제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

요약

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

초록

제브라피시는 놀라운 심장 재생 능력으로 유명한 흥미로운 모델 유기체입니다. 생체 내에서 수축하는 심장을 연구하는 것은 부상에 대한 반응으로 인한 구조적 및 기능적 변화에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 그러나 제브라피시 심장의 고해상도 및 고속 4차원(4D, 3D 공간 + 1D 시간) 이미지를 획득하여 심장 구조와 수축성을 평가하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 맥락에서 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 자체 광시트 현미경(LSM)과 맞춤형 컴퓨터 분석이 사용됩니다. LSM 시스템 구축, 후향적 동기화, 단일 세포 추적 및 사용자 지향 분석을 포함하는 이 전략을 통해 형질전환 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 유충의 단일 세포 분해능에서 전체 심장의 미세 구조 및 수축 기능을 조사할 수 있습니다. 또한 저분자 화합물의 미세 주입을 통합하여 정확하고 제어된 방식으로 심장 손상을 유도할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프레임워크를 통해 생리학적 및 병태생리학적 변화뿐만 아니라 심장 형태 형성 및 재생 중 단일 세포 수준의 지역 역학을 추적할 수 있습니다.

서문

제브라피시(Danio rerio)는 광학적 투명성, 유전적 다루기 쉬움 및 재생 능력 1,2,3,4로 인해 심장 발달, 생리학 및 수리를 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 심근경색 시 구조적, 기능적 변화가 심장 박출과 혈류역학에 영향을 미치지만, 기술적 한계로 인해 높은 시공간 해상도로 심장 재생 중 동적 과정을 조사하는 능력이 계속 방해를 받고 있습니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경과 같은 기존의 이미징 방법은 동적 변화를 포착하고 여러 심장 주기 동안 심장 수축 기능을 평가하기 위한 이미징 깊이, 시간적 해상도 또는 광독성 측면에서 한계가 있다⁵.

광시트 현미경은 심장의 심실과 심방을 가로질러 레이저를 빠르게 스윕하여 향상된 시공간 해상도와 무시할 수 있는 광표백 및 광독성 효과로 상세한 이미지를 달성함으로써 이러한 문제를 성공적으로 해결하는 최첨단 이미징 방법을 나타냅니다 6,7,8,9,10,11.

이 프로토콜은 LSM 시스템 구축, 4D 이미지 재구성, 3D 세포 추적 및 대화형 분석을 포함하는 포괄적인 이미징 전략을 도입하여 여러 심장 주기 동안 심장 전체에 걸쳐 심근세포의 역학을 캡처하고 분석합니다¹². 맞춤형 이미징 시스템과 계산 방법론을 통해 형질전환 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 유충의 단일 세포 수준에서 심근 미세 구조 및 수축 기능을 추적할 수 있습니다. 또한, 약물 유발 심장 손상 및 후속 재생을 평가하기 위해 미세 주입을 사용하여 저분자 화합물을 배아에 전달했습니다. 이 전체론적 전략은 심장 발달 및 재생 중 단세포 수준에서 심근의 구조적, 기능적, 기계적 특성을 생체 내에서 조사할 수 있는 진입점을 제공합니다.

프로토콜

이 연구에 대한 승인은 프로토콜 번호 #20-07에 따라 댈러스에 있는 텍사스 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 부여되었습니다. 본 연구에는 Tg(myl7:nucGFP) 형질전환 제브라피시 유충¹² 가 사용되었다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 오픈 소스 소프트웨어 또는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합리적인 요청에 따라 저자로부터 사용할 수 있습니다.

1. 제브라피시 사육 및 배아 미세주입

타이밍 : 2 일

1. 표준 관리 및 번식 절차를 통해 성인 제브라피시를 유지하고 번식시킵니다. 자세한 방법은 이전 보고서¹³을 참조하십시오.
2. 확립된 프로토콜¹⁴에 따라 미세 주입을 수행합니다. 본 연구에서는 1-2 세포(접합체) 단계에서 미세주입을 수행하였다.
   참고: 효과적인 미세 주입을 위해 이 단계를 정확하게 식별하고 발달 일관성을 보장하는 것이 중요합니다. 단세포 단계에서는 노른자 위에 작은 돔이 형성되며 이 단계는 일반적으로 약 12분 동안 지속됩니다. 2세포 단계로 진행되면, 인접한 두 개의 돔이 보이고, 이 단계는 수정 후 약 45분 동안 지속된다¹⁵. 시스템 구축에 대한 보다 상세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 12,16,17에서 찾을 수 있다.

2. 제브라피시 배아/유충 준비 및 장착

타이밍 : 7 일

1. 색소 형성을 방지하기 위해 수정 후 1일(dpf)에 배아를 0.2mM 1-Phenyl-2-thiourea(PTU)( 재료 표 참조)가 있는 E3 물로 옮깁니다.
2. LSM 이미징이 이루어질 때까지 매일 PTU가 있는 깨끗한 E3 물로 배지를 교체합니다.
3. 실체 현미경으로 배아 또는 유충을 이미지화하여 0에서 7dpf 사이의 원하는 시점에서 발달을 기록합니다.
4. LSM 시스템¹² 아래에 제브라피시 유충을 매립하기 위해 내경이 2mm인 분할된 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜브를 준비합니다.
   알림: FEP 튜브는 물과 같은 주변 매체와 매우 유사한 굴절률 일치 물질로 샘플을 고정하는 데 사용됩니다.
5. 3dpf에서 시작하여 물고기를 150mg/L 트리케인(MS-222) 용액( 재료 표 참조)으로 옮겨 이미징 전에 물고기를 고정시킵니다.
6. 150mg/L 트리카인으로 0.8% 저융점 아가로스를 준비하고 실온으로 냉각된 후 이송 피펫을 사용하여 마취된 물고기를 아가로스로 옮깁니다¹⁸.
7. 다른 이송 피펫을 사용하여 FEP 튜브에 아가로스가 있는 물고기를 장착합니다(그림 1).
   참고: 발달 중인 배아의 최소 스트레스를 확인하기 위해 심박수와 같은 심장 활동에 대한 고정 전후 검사를 현미경 관찰 하에 수행했습니다. 이러한 평가는 트리케인 마취 전과 후의 유의미한 차이를 확인하는 것을 목표로 했습니다. 부종과 같은 심장 구조의 불규칙성에 대한 피부와 근육계의 추가 검사도 고정 후 수행할 수 있습니다. 트리카인의 농도는 심장 영상에서도 중요한 역할을 하므^로19 150mg/L 농도의 트리카인 용액은 이 프로젝트에서 제브라피시 유충의 수축 이미징에 활용되었습니다. 현재의 후향적 동기화를 통해 불규칙한 심장 박동을 해결할 수 있지만(²⁰), 제브라피쉬의 심장 부정맥 및 장기 이미징의 4D 이미징을 위한 포괄적인 솔루션은 아직 개발 중입니다.

3. 라이트 시트 이미징 시스템 설정 및 구성

타이밍 : 3-14 일

1. 473nm 및 532nm와 같은 특정 파장에서 연속파 다이오드 펌핑 고체(DPSS) 레이저 시스템을 광원으로 사용하여 원통형 렌즈를 기반으로 하는 사내 LSM 시스템을 구축합니다(그림 2A).
2. 이미지 시퀀스를 캡처하기 위해 병진 샘플 스테이지, 광시트 조명 및 sCMOS 카메라 노출의 동기화를 위해 LabVIEW ( 재료 표 참조) 컨트롤 코드를 사용자 정의하십시오.
   참고: 시스템 구성에 대한 자세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 12,16,17에서 찾을 수 있습니다. 우리는 연구 그룹이 시스템 구축 중에 광학 이미징에 대한 확립된 전문 지식을 보유한 실험실과 협력할 기회를 모색할 것을 권장합니다.

4. 제브라피시 이미징 준비 및 데이터 수집

타이밍 : 1 일

1. LSM 시스템 공간 분해능을 보정하고 형광 비드를 측정하여 다양한 깊이에서 불투명도 변화를 최소화합니다.
   1. 먼저, 0.8% 저융점 아가로스를 이용하여 직경 0.53μm의 형광 비드(재료 표 참조)를 1:1.5 x 10-5의 농도로 희석하고, 용액을 분할된 FEP 튜브로 옮긴다.
   2. 둘째, LSM 시스템을 사용하여 비드를 이미지화하고 전체 샘플에 걸쳐 점 확산 함수(PSF)를 측정하여 공간 분해능 및 시스템 정렬¹²을 검증합니다.
      참고: 이 시스템에서 FWHM(Full Width at Half Maximum)에 대한 대표 결과 분석은 각각 1.26 ± 0.15 및 2.48 ± 0.15 μm(n = 60 비드)의 측면 및 축 분해능을 나타냅니다. 이는 이미징 깊이 전체에 걸쳐 일관된 공간 해상도를 시사합니다.
2. 제브라피시 유충이 장착된 FEP 튜브를 6축(x, y, z, 피치, 요 및 롤) 전동 샘플 스테이지에 단단히 부착하고 튜브를 E3 물로 채워진 샘플 챔버에 담그십시오. 난황낭에 의한 빛의 산란을 피하고 심장의 위치를 더 잘 찾으려면 제브라피시 유충을 회전시켜 복부 쪽에서 이미지를 촬영합니다(그림 2B). 이 경우 캡처된 대부분의 이미지에는 심실과 심방이 모두 포함됩니다(그림 2C).
   참고: 현재 이미징 절차는 일반적으로 물고기당 1시간 미만으로 지속되고 통제된 실내 온도 환경에서 수행되었다는 점을 감안할 때 챔버 온도 제어 및 산소 수준 조절은 이 프로젝트에서 선택 사항으로 간주됩니다. 그러나 장기간의 타임 랩스 이미징 연구, 특히 발달 과정에 초점을 맞춘 연구의 경우 제브라피쉬의 생리학적 환경을 보장하고 잠재적인 발달 이상을 방지하기 위해 샘플 챔버 내에서 27°C에서 지속적으로 온도를 모니터링하고 조절하는 것이 좋습니다.
3. 전동식 샘플 스테이지를 워크스테이션에 연결하고 원하는 이동 모드를 포함하여 필요한 모든 매개변수를 구성합니다.
4. sCMOS 카메라와 워크스테이션 간의 연결을 설정합니다. 5ms의 노출 시간 및 원하는 관심 영역과 같은 모든 필수 설정을 조정합니다.
5. 맞춤 설정된 LabVIEW 컨트롤 프로그램 내에서 이미지 시퀀스 및 프레임 수를 설정합니다.
6. 레이저의 전원을 켜고 샘플의 LSM 이미징을 시작합니다. 모든 이미지 시퀀스가 성공적으로 기록될 때까지 프로세스를 유지합니다.
7. 300프레임을 2D 이미지 시퀀스로 기록하여 200프레임/초의 프레임 속도로 유충의 3-5회 심장 주기를 다룹니다. 기록은 라이트 시트에 의해 조명되는 선택면에서 심장 수축을 포착합니다.
8. 광시트 조명을 가로질러 1μm의 단계 크기로 유충을 이동하여 샘플을 가상으로 절단합니다.
   참고: 샘플 스테이지의 단계 크기는 Nyquist-Shannon 샘플링 정리¹²에 따라 광시트 시스템의 축 분해능을 기반으로 설정해야 합니다.
9. 7단계를 반복하여 심장 전체가 덮일 때까지 새 샘플 슬라이스의 다른 이미지 시퀀스를 기록합니다. 일반적으로 1μm의 단계 크기를 가진 100-200개의 이미지 시퀀스는 제브라피시 유충의 전체 심장을 커버합니다(그림 2D).
   참고 : 4.7-4.9 단계는 LabVIEW 프로그램에 의해 제어되며 LSM 시스템에 의해 자동으로 수행됩니다 (그림 3). 생성되는 이미지 데이터의 방대한 양을 감안할 때 이미지 시퀀스에 표준화된 명명 규칙을 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, "z-1", "z-2" 등과 같은 이름의 폴더를 지정하여 다양한 이미지 시퀀스에서 데이터를 분류할 수 있습니다. 각 시퀀스 내에서 이미지의 이름은 고유한 시점을 나타내기 위해 순차적으로(예: "1", "2" 등) 지정되어야 합니다. 물고기를 장착하고, 이미징 각도를 조정하고, 제브라피시 유충 한 마리에 대한 모든 데이터를 수집하는 데 걸리는 총 시간은 약 1시간입니다.

5. 병렬 계산을 통한 4D 이미지 재구성

타이밍 : 1 일
참고: 우리 그룹에서 개발한 4D 재구성 알고리즘과 샘플 데이터는 공개적으로 액세스할 수 있습니다²¹. 이 방법을 사용하면 이전 단계에서 수집된 이미지 시퀀스에서 4D 심장 이미지를 재구성할 수 있습니다(표 1).

