة (الشكل 1). تو.......

Discussion

إن دمج نموذج الزرد مع الأساليب الهندسية يحمل إمكانات هائلة لاستكشاف احتشاء عضلة القلب في الجسم الحي ، وعدم انتظام ضربات القلب ، وعيوب القلب الخلقية. من خلال الاستفادة من شفافيتها البصرية وقدرتها على التجدد والتشابهات الجينية والفسيولوجية مع البشر ، أصبحت أجنة الزرد واليرقات تستخدم .......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نعرب عن امتناننا للدكتورة كارولين بيرنز في مستشفى بوسطن للأطفال لمشاركتها بسخاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا. نشكر السيدة إليزابيث إيبانيز على مساعدتها في تربية الزرد في UT Dallas. كما نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RESOURCESOURCE/ReferenceIDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafishBurns Lab in Boston Children's HospitalZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLABThe MathWorks Inc.R2023a
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
PythonThe Python Software Foundation3.9.0
Fiji-ImageJSchneider et al.181.54f
3DeeCellTrackerChentao Wen et al.15v0.5.2
UnityUnity Software Inc.2020.3.2f1
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
3D SlicerAndriy Fedorov et al.175.2.1
ITK SNAPPaul A Yushkevich et al.164
Light-sheet system
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
4X Illumination objectiveNikonMRH00045
20X Detection objectiveOlympus1-U2M585
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Motorized XYZ stageThorlabsPT3/M-Z8
Two-axis tilt stageThorlabsGN2/M
Rotation stepper motorPololu1474
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
473nm DPSS LaserLaserglowR471003GX
532nm DPSS laserLaserglowR531003FX
Microinjector and vacuum pump
MicroinjectorWPIPV850
Vacuum pumpWelch2522B-01
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LT
Capillary tip for gel loadingBio-Rad2239912
Virtual reality hardware
VR headsetMetaQuest 2
30mg/L PTU solution
PTUSigma-AldrichP7629
1X E3 working solution--
1% Agarose--
Low-melt agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
10g/L Tricaine stock solution
TricaineSyndelSYNC-M-GR-US02
Deionized water--
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution--
Deionized water--
60X E3 stock solution
Sodium ChlorideLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at DallasNaCl
Potassium Chloride-KCL
Calcium Chloride Dihydrate-CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate-MgSO4 x 7H2O
RO Water--
1X E3 working solution
60X E3 stock solutionLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas-
RO Water--
1% Methylene Blue (optional) -C16H18ClN3S

References

  1. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  2. Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203 4D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved