4D-визуализация сердечного приступа рыбки данио

Резюме

Этот протокол использует визуализацию светового листа для исследования сократительной функции сердца у личинок данио-рерио и получения информации о механике сердца с помощью отслеживания клеток и интерактивного анализа.

Аннотация

Рыбка данио-рерио – это интригующий модельный организм, известный своей замечательной способностью к регенерации сердца. Изучение сокращающегося сердца in vivo имеет важное значение для получения информации о структурных и функциональных изменениях в ответ на травмы. Тем не менее, получение высокоскоростных 4-мерных (4D, 3D пространственных + 1D временных) изображений сердца рыбки данио для оценки сердечной архитектуры и сократимости сердца остается сложной задачей. В этом контексте для преодоления этих технических ограничений используется собственный световой микроскоп (LSM) и специализированный вычислительный анализ. Эта стратегия, включающая построение системы LSM, ретроспективную синхронизацию, отслеживание отдельных клеток и управляемый пользователем анализ, позволяет исследовать микроструктуру и сократительную функцию по всему сердцу с одноклеточным разрешением у трансгенных личинок Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, мы можем дополнительно использовать микроинъекции низкомолекулярных соединений для точного и контролируемого вызова сердечного поражения. В целом, эта система позволяет отслеживать физиологические и патофизиологические изменения, а также региональную механику на уровне отдельных клеток в процессе морфогенеза и регенерации сердца.

Введение

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом для изучения сердечного развития, физиологии и восстановления благодаря своей оптической прозрачности, генетической податливости и регенеративной способности 1,2,3,4. При инфаркте миокарда, в то время как структурные и функциональные изменения влияют на выброс сердца и гемодинамику, технические ограничения продолжают препятствовать возможности исследовать динамический процесс во время регенерации сердца с высоким пространственно-временным разрешением. Например, традиционные методы визуализации, такие как конфокальная микроскопия, имеют ограничения с точки зрения глубины изображения, временного разрешения или фототоксичности для регистрации динамических изменений и оценки сократительной функции сердца в течение нескольких^{сердечных} циклов.

Световая микроскопия представляет собой современный метод визуализации, который успешно решает эти проблемы путем быстрого перемещения лазера по желудочку и предсердию сердца, получая детальные изображения с улучшенным пространственно-временным разрешением и незначительными фотообесцвечивающими и фототоксическими эффектами 6,7,8,9,10,11.

Этот протокол представляет собой комплексную стратегию визуализации, которая включает в себя построение системы LSM, реконструкцию 4D-изображений, 3D-отслеживание клеток и интерактивный анализ для захвата и анализа динамики кардиомиоцитов по всему сердцу в течение нескольких^{сердечных} циклов. Специализированная система визуализации и вычислительная методология позволяют отслеживать микроструктуру миокарда и сократительную функцию на уровне отдельных клеток у личинок данио-рерио трансгенных Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, низкомолекулярные соединения были введены в эмбрионы с помощью микроинъекций для оценки лекарственно-индуцированного повреждения сердца и последующей регенерации. Эта целостная стратегия обеспечивает отправную точку для исследования in vivo структурных, функциональных и механических свойств миокарда на уровне отдельных клеток во время развития и регенерации сердца.

протокол

Разрешение на проведение этого исследования было выдано Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Техасского университета в Далласе под номером протокола #20-07. Для настоящего исследования использовали¹² трансгенных личинок данио-рерио Tg(myl7:nucGFP). Весь сбор данных и постобработка изображений осуществлялись с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом или платформ с исследовательскими или образовательными лицензиями. Ресурсы предоставляются авторами по обоснованному запросу.

1. Разведение данио-рерио и микроинъекция эмбрионов

Сроки: 2 дня

1. Поддерживайте и разводите взрослых рыбок данио-рерио с помощью стандартных процедур ухода и разведения. Подробные сведения о методах см. в предыдущем отчете¹³.
2. Выполняйте микроинъекцию в соответствии с установленным протоколом¹⁴. В настоящем исследовании микроинъекция выполнялась на стадии 1-2 клеток (зиготы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно точно определить эту стадию для эффективной микроинъекции и обеспечить последовательность развития. Во время одноклеточной стадии на желтке образуется небольшой купол, и эта стадия обычно длится около 12 минут. При переходе в двухклеточную стадию становятся видимыми два соседних купола, и эта стадия продолжается около 45 минут после оплодотворения^. Более подробную информацию о построении системы можно найти в других отчетах или протоколах 12,16,17.

2. Подготовка и монтаж эмбрионов/личинок данио-рерио

Сроки: 7 дней

1. Перенос эмбрионов через 1 день после оплодотворения (DPF) в воду E3 с 0,2 мМ 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ) (см. Таблицу материалов) для предотвращения образования пигмента.
2. Заменяйте среду свежей водой E3 с PTU каждый день до получения LSM-изображения.
3. Визуализируйте эмбрионы или личинки с помощью стереомикроскопа, чтобы зарегистрировать их развитие в желаемые моменты времени от 0 до 7 dpf.
4. Подготовьте сегментированные трубки из фторированного этиленпропилена (ФЭП) с внутренним диаметром 2 мм для встраивания личинок данио-рерио в систему LSM¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка FEP используется для закрепления образца материалами, соответствующими показателю преломления, которые очень похожи на окружающую среду, например, воду.
5. Начиная с 3 dpf, переведите рыбу в раствор трикаина (MS-222) с концентрацией 150 мг/л (см. таблицу материалов), чтобы обездвижить рыбу перед визуализацией.
6. Приготовьте 0,8 % легкоплавкую агарозу со 150 мг/л трикаина и с помощью пипетки для переноса переместите обезболиваемую рыбу в агарозу после того, как она остынет до комнатной температуры¹⁸.
7. Используйте другую трансферную пипетку, чтобы закрепить рыбу с агарозой в пробирках FEP (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для установления минимального стресса у развивающихся эмбрионов были проведены исследования сердечной деятельности до и после фиксации, такие как частота сердечных сокращений, под микроскопическим наблюдением. Эти оценки были направлены на выявление каких-либо существенных различий до и после трикаиновой анестезии. Дополнительное обследование кожи и мускулатуры на предмет нарушений сердечной структуры, таких как отеки, также может быть проведено после фиксации. Концентрация трикаина также играет решающую роль в визуализации сердца¹⁹, поэтому в этом проекте для визуализации сокращения у личинок данио-рерио был использован раствор трикаина с концентрацией 150 мг/л. В то время как нынешняя ретроспективная синхронизация позволяет нам работать с нерегулярным сердцебиением20, комплексное решение для 4D-визуализации сердечных аритмий и долгосрочной визуализации у рыбок данио-рерио все еще находится в стадии разработки.

3. Настройка и конфигурация системы визуализации светового листа

Сроки: 3-14 дней

1. Создайте собственную LSM-систему на основе цилиндрической линзы, используя в качестве источников освещения твердотельные лазерные системы с непрерывной диодной накачкой (DPSS) на определенных длинах волн, таких как 473 нм и 532 нм (рис. 2A).
2. Настройка управляющих кодов LabVIEW (см. Таблицу материалов) для синхронизации трансляционного столика образца, освещения светового полотна и экспозиции камеры sCMOS для захвата последовательностей изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о построении системы можно найти в других отчетах или протоколах 12,16,17. Мы призываем исследовательские группы искать возможности сотрудничества с лабораториями, обладающими признанным опытом в области оптической визуализации при создании системы.