1. MATLAB에서 파일 test_Parallel.m을 엽니다(재료 목차 참조). 원시 이미지 시퀀스가 저장되는 폴더 위치를 변수 "baseDir"에 지정합니다.
2. 변수 "numOfSlice"에 총 이미지 시퀀스 수(일반적으로 100-150)를 할당하고 변수 "numOfImage"에 각 시퀀스의 이미지 수(일반적으로 300-500)를 할당합니다.
3. 제브라피시 심장의 중간 평면을 보여주는 이미지 시퀀스를 검사합니다(예: 총 101개의 시퀀스 중 51^번째 시퀀스). 이 시퀀스에서 첫 번째 수축기와 네 번째 수축기의 프레임 번호를 식별하고 변수 systolicPoint_1st 와 systolicPoint_4th에 할당합니다.
4. 실행을 클릭하여 프로세스를 시작합니다.
   참고: 각 이미지 시퀀스의 심장 주기 길이는 먼저 MATLAB 프로그램에서 서로 다른 시점의 이미지 간 유사성(차이의 제곱합) 비교를 통해 식별됩니다. 이어서, 심장 주기는 모든 이미지 시퀀스로부터의 주기 길이의 평균을 사용하여 추정될 것이다. 다음으로, 서로 다른 축 위치에 있는 이미지 시퀀스의 시작점은 첫 번째 이미지 시퀀스에서 마지막 이미지 시퀀스까지의 이미지 유사성의 반복적인 비교를 통해 프로그램에 의해 정렬됩니다.
5. 출력 폴더에서 결과를 확인합니다. 프로그램은 이미지를 타임스탬프가 있는 ".tif" 파일로 저장합니다. 각 ".tif" 파일은 특정 시점의 3D 하트 이미지입니다. 두 3D 이미지 사이의 시간 간격은 설정된 노출 시간과 같습니다.
   참고: 이전 단계에서 획득한 이미지를 재구성하여 4D(3D 공간 + 1D 측두) 심장 수축을 묘사합니다. 후향적 동기화 중에 고처리량 조사에 대한 숙련도를 높이기 위해 이 접근 방식은 MATLAB 병렬 연산 툴박스를 통해 여러 CPU 코어를 활용하고 영상을 gpuArray 형식으로 변환하여 GPU에서 동시 계산 연산을 가능하게 합니다.

6. 3D 세포 분할 및 세포 추적

타이밍 : 1 일

1. 3DeeCellTracker 패키지( 자료 표 참조)를 다운로드하고 Python 환경^{설정 22}.
2. ITK-SNAP 주석 소프트웨어²³ ( 재료 표 참조)을 다운로드하고 이를 사용하여 심실 이완기와 심실 수축기에서 각각 하나씩 선택한 두 시점의 3D 심장 이미지에 수동으로 라벨을 지정하여 훈련 및 검증 데이터 세트를 생성합니다.
   알림: 다른 라벨링 소프트웨어도 적용할 수 있습니다.
3. Python에서 3DeeCellTracker 훈련 프로그램을 실행하고 TrainingUNet3D 함수에서 noise_level(이 경우 100), folder_path 및 모델 매개변수를 초기화하여 미리 정의된 3D U-Net 모델을 설정합니다.
4. MATLAB에서 imageDimConverter.m 프로그램을 사용하여 훈련 데이터셋과 검증 데이터셋을 불러오기에 적합한 형식으로 변환하고 이름을 바꿉니다.
5. Python에서 trainer.load_dataset() 및 trainer.draw_dataset() 함수를 사용하여 학습 및 유효성 검사 데이터 세트를 로드합니다.
6. Python에서 3DeeCellTracker 추적 프로그램의 첫 번째 부분을 실행하고 매개변수를 초기화합니다.
   참고: 여기에는 이미지 크기를 특성화하기 위한 이미지 파라미터 정의, 셀 분할에 적용되는 기계 학습 모델을 선택하기 위한 분할 파라미터, 셀 정합에 사용되는 사전 훈련된 심층 신경망 모델을 선택하기 위한 추적 파라미터 정의가 포함됩니다. 처음 사용하는 경우 세포 분할을 위해 U-Net 모델을 사용하고 세포 정합을 위해 FFN+ PR-GLS를 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계에서 자동으로 생성될 폴더에 데이터, 모델 및 결과를 저장해야 합니다.
7. MATLAB에서 imageDimConverter.m 프로그램을 사용하여 모든 3차원 하트 영상을 적절한 형식으로 변환하고 이름을 바꾼 다음 마지막 단계에서 만든 데이터 폴더로 전송합니다.
8. Python에서 3DeeCellTracker 프로그램의 두 번째 부분을 실행하여 세그멘테이션을 시작합니다.
9. 첫 번째 3D 이미지가 분할되면 분할 결과를 원시 이미지와 비교하고 잘못된 분할이 발견되면 수동 수정을 수행합니다. 수정된 세그멘테이션을 생성된 "/manual_vol1" 폴더로 이동합니다.
10. Python에서 3DeeCellTracker 프로그램의 세 번째 부분을 실행하여 모든 이미지를 분할합니다.
11. Amira( 재료 목차 참조)를 사용하여 추적된 셀의 위치를 해당 원시 이미지와 비교하여 추적 결과에 대한 시각적 평가를 수행합니다. 테스트 결과가 만족스럽지 않은 경우 6.6단계부터 절차를 다시 시작하고 분할 또는 셀 정합을 위해 대체 기계 학습 모델을 사용한 다음 추적 프로세스를 다시 시작합니다.
    참고: 분할 후 셀 레이블의 데이터는 기본적으로 8비트 이미지(0-255)로 저장되며, 이는 셀 분류를 위한 레이블로 256개의 스케일만 제공됨을 의미합니다. 추가 클래스가 필요한 경우 이 문제를 해결하기 위한 두 가지 솔루션이 있습니다. 한 가지 해결책은 추적 프로그램에서 셀 레이블의 데이터 형식을 16비트 이미지로 설정하는 것인데, 이 경우 처리 시간이 기하급수적으로 증가하여 현재 2일 이상 소요됩니다. 다른 해결책은 "separateTrackingResults.py" 프로그램을 사용하여 셀 레이블을 사후 처리하는 것인데, 이 프로그램은 물리적 위치에 따라 동일한 레이블을 가진 셀을 분리하고 각 셀에 다른 레이블을 할당합니다. 이 경우 이 프로세스는 약 10분이 소요됩니다.

7. 가상 현실 모드에서 심장 수축도 분석

타이밍 : 1 일

1. 이전 단계에서 세포 추적 결과를 얻습니다.
2. 수동으로 데이터를 검증하고 모든 볼륨에서 일관된 이미지 강도를 가진 셀을 선택합니다(약 600개 셀 중 약 500개 셀).
3. cellLabelsToObj.ipynb 스크립트(²¹)를 이용하여, 3D 슬라이서 소프트웨어(²⁴)(재료 표 참조)를 통해 각각의 개별 셀에 대한 표면 메쉬를 생성하고, 각 셀에 고유한 색상 코드를 할당한다.
4. 단일 시점의 모든 셀로 구성된 각 3D 모델을 셀 레이블을 설명하는 .mtl 파일과 함께 여러 하위 오브젝트로 구성된 단일 .obj 파일로 내보냅니다.
5. 확장 현실에 사용되는 개발 엔진인 교육용 라이선스를 사용하여 모델을 Unity로 임포트합니다.
6. C#으로 작성된 함수로 구성된 사용자 지정 스크립트를 모델 및 사용자 인터페이스 요소에 적용하여 4D 시각화 및 대화형 분석을 가능하게 합니다. 7.7단계에 따라 VR 상호 작용을 수행합니다.
7. 다음 기능을 사용하여 가상 현실(VR)에서 모델과 상호 작용합니다(그림 4).
   1. 셀 선택: 한 번에 최대 두 개의 셀을 선택하고 궤적, 속도, 부피, 표면적 및 상대 거리를 봅니다.
   2. 시점 선택: 데이터에서 특정 시점을 선택하여 선택한 세포의 출력을 분석합니다(예: 이완기 중 t = 0ms 또는 수축기 중 t = 200ms).
   3. 시간 일시 중지: 동적 모델을 고정하여 선택한 셀과 해당 출력에 초점을 맞춥니다.
   4. 대비: 모델에서 선택한 셀과 주변 셀 사이의 대비를 조절합니다.

결과

현재 프로토콜은 제브라피시 준비 및 미세 주입, 광시트 이미징 및 4D 이미지 재구성, 세포 추적 및 VR 상호 작용의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 다 자란 제브라피시를 짝짓기로 하고, 수정란을 채취하고, 제안된 실험에 필요한 대로 미세주입을 수행했습니다(그림 1). 이 단계는 심장 발달 및 재생 연구에서 제브라피시 응용 분야를 탐색하기 위한 진입점을 제공하며, 후속 ...

토론

제브라피시 모델과 공학적 방법의 통합은 심근 경색, 부정맥 및 선천성 심장 결함의 생체 내 탐색을 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 광학적 투명성, 재생 능력, 인간과의 유전적 및 생리학적 유사성을 활용하여 제브라피시 배아와 유충은 연구에 광범위하게 활용되고 있습니다 ^1,2,4. 광시트 이미징의 우수한 시공...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S