Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Riepilogo

Questo protocollo utilizza l'imaging a foglio luminoso per studiare la funzione contrattile cardiaca nelle larve di zebrafish e ottenere informazioni sulla meccanica cardiaca attraverso il monitoraggio cellulare e l'analisi interattiva.

Abstract

Il pesce zebra è un intrigante organismo modello noto per la sua notevole capacità di rigenerazione cardiaca. Studiare la contrazione del cuore in vivo è essenziale per ottenere informazioni sui cambiamenti strutturali e funzionali in risposta alle lesioni. Tuttavia, ottenere immagini 4-dimensionali ad alta risoluzione e ad alta velocità (4D, 3D spaziale + 1D temporale) del cuore del pesce zebra per valutare l'architettura cardiaca e la contrattilità rimane una sfida. In questo contesto, per superare questi limiti tecnici vengono utilizzati un microscopio a foglio luminoso (LSM) interno e un'analisi computazionale personalizzata. Questa strategia, che coinvolge la costruzione del sistema LSM, la sincronizzazione retrospettiva, il tracciamento di singole cellule e l'analisi diretta dall'utente, consente di studiare la microstruttura e la funzione contrattile in tutto il cuore alla risoluzione di una singola cellula nelle larve transgeniche di pesce zebra Tg (myl7:nucGFP). Inoltre, siamo in grado di incorporare ulteriormente la microiniezione di composti di piccole molecole per indurre lesioni cardiache in modo preciso e controllato. Nel complesso, questo quadro consente di tracciare i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, nonché la meccanica regionale a livello di singola cellula durante la morfogenesi e la rigenerazione cardiaca.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio) è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio dello sviluppo, della fisiologia e della riparazione cardiaca grazie alla sua trasparenza ottica, alla trattabilità genetica e alla capacità rigenerativa 1,2,3,4. In caso di infarto del miocardio, mentre i cambiamenti strutturali e funzionali hanno un impatto sull'eiezione cardiaca e sull'emodinamica, le limitazioni tecniche continuano a ostacolare la capacità di studiare il processo dinamico durante la rigenerazione cardiaca con l'elevata risoluzione spazio-temporale. Ad esempio, i metodi di imaging convenzionali, come la microscopia confocale, presentano limitazioni in termini di profondità di imaging, risoluzione temporale o fototossicità per catturare i cambiamenti dinamici e valutare la funzione contrattile cardiaca durante più cicli cardiaci⁵.

La microscopia a foglio luminoso rappresenta un metodo di imaging all'avanguardia che affronta con successo questi problemi facendo scorrere rapidamente il laser attraverso il ventricolo e l'atrio del cuore, ottenendo immagini dettagliate con una maggiore risoluzione spazio-temporale e trascurabili effetti di foto-sbiancamento e fototossici 6,7,8,9,10,11.

Questo protocollo introduce una strategia di imaging completa che include la costruzione del sistema LSM, la ricostruzione dell'immagine 4D, il tracciamento cellulare 3D e l'analisi interattiva per acquisire e analizzare la dinamica dei cardiomiociti in tutto il cuore durante più cicli cardiaci¹². Il sistema di imaging personalizzato e la metodologia computazionale consentono di tracciare la microstruttura miocardica e la funzione contrattile a livello di singola cellula in larve di zebrafish transgenico Tg(myl7:nucGFP). Inoltre, i composti di piccole molecole sono stati somministrati negli embrioni utilizzando la microiniezione per valutare il danno cardiaco indotto da farmaci e la successiva rigenerazione. Questa strategia olistica fornisce un punto di ingresso per studiare in vivo le proprietà strutturali, funzionali e meccaniche del miocardio a livello di singola cellula durante lo sviluppo e la rigenerazione cardiaca.

Protocollo

L'approvazione per questo studio è stata concessa dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas a Dallas, con il numero di protocollo #20-07. Per il presente studio sono state utilizzate larve^{transgeniche di} pesce zebra Tg(myl7:nucGFP) 12. Tutta l'acquisizione dei dati e la post-elaborazione delle immagini sono state effettuate utilizzando software o piattaforme open-source con licenze di ricerca o didattiche. Le risorse sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.

1. Allevamento del pesce zebra e microiniezione di embrioni

Durata: 2 giorni

1. Mantenere e allevare zebrafish adulti attraverso le procedure standard di cura e allevamento. Per i metodi dettagliati, fare riferimento al precedente rapporto¹³.
2. Eseguire la microiniezione seguendo il protocollo^{stabilito 14}. Per il presente studio, la microiniezione è stata eseguita allo stadio di 1-2 cellule (zigote).
   NOTA: È fondamentale identificare con precisione questa fase per una microiniezione efficace e per garantire la coerenza dello sviluppo. Durante la fase di una cellula, si forma una piccola cupola in cima al tuorlo e questa fase dura in genere circa 12 minuti. Passando allo stadio a due cellule, due cupole adiacenti diventano visibili e questo stadio dura per circa 45 minuti dopo la fecondazione¹⁵. Informazioni più dettagliate sulla costruzione del sistema possono essere trovate in altri rapporti o protocolli 12,16,17.

2. Preparazione e montaggio di embrioni/larve di zebrafish

Durata: 7 giorni

1. Trasferire gli embrioni a 1 giorno dopo la fecondazione (dpf) in acqua E3 con 0,2 mM di 1-fenil-2-tiourea (PTU) (vedi tabella dei materiali) per prevenire la formazione di pigmenti.
2. Sostituire il terreno con acqua fresca E3 con PTU ogni giorno fino all'imaging LSM.
3. Fotografare embrioni o larve con lo stereomicroscopio per registrare il loro sviluppo nei punti temporali desiderati tra 0 e 7 dpf.
4. Preparare provette segmentate di etilene propilene fluorurato (FEP) con diametro interno di 2 mm per l'inserimento di larve di pesce zebra sotto il sistema LSM¹².
   NOTA: Il tubo FEP viene utilizzato per fissare il campione con materiali corrispondenti all'indice di rifrazione che assomigliano molto al mezzo circostante, come l'acqua.
5. Partendo da 3 dpf, trasferire il pesce in una soluzione di tricaina (MS-222) da 150 mg/L (vedere la tabella dei materiali) per immobilizzare il pesce prima dell'imaging.
6. Preparare agarosio a basso punto di fusione allo 0,8 % con tricaina 150 mg/L e utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il pesce anestetizzato sull'agarosio una volta che si è raffreddato a temperatura ambiente¹⁸.
7. Utilizzare un'altra pipetta di trasferimento per montare il pesce con agarosio in tubi FEP (Figura 1).
   NOTA: Per accertare lo stress minimo negli embrioni in via di sviluppo, sono stati condotti esami pre e post-fissazione dell'attività cardiaca, come la frequenza cardiaca, sotto osservazione microscopica. Queste valutazioni miravano a identificare eventuali differenze significative prima e dopo l'anestesia con tricaina. Un ulteriore esame della pelle e della muscolatura per irregolarità nella struttura cardiaca, come l'edema, potrebbe anche essere condotto dopo la fissazione. La concentrazione di tricaina svolge anche un ruolo cruciale nell'imaging cardiaco¹⁹, e quindi la soluzione di tricaina con concentrazione di 150 mg/L è stata utilizzata per l'imaging della contrazione nelle larve di zebrafish in questo progetto. Mentre l'attuale sincronizzazione retrospettiva ci consente di affrontare i battiti cardiaci irregolari²⁰, una soluzione completa per l'imaging 4D delle aritmie cardiache e l'imaging a lungo termine nel pesce zebra è ancora in fase di sviluppo.

3. Impostazione e configurazione del sistema di imaging a foglio luminoso

Tempistiche: 3-14 giorni

1. Costruire un sistema LSM interno basato su una lente cilindrica utilizzando sistemi laser a stato solido pompati a diodi a onda continua (DPSS) a lunghezze d'onda specifiche come 473 nm e 532 nm come sorgenti di illuminazione (Figura 2A).
2. Personalizza i codici di controllo di LabVIEW (vedi Tabella dei materiali) per la sincronizzazione dello stadio traslazionale del campione, dell'illuminazione del foglio luminoso e dell'esposizione della camera sCMOS per acquisire sequenze di immagini.
   NOTA: Informazioni più dettagliate sulla costruzione del sistema possono essere trovate in altri rapporti o protocolli 12,16,17. Incoraggiamo i gruppi di ricerca a cercare opportunità di collaborazione con laboratori che possiedono una consolidata esperienza nell'imaging ottico durante la costruzione del sistema.

4. Preparazione dell'imaging del pesce zebra e raccolta dei dati

Durata: 1 giorno

1. Calibra la risoluzione spaziale del sistema LSM e riduci al minimo la variazione di opacità a profondità variabili misurando le perle di fluorescenza.
   1. In primo luogo, diluire le microsfere fluorescenti (cfr. tabella dei materiali) del diametro di 0,53 μm a una concentrazione di 1: 1,5 x 10⁵ utilizzando agarosio a basso punto di fusione allo 0,8 % e trasferire la soluzione nel tubo di FEP segmentato.
   2. In secondo luogo, utilizzare il sistema LSM per visualizzare l'immagine delle perle e misurare la funzione di diffusione del punto (PSF) sull'intero campione, convalidando la risoluzione spaziale e l'allineamento del sistema¹².
      NOTA: In questo sistema, l'analisi dei risultati rappresentativi per l'intera larghezza a metà massimo (FWHM) indica risoluzioni laterali e assiali rispettivamente di 1,26 ± 0,15 e 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 perline). Ciò suggerisce una risoluzione spaziale coerente in tutta la profondità dell'immagine.
2. Fissare saldamente il tubo FEP con la larva di zebrafish montata allo stadio di campionamento motorizzato a 6 assi (x, y, z, beccheggio, imbardata e rollio) e immergere i tubi nella camera del campione riempita con acqua E3. Per evitare la dispersione della luce da parte del sacco vitellino e localizzare meglio la posizione del cuore, ruotare la larva di pesce zebra per acquisire l'immagine dal lato ventrale (Figura 2B). In questo caso, la maggior parte delle immagini acquisite includerebbe sia il ventricolo che l'atrio (Figura 2C).
   NOTA: Dato che le attuali procedure di imaging durano in genere meno di un'ora per pesce e sono state condotte in un ambiente a temperatura ambiente controllata, il controllo della temperatura della camera e la regolazione del livello di ossigeno sono considerati opzionali per questo progetto. Tuttavia, per gli studi di imaging time-lapse a lungo termine, in particolare quelli incentrati sui processi di sviluppo, si suggerisce il monitoraggio continuo e la regolazione della temperatura a 27 °C all'interno della camera del campione per garantire l'ambiente fisiologico del pesce zebra e prevenire potenziali anomalie dello sviluppo.
3. Collegare lo stadio di campionamento motorizzato alla stazione di lavoro e configurare tutti i parametri necessari, compresa la modalità di spostamento desiderata.
4. Stabilire una connessione tra la telecamera sCMOS e la workstation. Regolare tutte le impostazioni essenziali, come un tempo di esposizione di 5 ms e la regione di interesse desiderata.
5. Configura il numero di sequenze di immagini e fotogrammi all'interno del programma di controllo LabVIEW personalizzato.
6. Accendere il laser e avviare l'imaging LSM del campione. Mantenere il processo fino a quando tutte le sequenze di immagini non sono state registrate correttamente.
7. Registra 300 fotogrammi come sequenza di immagini 2D per coprire 3-5 cicli cardiaci della larva con un framerate di 200 fotogrammi al secondo. La registrazione cattura la contrattilità cardiaca sul piano selettivo illuminato dal foglio luminoso.
8. Spostare la larva alla dimensione del passo di 1 μm attraverso l'illuminazione del foglio luminoso per affettare virtualmente il campione.
   NOTA: La dimensione del passo dello stadio campione deve essere impostata in base alla risoluzione assiale del sistema a foglio luminoso, seguendo il teorema di campionamento di Nyquist-Shannon¹².
9. Ripetere il passaggio 7 per registrare un'altra sequenza di immagini della nuova fetta di campione fino a coprire l'intero cuore. Generalmente, 100-200 sequenze di immagini con una dimensione del passo di 1 μm garantiscono la copertura dell'intero cuore di una larva di pesce zebra (Figura 2D).
   NOTA: I passaggi 4.7-4.9 sono controllati dal programma LabVIEW ed eseguiti automaticamente dal sistema LSM (Figura 3). Dato l'elevato volume di dati di immagine generati, si consiglia una convenzione di denominazione standardizzata per le sequenze di immagini. Ad esempio, designare cartelle con nomi come "z-1", "z-2" e così via, per classificare i dati in varie sequenze di immagini. All'interno di ogni sequenza, le immagini devono essere denominate in sequenza (ad esempio, "1", "2", ...) per indicare punti temporali distinti. Il tempo totale per il montaggio dei pesci, la regolazione dell'angolo di imaging e la raccolta di tutti i dati per una larva di zebrafish è di circa 1 ora.

5. Ricostruzione di immagini 4D con calcolo parallelo

Durata: 1 giorno
NOTA: L'algoritmo di ricostruzione 4D sviluppato dal nostro gruppo e i dati del campione sono accessibili al pubblico²¹. Questo metodo permette di ricostruire l'immagine del cuore 4D a partire dalle sequenze di immagini raccolte nei passaggi precedenti (Tabella 1).

1. Aprire il file test_Parallel.m in MATLAB (vedere Tabella dei materiali). Specificare la posizione della cartella in cui sono memorizzate le sequenze di immagini raw nella variabile "baseDir".
2. Assegnare alla variabile "numOfSlice" il numero totale di sequenze di immagini (in genere 100-150) e alla variabile "numOfImage" il numero di immagini (in genere 300-500) in ogni sequenza.
3. Ispeziona la sequenza di immagini che mostra il piano centrale del cuore del pesce zebra (ad esempio, la sequenza 51 su 101 sequenze totali). Identificare i numeri di frame della prima e della quarta sistole in questa sequenza e assegnarli alle variabili systolicPoint_1st e systolicPoint_4th.
4. Fare clic su Esegui per avviare il processo.
   NOTA: La lunghezza del ciclo cardiaco in ogni sequenza di immagini sarà prima identificata dal programma MATLAB attraverso un confronto della somiglianza (somma delle differenze al quadrato) tra le immagini in diversi punti temporali. Successivamente, il ciclo cardiaco sarà stimato utilizzando la media delle lunghezze del ciclo di tutte le sequenze di immagini. Successivamente, i punti di partenza delle sequenze di immagini in diverse posizioni assiali saranno allineati dal programma attraverso un confronto iterativo della somiglianza dell'immagine dalla prima sequenza di immagini all'ultima sequenza di immagini.
5. Controllare i risultati nella cartella di output. Il programma salverà le immagini come file ".tif" con timestamp. Ogni file ".tif" è un'immagine 3D del cuore in un punto temporale specifico. L'intervallo di tempo tra due immagini 3D è uguale al tempo di esposizione impostato.
   NOTA: Ricostruire le immagini acquisite dai passaggi precedenti per rappresentare le contrazioni cardiache 4D (3D spaziale + 1D temporale). Per migliorare la competenza nelle indagini ad alto throughput durante la sincronizzazione retrospettiva, questo approccio consente operazioni computazionali simultanee su una GPU sfruttando più core della CPU attraverso il toolbox di calcolo parallelo MATLAB e trasformando le immagini nel formato gpuArray.

6. 3D segmentazione cellulare e tracciamento cellulare

Durata: 1 giorno

1. Scaricare il pacchetto 3DeeCellTracker (vedere la tabella dei materiali) e configurare l'ambiente Python²².
2. Scarica il software di annotazione ITK-SNAP²³ (vedi Tabella dei materiali) e usalo per etichettare manualmente l'immagine del cuore 3D in due punti temporali selezionati, uno alla diastole ventricolare e l'altro alla sistole ventricolare, per creare i set di dati di addestramento e convalida.
   NOTA: Potrebbero essere applicabili anche altri software di etichettatura.
3. In Python, eseguire il programma di addestramento 3DeeCellTracker e inizializzare i parametri noise_level (100 in questo caso), folder_path e modello nella funzione TrainingUNet3D per impostare il modello U-Net 3D predefinito.
4. In MATLAB, utilizzare il programma imageDimConverter.m per convertire e rinominare il set di dati di addestramento e convalida nel formato corretto per il caricamento.
5. In Python, caricare i set di dati di training e convalida usando le funzioni trainer.load_dataset() e trainer.draw_dataset().
6. In Python, eseguire la prima parte del programma di tracciamento 3DeeCellTracker e inizializzare i parametri.
   NOTA: Ciò include la definizione dei parametri dell'immagine per caratterizzare le dimensioni dell'immagine, i parametri di segmentazione per selezionare il modello di apprendimento automatico applicato per la segmentazione delle cellule e i parametri di tracciamento per selezionare i modelli di rete neurale profonda pre-addestrati utilizzati per la registrazione delle cellule. Per il primo utilizzo, si raccomanda di utilizzare il modello U-Net per la segmentazione cellulare e FFN+ PR-GLS per la registrazione cellulare. È necessario archiviare i dati, il modello e i risultati in cartelle che verranno create automaticamente in questo passaggio.
7. In MATLAB, utilizzare il programma imageDimConverter.m per convertire e rinominare tutte le immagini del cuore 3D nel formato corretto e trasferirle nella cartella dati creata nell'ultimo passaggio.
8. In Python, esegui la seconda parte del programma 3DeeCellTracker per avviare la segmentazione.
9. Una volta segmentata la prima immagine 3D, confronta il risultato della segmentazione con l'immagine raw ed esegui la correzione manuale se viene rilevata una segmentazione errata. Sposta la segmentazione corretta nella cartella "/manual_vol1" creata.
10. In Python, esegui la terza parte del programma 3DeeCellTracker per segmentare tutte le immagini.
11. Utilizzare Amira (vedere la tabella dei materiali) per eseguire una valutazione visiva dei risultati del tracciamento confrontando le posizioni delle celle tracciate con le corrispondenti immagini grezze. Se i risultati del test non sono soddisfacenti, riavviare la procedura dal passaggio 6.6, utilizzare un modello di apprendimento automatico alternativo per la segmentazione o la registrazione delle celle, quindi riavviare il processo di tracciamento.
    NOTA: dopo la segmentazione, i dati delle etichette delle celle vengono memorizzati come immagine a 8 bit (da 0 a 255) per impostazione predefinita, il che significa che vengono fornite solo 256 scale come etichette per la classificazione delle celle. Esistono due soluzioni per risolvere questo problema quando sono necessarie classi aggiuntive. Una soluzione consiste nell'impostare il formato dei dati delle etichette delle celle come immagine a 16 bit nel programma di tracciamento, il che causerà un aumento esponenziale del tempo di elaborazione, più di due giorni in questo caso. L'altra soluzione consiste nell'utilizzare il programma "separateTrackingResults.py" per post-elaborare le etichette delle celle, che separerà le celle con le stesse etichette in base alla loro posizione fisica e assegnerà a ciascuna cella un'etichetta diversa. Questo processo richiede circa 10 minuti in questo caso.

7. Analisi della contrattilità cardiaca in modalità realtà virtuale

Durata: 1 giorno

1. Acquisire il risultato del tracciamento delle celle dai passaggi precedenti.
2. Convalidare manualmente i dati e selezionare le celle con un'intensità dell'immagine coerente in tutti i volumi (circa 500 celle su circa 600).
3. Utilizzare lo script cellLabelsToObj.ipynb ²¹ per generare una mesh di superficie per ogni singola cella tramite il software 3D Slicer²⁴ (vedere la tabella dei materiali) e assegnare un codice colore univoco a ciascuna cella.
4. Esporta ogni modello 3D, costituito da tutte le celle in un singolo punto temporale, come un singolo file .obj costituito da più oggetti secondari accompagnati da un file .mtl per descrivere l'etichetta della cella.
5. Importare i modelli in Unity usando la licenza didattica, un motore di sviluppo usato per la realtà estesa.
6. Applicare gli script personalizzati costituiti da funzioni scritte in C# ai modelli e agli elementi dell'interfaccia utente per consentire la visualizzazione 4D e l'analisi interattiva. Eseguire l'interazione VR seguendo il passaggio 7.7.
7. Interagisci con i modelli in realtà virtuale (VR) utilizzando le seguenti funzioni (Figura 4):
   1. Selezione delle celle: consente di selezionare fino a due celle alla volta e di visualizzarne le traiettorie, le velocità, i volumi, le superfici e le distanze relative.
   2. Selezione del punto temporale: scegliere un punto temporale specifico nei dati per analizzare gli output delle celle selezionate, ad esempio a t = 0 ms durante la diastole o a t = 200 ms durante la sistole.
   3. Pausa temporale: blocca il modello dinamico per concentrarti sulle celle selezionate e sui relativi output.
   4. Contrasto: modula il contrasto tra le celle selezionate e le celle circostanti nel modello.

Risultati

L'attuale protocollo consiste in tre fasi principali: preparazione e microiniezione del pesce zebra, imaging con foglio luminoso e ricostruzione di immagini 4D, tracciamento cellulare e interazione VR. Ai pesci zebra adulti è stato permesso di accoppiarsi, le uova fecondate sono state raccolte ed eseguite microiniezioni secondo necessità per gli esperimenti proposti (Figura 1). Questo passaggio fornisce un punto di ingresso per esplorare le applicazioni del pesce zebra nello studio dello s...

Discussione

L'integrazione del modello di zebrafish con metodi ingegneristici ha un immenso potenziale per l'esplorazione in vivo dell'infarto miocardico, delle aritmie e dei difetti cardiaci congeniti. Sfruttando la sua trasparenza ottica, la capacità rigenerativa e le somiglianze genetiche e fisiologiche con gli esseri umani, gli embrioni e le larve di zebrafish sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca ^1,2,4. La risoluzion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S