4. Подготовка изображений данио-рерио и сбор данных

Сроки: 1 день

1. Откалибруйте пространственное разрешение системы LSM и минимизируйте изменение непрозрачности на различной глубине, измеряя флуоресцентные шарики.
   1. Сначала разбавляют флуоресцентные шарики (см. таблицу материалов) диаметром 0,53 мкм до концентрации 1:1,5 х^{10,5 5} с использованием 0,8 % легкоплавкой агарозы и переносят раствор в сегментированную трубку ФЭП.
   2. Во-вторых, используйте систему LSM для визуализации шариков и измерения функции разброса точек (PSF) по всему образцу, проверяя пространственное разрешение и выравнивание системы¹².
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе анализ репрезентативных результатов для полной ширины при половинном максимуме (FWHM) показывает боковое и осевое разрешение 1,26 ± 0,15 и 2,48 ± 0,15 мкм (n = 60 шариков) соответственно. Это говорит о постоянном пространственном разрешении по всей глубине изображения.
2. Надежно прикрепите трубку FEP с установленной личинкой данио-рерио к 6-осевой (x, y, z, тангаж, рыскание и крен) моторизованному столику образца и погрузите пробирки в камеру для отбора проб, заполненную водой E3. Чтобы избежать рассеивания света желточным мешком и лучше определить положение сердца, поверните личинку данио-рерио, чтобы получить изображение с брюшной стороны (рис. 2B). В этом случае большинство полученных изображений будут включать как желудочек, так и предсердие (рис. 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что текущие процедуры визуализации обычно длились менее одного часа для каждой рыбы и проводились в условиях контролируемой комнатной температуры, контроль температуры в камере и регулирование уровня кислорода считаются необязательными для этого проекта. Тем не менее, для долгосрочных исследований с покадровой визуализацией, особенно тех, которые сосредоточены на процессах развития, рекомендуется непрерывный мониторинг и регулирование температуры при 27 °C в камере для образцов, чтобы обеспечить физиологическую среду рыбок данио и предотвратить любые потенциальные аномалии развития.
3. Подключите моторизованный столик к рабочей станции и настройте все необходимые параметры, включая желаемый режим движения.
4. Установите соединение между камерой sCMOS и рабочей станцией. Отрегулируйте все основные параметры, такие как время экспозиции 5 мс и желаемая область интереса.
5. Настройте количество последовательностей изображений и кадров в настраиваемой управляющей программе LabVIEW.
6. Включите лазер и начните LSM-визуализацию образца. Поддерживайте процесс до тех пор, пока все последовательности изображений не будут успешно записаны.
7. Запишите 300 кадров в виде последовательности 2D-изображений, чтобы охватить 3-5 сердечных циклов личинки с частотой кадров 200 кадров в секунду. Запись фиксирует сократительную способность сердца в селективной плоскости, освещенной световым полотном.
8. Перемещайте личинку с шагом 1 мкм по световому листу, чтобы виртуально разрезать образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага предметного столика должен быть установлен на основе осевого разрешения системы светового листа в соответствии с теоремой¹² Найквиста-Шеннона.
9. Повторите шаг 7, чтобы записать еще одну последовательность изображений нового образца среза, пока не будет покрыто все сердце. Как правило, 100-200 последовательностей изображений с шагом 1 мкм обеспечивают охват всего сердца личинки данио-рерио (рис. 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.7-4.9 контролируются программой LabVIEW и автоматически выполняются системой LSM (Рисунок 3). Учитывая большой объем генерируемых данных изображений, для последовательностей изображений рекомендуется стандартизированное соглашение об именовании. Например, назначьте папки с такими именами, как «z-1», «z-2» и т. д., чтобы классифицировать данные по различным последовательностям изображений. В каждой последовательности изображения должны быть названы последовательно (например, "1", "2", ...), чтобы обозначить различные моменты времени. Общее время, затрачиваемое на установку рыбы, регулировку угла съемки и сбор всех данных для одной личинки данио-рерио, составляет около 1 часа.

5. Реконструкция 4D-изображения с параллельными вычислениями

Сроки: 1 день
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм 4D-реконструкции, разработанный нашей группой, и образцы данных находятся в открытом доступе²¹. Этот метод позволяет реконструировать 4D-изображение сердца по последовательностям изображений, собранным на предыдущих этапах (табл. 1).

