Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Resumen

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Resumen

El pez cebra es un organismo modelo intrigante conocido por su notable capacidad de regeneración cardíaca. El estudio de la contracción del corazón in vivo es esencial para obtener información sobre los cambios estructurales y funcionales en respuesta a las lesiones. Sin embargo, la obtención de imágenes de alta resolución y alta velocidad en 4 dimensiones (4D, 3D espacial + 1D temporal) del corazón del pez cebra para evaluar la arquitectura cardíaca y la contractilidad sigue siendo un desafío. En este contexto, se utiliza un microscopio de lámina de luz (LSM) interno y un análisis computacional personalizado para superar estas limitaciones técnicas. Esta estrategia, que implica la construcción del sistema LSM, la sincronización retrospectiva, el seguimiento de una sola célula y el análisis dirigido por el usuario, permite investigar la microestructura y la función contráctil en todo el corazón a la resolución de una sola célula en las larvas de pez cebra transgénicas Tg (myl7: nucGFP ). Además, somos capaces de incorporar aún más la microinyección de compuestos de moléculas pequeñas para inducir lesiones cardíacas de forma precisa y controlada. En general, este marco permite rastrear los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, así como la mecánica regional a nivel de una sola célula durante la morfogénesis y la regeneración cardíacas.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo, la fisiología y la reparación cardíaca debido a su transparencia óptica, trazabilidad genética y capacidad regenerativa 1,2,3,4. En el caso del infarto de miocardio, si bien los cambios estructurales y funcionales impactan la eyección cardíaca y la hemodinámica, las limitaciones técnicas continúan dificultando la capacidad de investigar el proceso dinámico durante la regeneración cardíaca con la alta resolución espacio-temporal. Por ejemplo, los métodos convencionales de imagen, como la microscopía confocal, tienen limitaciones en cuanto a la profundidad de la imagen, la resolución temporal o la fototoxicidad para capturar los cambios dinámicos y evaluar la función contráctil cardíaca durante múltiples ciclos cardíacos⁵.

La microscopía de lámina de luz representa un método de imagen de última generación que aborda con éxito estos problemas al barrer rápidamente el láser a través del ventrículo y la aurícula del corazón, logrando imágenes detalladas con una resolución espacio-temporal mejorada y efectos foto-blanqueadores y fototóxicos insignificantes 6,7,8,9,10,11.

Este protocolo introduce una estrategia integral de imágenes que incluye la construcción del sistema LSM, la reconstrucción de imágenes 4D, el seguimiento celular en 3D y el análisis interactivo para capturar y analizar la dinámica de los cardiomiocitos en todo el corazón durante múltiples ciclos cardíacos¹². El sistema de imágenes personalizado y la metodología computacional permiten rastrear la microestructura miocárdica y la función contráctil a nivel de una sola célula en larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP). Además, se administraron compuestos de moléculas pequeñas en los embriones mediante microinyecciones para evaluar la lesión cardíaca inducida por fármacos y la posterior regeneración. Esta estrategia holística proporciona un punto de entrada para investigar in vivo las propiedades estructurales, funcionales y mecánicas del miocardio a nivel de una sola célula durante el desarrollo y la regeneración cardíaca.

Protocolo

La aprobación de este estudio fue otorgada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas en Dallas, bajo el número de protocolo #20-07. Para el presente estudio se utilizaron larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP) ¹². Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.

1. Cría de pez cebra y microinyección de embriones

Duración: 2 días

1. Mantener y criar peces cebra adultos a través de procedimientos estándar de cuidado y cría. Para conocer los métodos detallados, véase el informe anterior¹³.
2. Realizar la microinyección siguiendo el protocolo establecido¹⁴. Para el presente estudio, la microinyección se realizó en la etapa 1-2 de células (cigoto).
   NOTA: Es crucial identificar con precisión esta etapa para una microinyección efectiva y garantizar la consistencia del desarrollo. Durante la etapa de una célula, se forma una pequeña cúpula en la parte superior de la yema, y esta etapa suele durar aproximadamente 12 minutos. Al progresar a la etapa de dos células, dos cúpulas adyacentes se hacen visibles, y esta etapa dura durante aproximadamente 45 minutos después de la fertilización¹⁵. Se puede encontrar información más detallada sobre la construcción del sistema en otros informes o protocolos 12,16,17.

