Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Resumen

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Resumen

El pez cebra es un organismo modelo intrigante conocido por su notable capacidad de regeneración cardíaca. El estudio de la contracción del corazón in vivo es esencial para obtener información sobre los cambios estructurales y funcionales en respuesta a las lesiones. Sin embargo, la obtención de imágenes de alta resolución y alta velocidad en 4 dimensiones (4D, 3D espacial + 1D temporal) del corazón del pez cebra para evaluar la arquitectura cardíaca y la contractilidad sigue siendo un desafío. En este contexto, se utiliza un microscopio de lámina de luz (LSM) interno y un análisis computacional personalizado para superar estas limitaciones técnicas. Esta estrategia, que implica la construcción del sistema LSM, la sincronización retrospectiva, el seguimiento de una sola célula y el análisis dirigido por el usuario, permite investigar la microestructura y la función contráctil en todo el corazón a la resolución de una sola célula en las larvas de pez cebra transgénicas Tg (myl7: nucGFP ). Además, somos capaces de incorporar aún más la microinyección de compuestos de moléculas pequeñas para inducir lesiones cardíacas de forma precisa y controlada. En general, este marco permite rastrear los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, así como la mecánica regional a nivel de una sola célula durante la morfogénesis y la regeneración cardíacas.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo, la fisiología y la reparación cardíaca debido a su transparencia óptica, trazabilidad genética y capacidad regenerativa 1,2,3,4. En el caso del infarto de miocardio, si bien los cambios estructurales y funcionales impactan la eyección cardíaca y la hemodinámica, las limitaciones técnicas continúan dificultando la capacidad de investigar el proceso dinámico durante la regeneración cardíaca con la alta resolución espacio-temporal. Por ....

Protocolo

La aprobación de este estudio fue otorgada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas en Dallas, bajo el número de protocolo #20-07. Para el presente estudio se utilizaron larvas transgénicas de pez cebra Tg(myl7:nucGFP) ¹². Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.

1. Cría de pez cebra y microinyección de embriones

Discusión

La integración del modelo del pez cebra con métodos de ingeniería tiene un inmenso potencial para la exploración in vivo del infarto de miocardio, las arritmias y los defectos cardíacos congénitos. Aprovechando su transparencia óptica, capacidad regenerativa y similitudes genéticas y fisiológicas con los humanos, los embriones y larvas de pez cebra se han utilizado ampliamente en la investigación ^1,2,4. La res.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S