1. Откройте файл test_Parallel.m в MATLAB (см. Таблицу материалов). Укажите расположение папки, в которой хранятся последовательности необработанных изображений, в переменной "baseDir".
2. Присвойте переменной "numOfSlice" общее количество последовательностей изображений (обычно 100-150), а переменной "numOfImage" - количество изображений (обычно 300-500) в каждой последовательности.
3. Просмотрите последовательность изображений, показывающую среднюю плоскость сердца рыбки данио (например,^51-я последовательность из 101 общей последовательности). Определите номера кадров первой и четвертой систол в этой последовательности и присвойте их переменным systolicPoint_1st и systolicPoint_4th.
4. Нажмите « Выполнить », чтобы начать процесс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность сердечного цикла в каждой последовательности изображений сначала определяется программой MATLAB путем сравнения сходства (суммы квадратов разностей) между изображениями в разные моменты времени. Впоследствии сердечный цикл будет оценен с использованием среднего значения длин циклов из всех последовательностей изображений. Затем начальные точки последовательностей изображений в различных осевых положениях будут выровнены программой путем итеративного сравнения сходства изображений от первой последовательности изображений до последней последовательности изображений.
5. Проверьте результаты в выходной папке. Программа сохранит изображения в виде файлов ".tif" с временными метками. Каждый файл ".tif" представляет собой 3D-изображение сердца в определенный момент времени. Интервал времени между двумя 3D-изображениями равен установленному времени экспозиции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реконструируйте изображения, полученные на предыдущих шагах, чтобы изобразить 4D (3D пространственные + 1D временные) сердечные сокращения. Чтобы повысить квалификацию в исследованиях с высокой пропускной способностью во время ретроспективной синхронизации, этот подход позволяет выполнять одновременные вычислительные операции на GPU за счет использования нескольких ядер CPU через набор инструментов параллельных вычислений MATLAB и преобразования изображений в формат gpuArray.

6. 3D сегментация клеток и отслеживание клеток

Сроки: 1 день

1. Скачайте пакет 3DeeCellTracker (см. Таблицу материалов) и настройте окружение Python²².
2. Загрузите программное обеспечение для аннотирования ITK-SNAP²³ (см. таблицу материалов) и используйте его для ручной маркировки 3D-изображения сердца в двух выбранных временных точках, одна на диастоле желудочков, а другая на систоле желудочков, для создания наборов данных для обучения и проверки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также может применяться другое программное обеспечение для маркировки.
3. В Python запустите обучающую программу 3DeeCellTracker и инициализируйте параметры noise_level(в данном случае 100), folder_path и модели в функции TrainingUNet3D , чтобы задать предопределенную 3D модель U-Net.
4. В MATLAB используйте программу imageDimConverter.m для преобразования и переименования набора данных для обучения и проверки в нужный формат для загрузки.
5. В Python загрузите наборы данных для обучения и проверки с помощью функций trainer.load_dataset() и trainer.draw_dataset().
6. В Python запустите первую часть трекинговой программы 3DeeCellTracker и инициализируйте параметры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это включает в себя определение параметров изображения для определения размеров изображения, параметров сегментации для выбора модели машинного обучения, применяемой для сегментации клеток, и параметров отслеживания для выбора предварительно обученных моделей глубоких нейронных сетей, используемых для регистрации клеток. При первом использовании рекомендуется использовать модель U-Net для сегментации клеток и FFN+ PR-GLS для регистрации клеток. Он необходим для хранения данных, модели и результатов в папках, которые будут автоматически созданы на этом шаге.
7. В MATLAB с помощью программы imageDimConverter.m преобразуйте и переименуйте все 3D-изображения сердца в нужный формат и перенесите их в папку данных, созданную на последнем шаге.
8. В Python запустите вторую часть программы 3DeeCellTracker , чтобы начать сегментацию.
9. После сегментации первого 3D-изображения сравните результат сегментации с необработанным изображением и выполните ручную коррекцию, если обнаружена неправильная сегментация. Переместите исправленную сегментацию в созданную папку "/manual_vol1".
10. В Python запустите третью часть программы 3DeeCellTracker , чтобы сегментировать все изображения.
11. Используйте Amira (см. Таблицу материалов) для визуальной оценки результатов отслеживания путем сравнения положений отслеживаемых ячеек с соответствующими необработанными изображениями. Если результаты теста не удовлетворяют, повторите процедуру, начиная с шага 6.6, используйте альтернативную модель машинного обучения для сегментации или регистрации клеток, а затем повторно запустите процесс отслеживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сегментации данные меток ячеек по умолчанию сохраняются в виде 8-битного изображения (от 0 до 255), что означает, что в качестве меток для классификации ячеек предоставляется только 256 шкал. Есть два решения для решения этой проблемы, когда требуются дополнительные классы. Одним из решений является установка формата данных меток ячеек в виде 16-битного изображения в программе отслеживания, что приведет к экспоненциальному увеличению времени обработки, более чем на два дня в данном случае. Другим решением является использование программы «separateTrackingResults.py» для постобработки меток ячеек, которая разделяет ячейки одинаковыми метками в зависимости от их физического местоположения и присваивает каждой ячейке отдельную метку. В этом случае этот процесс занимает около 10 минут.

