A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.
الزرد هو كائن نموذجي مثير للاهتمام معروف بقدرته الرائعة على تجديد القلب. تعد دراسة القلب المنقبض في الجسم الحي أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية والوظيفية استجابة للإصابات. ومع ذلك ، فإن الحصول على صور عالية الدقة وعالية السرعة رباعية الأبعاد (4D ، 3D المكانية + 1D الزمانية) لقلب الزرد لتقييم بنية القلب وانقباضه لا يزال يمثل تحديا. في هذا السياق ، يتم استخدام مجهر الصفيحة الضوئية الداخلي (LSM) والتحليل الحسابي المخصص للتغلب على هذه القيود التقنية. هذه الاستراتيجية ، التي تنطوي على بناء نظام LSM ، والتزامن بأثر رجعي ، وتتبع الخلية الواحدة ، والتحليل الموجه للمستخدم ، تمكن المرء من التحقيق في البنية الدقيقة ووظيفة الانقباض عبر القلب بأكمله بدقة الخلية الواحدة في يرقات الزرد Tg (myl7: nucGFP) المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، نحن قادرون على دمج الحقن المجهري لمركبات الجزيئات الصغيرة للحث على إصابة القلب بطريقة دقيقة ومضبوطة. بشكل عام ، يسمح هذا الإطار للمرء بتتبع التغيرات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، بالإضافة إلى الميكانيكا الإقليمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء تكوين القلب وتجديده.
الزرد (Danio rerio) هو كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وعلم وظائف الأعضاء والإصلاح بسبب شفافيته البصرية وقابليته للسحب الجيني وقدرته على التجدد1،2،3،4. عند احتشاء عضلة القلب ، بينما تؤثر التغيرات الهيكلية والوظيفية على طرد القلب وديناميكا الدم ، تستمر القيود التقنية في إعاقة القدرة على التحقيق في العملية الديناميكية أثناء تجديد القلب بدقة مكانية زمانية عالية. على سبيل المثال ، طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود من حيث عمق التصوير أو الدقة الزمنية أو السمية الضوئية لالتقاط التغييرات الدي....
تم منح الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة تكساس في دالاس ، بموجب البروتوكول رقم # 20-07. Tg(myl7:nucGFP) تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا12 في هذه الدراسة. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.
1. تربية الزرد والحقن المجهري للأجنة
التوقيت: 2 أيام
يتكون البروتوكول الحالي من ثلاث خطوات رئيسية: إعداد الزرد والحقن المجهري ، والتصوير بالضوء وإعادة بناء الصور 4D ، وتتبع الخلايا وتفاعل الواقع الافتراضي. سمح لأسماك الزرد البالغة بالتزاوج ، وتم جمع البيض المخصب ، وإجراء الحقن المجهري حسب الحاجة للتجارب المقترحة (الشكل 1). تو.......
إن دمج نموذج الزرد مع الأساليب الهندسية يحمل إمكانات هائلة لاستكشاف احتشاء عضلة القلب في الجسم الحي ، وعدم انتظام ضربات القلب ، وعيوب القلب الخلقية. من خلال الاستفادة من شفافيتها البصرية وقدرتها على التجدد والتشابهات الجينية والفسيولوجية مع البشر ، أصبحت أجنة الزرد واليرقات تستخدم .......
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
نعرب عن امتناننا للدكتورة كارولين بيرنز في مستشفى بوسطن للأطفال لمشاركتها بسخاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا. نشكر السيدة إليزابيث إيبانيز على مساعدتها في تربية الزرد في UT Dallas. كما نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
Animal models | |||
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
Light-sheet system | |||
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
Microinjector and vacuum pump | |||
Microinjector | WPI | PV850 | |
Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
Virtual reality hardware | |||
VR headset | Meta | Quest 2 | |
30mg/L PTU solution | |||
PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
1X E3 working solution | - | - | |
1% Agarose | - | - | |
Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | - | - | |
10g/L Tricaine stock solution | |||
Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
Deionized water | - | - | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
150mg/L Tricaine working solution | |||
10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
Deionized water | - | - | |
60X E3 stock solution | |||
Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
Potassium Chloride | - | KCL | |
Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
RO Water | - | - | |
1X E3 working solution | |||
60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
RO Water | - | - | |
1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved