제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

요약

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

초록

제브라피시는 놀라운 심장 재생 능력으로 유명한 흥미로운 모델 유기체입니다. 생체 내에서 수축하는 심장을 연구하는 것은 부상에 대한 반응으로 인한 구조적 및 기능적 변화에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 그러나 제브라피시 심장의 고해상도 및 고속 4차원(4D, 3D 공간 + 1D 시간) 이미지를 획득하여 심장 구조와 수축성을 평가하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 맥락에서 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 자체 광시트 현미경(LSM)과 맞춤형 컴퓨터 분석이 사용됩니다. LSM 시스템 구축, 후향적 동기화, 단일 세포 추적 및 사용자 지향 분석을 포함하는 이 전략을 통해 형질전환 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 유충의 단일 세포 분해능에서 전체 심장의 미세 구조 및 수축 기능을 조사할 수 있습니다. 또한 저분자 화합물의 미세 주입을 통합하여 정확하고 제어된 방식으로 심장 손상을 유도할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프레임워크를 통해 생리학적 및 병태생리학적 변화뿐만 아니라 심장 형태 형성 및 재생 중 단일 세포 수준의 지역 역학을 추적할 수 있습니다.

서문

제브라피시(Danio rerio)는 광학적 투명성, 유전적 다루기 쉬움 및 재생 능력 1,2,3,4로 인해 심장 발달, 생리학 및 수리를 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 심근경색 시 구조적, 기능적 변화가 심장 박출과 혈류역학에 영향을 미치지만, 기술적 한계로 인해 높은 시공간 해상도로 심장 재생 중 동적 과정을 조사하는 능력이 계속 방해를 받고 있습니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경과 같은 기존의 이미징 방법은 동적 변화를 포착하고 여러 심장 주기 동안 심장 수축 기능을 평가하기 위한 이미징 깊이, 시간적 해상도 또는 광독성 측면에서 한계가 있다⁵.

광시트 현미경은 심장의 심실과 심방을 가로질러 레이저를 빠르게 스윕하여 향상된 시공간 해상도와 무시할 수 있는 광표백 및 광독성 효과로 상세한 이미지를 달성함으로써 이러한 문제를 성공적으로 해결하는 최첨단 이미징 방법을 나타냅니다 6,7....

프로토콜

이 연구에 대한 승인은 프로토콜 번호 #20-07에 따라 댈러스에 있는 텍사스 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 부여되었습니다. 본 연구에는 Tg(myl7:nucGFP) 형질전환 제브라피시 유충¹² 가 사용되었다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 오픈 소스 소프트웨어 또는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합리적인 요청에 따라 저자로부터 사용할 수 있습니다.

1. 제브라피시 사육 및 배아 미세주입

타이밍 : 2 일

1. 표준 관리 및 번식 절차를 통해 성인 제브라피시를 유지하고 번식시킵니다. 자세한 방법은 이전 보고서¹³을 참조하십시오.
2. 확립된 프로토콜¹⁴에 따라 미세 주입을 수행합니다. 본 연구에서는 1-2 세포(접합체) 단계에서 미세주입을 수행하였다.
   참고: 효과적인 미세 주입을 위해 이 단계를 정확하게 식별하고 발달 일관성을 보장하는 것이 중요합니다. 단세포 단계....

토론

제브라피시 모델과 공학적 방법의 통합은 심근 경색, 부정맥 및 선천성 심장 결함의 생체 내 탐색을 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 광학적 투명성, 재생 능력, 인간과의 유전적 및 생리학적 유사성을 활용하여 제브라피시 배아와 유충은 연구에 광범위하게 활용되고 있습니다 ^1,2,4. 광시트 이미징의 우수한 시공.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S