2. Preparación y montaje de embriones/larvas de pez cebra

Duración: 7 días

1. Transfiera los embriones 1 día después de la fertilización (dpf) a agua E3 con 0,2 mM de 1-fenil-2-tiourea (PTU) (ver Tabla de materiales) para evitar la formación de pigmento.
2. Reemplace el medio con agua fresca E3 con PTU todos los días hasta la obtención de imágenes LSM.
3. Tome imágenes de embriones o larvas con el microscopio estereoscópico para registrar su desarrollo en los puntos de tiempo deseados entre 0 y 7 dpf.
4. Preparar tubos segmentados de etileno propileno fluorado (FEP) con un diámetro interior de 2 mm para incluir larvas de pez cebra bajo el sistema LSM¹².
   NOTA: El tubo FEP se utiliza para asegurar la muestra con materiales que coincidan con el índice de refracción y que se parezcan mucho al medio circundante, como el agua.
5. A partir de 3 dpf, transfiera los peces a una solución de 150 mg/L de tricaína (MS-222) (consulte la Tabla de materiales) para inmovilizar a los peces antes de la toma de imágenes.
6. Preparar agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % con 150 mg/L de tricaína y utilizar una pipeta de transferencia para trasladar el pescado anestesiado a la agarosa una vez que se haya enfriado a temperatura ambiente¹⁸.
7. Utilice otra pipeta de transferencia para montar los peces con agarosa en tubos FEP (Figura 1).
   NOTA: Para determinar el estrés mínimo en los embriones en desarrollo, se realizaron exámenes de la actividad cardíaca antes y después de la fijación, como la frecuencia cardíaca, bajo observación microscópica. Estas evaluaciones tuvieron como objetivo identificar cualquier diferencia significativa antes y después de la anestesia con tricaína. También se podría realizar un examen adicional de la piel y la musculatura para detectar irregularidades en la estructura cardíaca, como edema, después de la fijación. La concentración de tricaína también juega un papel crucial en la obtención de imágenes cardíacas¹⁹ y, por lo tanto, la solución de tricaína de concentración de 150 mg/L se utilizó para la obtención de imágenes de la contracción en larvas de pez cebra en este proyecto. Si bien la sincronización retrospectiva actual nos permite abordar los latidos cardíacos irregulares²⁰, aún se está desarrollando una solución integral para la obtención de imágenes 4D de arritmias cardíacas y la obtención de imágenes a largo plazo en el pez cebra.

3. Configuración y configuración del sistema de imágenes de hoja de luz

Tiempo: 3-14 días

1. Construya un sistema LSM interno basado en una lente cilíndrica utilizando sistemas láser de estado sólido bombeados por diodos de onda continua (DPSS) en longitudes de onda específicas, como 473 nm y 532 nm, como fuentes de iluminación (Figura 2A).
2. Personalice los códigos de control de LabVIEW (ver Tabla de Materiales) para la sincronización de la etapa de muestra traslacional, la iluminación de la hoja de luz y la exposición de la cámara sCMOS para capturar secuencias de imágenes.
   NOTA: Se puede encontrar información más detallada de la construcción del sistema en otros informes o protocolos 12,16,17. Alentamos a los grupos de investigación a buscar oportunidades de colaboración con laboratorios que posean experiencia establecida en imágenes ópticas durante la construcción del sistema.

4. Preparación de imágenes de pez cebra y recopilación de datos

Duración: 1 día

1. Calibra la resolución espacial del sistema LSM y minimiza la variación de la opacidad a diferentes profundidades midiendo las perlas de fluorescencia.
   1. En primer lugar, diluir las perlas fluorescentes (véase la tabla de materiales) que tengan un diámetro de 0,53 μm a una concentración de 1:1,5 x 10⁵ utilizando agarosa de bajo punto de fusión al 0,8 % y transferir la solución al tubo de FEP segmentado.
   2. En segundo lugar, utilice el sistema LSM para obtener imágenes de las cuentas y medir la función de dispersión de puntos (PSF) en toda la muestra, validando la resolución espacial y la alineación del sistema¹².
      NOTA: En este sistema, el análisis de los resultados representativos para todo el ancho a la mitad del máximo (FWHM) indica resoluciones laterales y axiales de 1,26 ± 0,15 y 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 cuentas), respectivamente. Esto sugiere una resolución espacial consistente en toda la profundidad de la imagen.
2. Fije el tubo FEP con la larva de pez cebra montada de forma segura a la etapa de muestra motorizada de 6 ejes (x, y, z, cabeceo, guiñada y balanceo) y sumerja los tubos en la cámara de muestra llena de agua E3. Para evitar la dispersión de la luz por el saco vitelino y ubicar mejor la posición del corazón, gire la larva de pez cebra para tomar la imagen desde el lado ventral (Figura 2B). En este caso, la mayoría de las imágenes capturadas incluirían tanto el ventrículo como la aurícula (Figura 2C).
   NOTA: Dado que los procedimientos actuales de obtención de imágenes suelen durar menos de una hora por pez y se realizan en un entorno de temperatura ambiente controlada, el control de la temperatura de la cámara y la regulación del nivel de oxígeno se consideran opcionales para este proyecto. Sin embargo, para los estudios de imágenes time-lapse a largo plazo, en particular los centrados en los procesos de desarrollo, se sugiere un control continuo de la temperatura y una regulación a 27 °C dentro de la cámara de muestras para garantizar el entorno fisiológico del pez cebra y prevenir cualquier posible anomalía del desarrollo.
3. Conecte la platina de muestra motorizada a la estación de trabajo y configure todos los parámetros necesarios, incluido el modo de movimiento deseado.
4. Establezca una conexión entre la cámara sCMOS y la estación de trabajo. Ajuste todos los ajustes esenciales, como un tiempo de exposición de 5 ms y la región de interés deseada.
5. Configure el número de secuencias de imágenes y fotogramas dentro del programa de control personalizado de LabVIEW.
6. Encienda el láser e inicie la obtención de imágenes LSM de la muestra. Mantenga el proceso hasta que todas las secuencias de imágenes se hayan grabado correctamente.
7. Grabe 300 fotogramas como una secuencia de imágenes 2D para cubrir de 3 a 5 ciclos cardíacos de la larva con una velocidad de fotogramas de 200 fotogramas por segundo. El registro capta la contractilidad cardíaca en el plano selectivo iluminado por la lámina de luz.
8. Mueva la larva con un tamaño de paso de 1 μm a través de la iluminación de la lámina de luz para cortar virtualmente la muestra.
   NOTA: El tamaño del paso de la etapa de muestra debe establecerse en función de la resolución axial del sistema de lámina de luz, siguiendo el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon¹².
9. Repita el paso 7 para grabar otra secuencia de imágenes del nuevo corte de muestra hasta que se cubra todo el corazón. Generalmente, 100-200 secuencias de imágenes con un tamaño de paso de 1 μm aseguran la cobertura de todo el corazón de una larva de pez cebra (Figura 2D).
   NOTA: Los pasos 4.7-4.9 son controlados por el programa LabVIEW y realizados automáticamente por el sistema LSM (Figura 3). Dado el gran volumen de datos de imagen generados, se recomienda una convención de nomenclatura estandarizada para las secuencias de imágenes. Por ejemplo, designe carpetas con nombres como "z-1", "z-2", etc., para clasificar los datos en varias secuencias de imágenes. Dentro de cada secuencia, las imágenes deben nombrarse secuencialmente (por ejemplo, "1", "2", ...) para denotar distintos puntos de tiempo. El tiempo total para montar los peces, ajustar el ángulo de imagen y recopilar todos los datos de una larva de pez cebra es de alrededor de 1 h.

5. Reconstrucción de imágenes 4D con cálculo paralelo

Duración: 1 día
NOTA: El algoritmo de reconstrucción 4D desarrollado por nuestro grupo y los datos de muestra son de acceso público²¹. Este método permite reconstruir la imagen del corazón 4D a partir de las secuencias de imágenes recogidas en los pasos anteriores (Tabla 1).