7. Анализ сократительной способности сердца в режиме виртуальной реальности

Сроки: 1 день

1. Получение результатов отслеживания клеток на предыдущих шагах.
2. Вручную проверьте данные и выберите ячейки с одинаковой интенсивностью изображения на всех томах (около 500 ячеек из примерно 600).
3. Используйте сценарий cellLabelsToObj.ipynb ²¹ для создания поверхностной сетки для каждой отдельной ячейки с помощью программного обеспечения 3D Slicer²⁴ (см. Таблицу материалов) и присвойте каждой ячейке уникальный цветовой код.
4. Экспортируйте каждую 3D-модель, состоящую из всех ячеек в один момент времени, в виде одного файла .obj, состоящего из нескольких подобъектов, сопровождаемых файлом .mtl для описания метки ячейки.
5. Импортируйте модели в Unity с помощью образовательной лицензии — механизма разработки, используемого для расширенной реальности.
6. Применяйте настраиваемые сценарии, состоящие из функций, написанных на C#, к моделям и элементам пользовательского интерфейса, чтобы обеспечить 4D-визуализацию и интерактивный анализ. Выполните VR-взаимодействие, выполнив шаг 7.7.
7. Взаимодействуйте с моделями в виртуальной реальности (VR) с помощью следующих функций (рисунок 4):
   1. Выбор ячеек: Выберите до двух ячеек одновременно и просмотрите их траектории, скорости, объемы, площади поверхности и относительные расстояния.
   2. Выбор точки времени: выберите конкретный момент времени в данных для анализа выходных данных выбранных ячеек, например, при t = 0 мс во время диастолы или при t = 200 мс во время систолы.
   3. Временная пауза: заморозьте динамическую модель, чтобы сосредоточиться на выбранных ячейках и их выходных данных.
   4. Контрастность: модулирует контраст между выбранными ячейками и окружающими ячейками в модели.

Результаты

Текущий протокол состоит из трех основных этапов: подготовка рыбок данио и микроинъекция, визуализация светового листа и реконструкция 4D-изображения, а также отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью. Взрослым рыбкам данио-рерио было позволено спариваться, оплод...

Обсуждение

Интеграция модели рыбки данио с инженерными методами имеет огромный потенциал для исследования in vivo инфаркта миокарда, аритмий и врожденных пороков сердца. Используя свою оптическую прозрачность, регенеративную способность, а также генетическое и физиологическое сходство с чел?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S