1. Abra el archivo test_Parallel.m en MATLAB (consulte Tabla de materiales). Especifique la ubicación de la carpeta donde se almacenan las secuencias de imágenes sin procesar en la variable "baseDir".
2. Asigne la variable "numOfSlice" con el número total de secuencias de imágenes (normalmente 100-150) y la variable "numOfImage" con el número de imágenes (normalmente 300-500) en cada secuencia.
3. Inspeccione la secuencia de imágenes que muestra el plano medio del corazón del pez cebra (por ejemplo,^{la secuencia} 51 de un total de 101). Identifique los números de trama de la primera y cuarta sístoles de esta secuencia y asígnelos a las variables systolicPoint_1st y systolicPoint_4th.
4. Haga clic en Ejecutar para iniciar el proceso.
   NOTA: La duración del ciclo cardíaco en cada secuencia de imágenes se identificará primero mediante el programa MATLAB mediante una comparación de la similitud (suma de diferencias al cuadrado) entre imágenes en diferentes puntos temporales. Posteriormente, se estimará el ciclo cardíaco utilizando el promedio de las duraciones de los ciclos de todas las secuencias de imágenes. A continuación, el programa alineará los puntos de inicio de las secuencias de imágenes en diferentes ubicaciones axiales a través de una comparación iterativa de la similitud de la imagen desde la primera secuencia de imágenes hasta la última secuencia de imágenes.
5. Compruebe los resultados en la carpeta de salida. El programa guardará las imágenes como archivos ".tif" con marcas de tiempo. Cada archivo ".tif" es una imagen de corazón en 3D en un punto de tiempo específico. El intervalo de tiempo entre dos imágenes 3D es igual al tiempo de exposición establecido.
   NOTA: Reconstruya las imágenes adquiridas de los pasos anteriores para representar las contracciones cardíacas 4D (3D espacial + 1D temporal). Para mejorar la competencia en las investigaciones de alto rendimiento durante la sincronización retrospectiva, este enfoque permite operaciones computacionales simultáneas en una GPU aprovechando varios núcleos de CPU a través de la caja de herramientas de computación paralela de MATLAB y transformando las imágenes al formato gpuArray.

6. 3D segmentación celular y seguimiento celular

Duración: 1 día

1. Descargue el paquete 3DeeCellTracker (consulte la Tabla de materiales) y configure el entorno de Python²².
2. Descargue el software de anotación ITK-SNAP²³ (ver Tabla de materiales) y utilícelo para etiquetar manualmente la imagen 3D del corazón en dos puntos de tiempo seleccionados, uno en la diástole ventricular y el otro en la sístole ventricular, para crear los conjuntos de datos de entrenamiento y validación.
   NOTA: También puede aplicarse otro software de etiquetado.
3. En Python, ejecute el programa de entrenamiento 3DeeCellTracker e inicialice los parámetros noise_level(100 en este caso), folder_path y modelo en la función TrainingUNet3D para establecer el modelo U-Net 3D predefinido.
4. En MATLAB, utilice el programa imageDimConverter.m para convertir y cambiar el nombre del conjunto de datos de entrenamiento y validación al formato adecuado para su carga.
5. En Python, cargue los conjuntos de datos de entrenamiento y validación mediante las funciones trainer.load_dataset() y trainer.draw_dataset().
6. En Python, ejecute la primera parte del programa de seguimiento 3DeeCellTracker e inicialice los parámetros.
   NOTA: Esto incluye la definición de parámetros de imagen para caracterizar las dimensiones de la imagen, los parámetros de segmentación para seleccionar el modelo de aprendizaje automático aplicado para la segmentación de células y los parámetros de seguimiento para seleccionar los modelos de redes neuronales profundas previamente entrenados empleados para el registro de células. Para su uso por primera vez, se recomienda emplear el modelo U-Net para la segmentación celular y FFN+ PR-GLS para el registro celular. Es necesario almacenar los datos, el modelo y los resultados en carpetas que se crearán automáticamente en este paso.
7. En MATLAB, utilice el programa imageDimConverter.m para convertir y cambiar el nombre de todas las imágenes de corazón 3D al formato adecuado y transferirlas a la carpeta de datos creada en el último paso.
8. En Python, ejecute la segunda parte del programa 3DeeCellTracker para iniciar la segmentación.
9. Una vez segmentada la primera imagen 3D, compare el resultado de la segmentación con la imagen RAW y realice una corrección manual si se encuentra alguna segmentación incorrecta. Mueva la segmentación corregida a la carpeta "/manual_vol1" creada.
10. En Python, ejecute la tercera parte del programa 3DeeCellTracker para segmentar todas las imágenes.
11. Utilice Amira (consulte la Tabla de materiales) para realizar una evaluación visual de los resultados del seguimiento comparando las posiciones de las celdas rastreadas con sus correspondientes imágenes sin procesar. Si los resultados de las pruebas no son satisfactorios, vuelva a iniciar el procedimiento desde el paso 6.6, emplee un modelo de aprendizaje automático alternativo para la segmentación o el registro de celdas y, a continuación, vuelva a iniciar el proceso de seguimiento.
    NOTA: Después de la segmentación, los datos de las etiquetas de celda se almacenan como una imagen de 8 bits (0 a 255) de forma predeterminada, lo que significa que solo se proporcionan 256 escalas como etiquetas para la clasificación de celdas. Hay dos soluciones para abordar este problema cuando se necesitan clases adicionales. Una solución es establecer el formato de los datos de las etiquetas de celda como una imagen de 16 bits en el programa de seguimiento, lo que provocará un aumento exponencial en el tiempo de procesamiento, más de dos días en el presente caso. La otra solución es usar el programa "separateTrackingResults.py" para posprocesar las etiquetas de las celdas, que separará las celdas con las mismas etiquetas en función de su ubicación física y asignará a cada celda una etiqueta diferente. Este proceso tarda alrededor de 10 minutos en este caso.

7. Análisis de la contractilidad cardíaca en la modalidad de realidad virtual

Duración: 1 día

1. Adquiera el resultado del seguimiento de celdas de los pasos anteriores.
2. Valide manualmente los datos y seleccione celdas con una intensidad de imagen uniforme en todos los volúmenes (aproximadamente 500 celdas de aproximadamente 600).
3. Utilice el script²¹ de cellLabelsToObj.ipynb para generar una malla de superficie para cada celda individual a través del software 3D Slicer²⁴ (consulte Tabla de materiales) y asigne un código de color único a cada celda.
4. Exporte cada modelo 3D, que consta de todas las celdas en un solo punto de tiempo, como un único archivo .obj que consta de varios subobjetos acompañados de un archivo .mtl para describir la etiqueta de la celda.
5. Importa los modelos a Unity usando la licencia educativa, un motor de desarrollo utilizado para la realidad extendida.
6. Aplique los scripts personalizados que consisten en funciones escritas en C# a los modelos y elementos de la interfaz de usuario para permitir la visualización 4D y el análisis interactivo. Realice la interacción de realidad virtual siguiendo el paso 7.7.
7. Interactúe con los modelos en realidad virtual (VR) mediante las siguientes funciones (Figura 4):
   1. Selección de celdas: seleccione hasta dos celdas a la vez y vea sus trayectorias, velocidades, volúmenes, áreas de superficie y distancias relativas.
   2. Selección de punto de tiempo: elija un punto de tiempo específico en los datos para analizar las salidas de las celdas seleccionadas, como en t = 0 ms durante la diástole o en t = 200 ms durante la sístole.
   3. Pausa de tiempo: congele el modelo dinámico para centrarse en las celdas seleccionadas y sus salidas.
   4. Contraste: Modula el contraste entre las celdas seleccionadas y las celdas circundantes en el modelo.

Resultados

El protocolo actual consta de tres pasos principales: preparación y microinyección del pez cebra, obtención de imágenes de lámina de luz y reconstrucción de imágenes 4D, y seguimiento celular e interacción de realidad virtual. Se permitió que los peces cebra adultos se aparearan, se recolectaron los huevos fertilizados y se realizó la microinyección según fuera necesario para los experimentos propuestos (Figura 1). Este paso proporciona un punto de entrada para explorar las aplic...

Discusión

La integración del modelo del pez cebra con métodos de ingeniería tiene un inmenso potencial para la exploración in vivo del infarto de miocardio, las arritmias y los defectos cardíacos congénitos. Aprovechando su transparencia óptica, capacidad regenerativa y similitudes genéticas y fisiológicas con los humanos, los embriones y larvas de pez cebra se han utilizado ampliamente en la investigación ^1,2,4. La res...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S