Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Özet

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Özet

Zebra balığı, olağanüstü kardiyak rejenerasyon kapasitesi ile bilinen ilgi çekici bir model organizmadır. Kasılan kalbi in vivo olarak incelemek, yaralanmalara yanıt olarak yapısal ve fonksiyonel değişiklikler hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, kardiyak mimariyi ve kontraktiliteyi değerlendirmek için zebra balığı kalbinin yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı 4 boyutlu (4D, 3D uzamsal + 1D zamansal) görüntülerini elde etmek zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için kurum içi bir ışık tabakası mikroskobu (LSM) ve özelleştirilmiş hesaplamalı analiz kullanılmaktadır. LSM sistem yapısı, retrospektif senkronizasyon, tek hücre takibi ve kullanıcı yönelimli analizi içeren bu strateji, transgenik Tg(myl7:nucGFP) zebra balığı larvalarında tek hücreli çözünürlükte tüm kalp boyunca mikro yapı ve kasılma fonksiyonunun araştırılmasını sağlar. Ek olarak, hassas ve kontrollü bir şekilde kalp hasarını indüklemek için küçük moleküllü bileşiklerin mikroenjeksiyonunu daha da dahil edebiliyoruz. Genel olarak, bu çerçeve, kardiyak morfogenez ve rejenerasyon sırasında fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklerin yanı sıra tek hücre düzeyinde bölgesel mekaniğin izlenmesine izin verir.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), optik şeffaflığı, genetik izlenebilirliği ve rejeneratif kapasitesi 1,2,3,4 nedeniyle kardiyak gelişim, fizyoloji ve onarımı incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Miyokard infarktüsü sonrası, yapısal ve fonksiyonel değişiklikler kardiyak ejeksiyonu ve hemodinamiği etkilerken, teknik kısıtlılıklar yüksek uzay-zamansal rezolüsyon ile kardiyak rejenerasyon sırasındaki dinamik sürecin araştırılmasını engellemeye devam etmektedir. Örneğin, konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüleme yöntemlerinin, dinamik değişiklikleri yakalamak ve çoklu kardiyak sikluslar sırasında kardiyak kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için görüntüleme derinliği, zamansal çözünürlük veya fototoksisite açısından sınırlamaları vardır⁵.

Işık tabakası mikroskobu, lazeri kalbin ventrikülü ve atriyumu boyunca hızlı bir şekilde süpürerek, gelişmiş uzay-zamansal çözünürlük ve ihmal edilebilir foto-ağartma ve foto-toksik etkilere sahip ayrıntılı görüntüler elde ederek bu sorunları başarıyla ele alan son teknoloji bir görüntüleme yöntemini temsil eder 6,7,8,9,10,11.

Bu protokol, çoklu kardiyak döngüler sırasında tüm kalp boyunca kardiyomiyositlerin dinamiklerini yakalamak ve analiz etmek için LSM sistem yapımı, 4D görüntü rekonstrüksiyonu, 3D hücre takibi ve etkileşimli analizi içeren kapsamlı bir görüntüleme stratejisi sunar¹². Özelleştirilmiş görüntüleme sistemi ve hesaplama metodolojisi, transgenik Tg (myl7: nucGFP) zebra balığı larvalarında miyokardiyal mikro yapının ve kasılma fonksiyonunun tek hücre düzeyinde izlenmesine izin verir. Ayrıca, ilaca bağlı kardiyak hasarı ve müteakip rejenerasyonu değerlendirmek için mikroenjeksiyon kullanılarak embriyolara küçük moleküllü bileşikler verildi. Bu bütünsel strateji, kardiyak gelişim ve rejenerasyon sırasında miyokardın yapısal, fonksiyonel ve mekanik özelliklerini tek hücre düzeyinde in vivo olarak araştırmak için bir giriş noktası sağlar.

Protokol

Bu çalışma için onay, Dallas'taki Texas Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından #20-07 protokol numarası altında verilmiştir. Bu çalışmada Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığı^{larvaları 12} kullanıldı. Tüm veri toplama ve görüntü işleme sonrası, açık kaynaklı yazılımlar veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.

1. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo mikroenjeksiyonu

Süre: 2 gün

1. Yetişkin zebra balıklarını standart bakım ve yetiştirme prosedürleriyle koruyun ve yetiştirin. Ayrıntılı yöntemler için önceki rapor^13'e bakın.
2. Belirlenen protokole göre mikroenjeksiyon yapın¹⁴. Bu çalışmada mikroenjeksiyon 1-2 hücreli (zigot) evrede uygulandı.
   NOT: Etkili mikroenjeksiyon için bu aşamanın doğru tanımlanması ve gelişimsel tutarlılığın sağlanması çok önemlidir. Tek hücreli aşamada, yumurta sarısının üzerinde küçük bir kubbe oluşur ve bu aşama tipik olarak yaklaşık 12 dakika sürer. İki hücreli aşamaya ilerledikten sonra, iki bitişik kubbe görünür hale gelir ve bu aşama döllenmeden yaklaşık 45 dakika sonra sürer¹⁵. Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerde^bulunabilir 12,16,17.

2. Zebra balığı embriyoları/larvaları hazırlama ve montajı

Süre: 7 gün

1. Pigment oluşumunu önlemek için döllenmeden 1 gün sonra (dpf) embriyoları 0.2 mM 1-Fenil-2-tiyoüre (PTU) ile E3 suyuna aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Ortamı, LSM görüntülemeye kadar her gün PTU'lu taze E3 suyuyla değiştirin.
3. Gelişimlerini 0 ile 7 dpf arasında istenen zaman noktalarında kaydetmek için embriyoları veya larvaları stereo mikroskopla görüntüleyin.
4. Zebra balığı larvalarını LSM sistemi¹² altına gömmek için 2 mm iç çapa sahip segmentli florlu etilen propilen (FEP) tüpleri hazırlayın.
   NOT: FEP tüpü, numuneyi su gibi çevredeki ortama çok benzeyen kırılma indisi eşleşen malzemelerle sabitlemek için kullanılır.
5. 3 dpf'den başlayarak, görüntülemeden önce balıkları hareketsiz hale getirmek için balıkları 150 mg / L trikain (MS-222) çözeltisine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
6. 150 mg/L trikain ile %0,8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve anestezi uygulanmış balığı oda sıcaklığına¹⁸ soğuduktan sonra agaroza taşımak için bir transfer pipeti kullanın.
7. Balığı agarozlu FEP tüplerine monte etmek için başka bir transfer pipeti kullanın (Şekil 1).
   NOT: Gelişmekte olan embriyolardaki minimum stresi belirlemek için, kalp atış hızı gibi kardiyak aktivitenin fiksasyon öncesi ve sonrası incelemeleri mikroskobik gözlem altında yapıldı. Bu değerlendirmeler, trikin anestezisi öncesi ve sonrası önemli farklılıkları belirlemeyi amaçladı. Ödem gibi kardiyak yapıdaki düzensizlikler için cilt ve kas sisteminin ek bir muayenesi de fiksasyon sonrası yapılabilir. Trikama konsantrasyonu kardiyak görüntülemede de çok önemli bir rol oynamaktadır¹⁹ ve bu nedenle bu projede zebra balığı larvalarında kasılmanın görüntülenmesi için 150 mg/L konsantrasyonlu trikain çözeltisi kullanılmıştır. Mevcut retrospektif senkronizasyon, düzensiz kalp atışlarını²⁰ ele almamıza izin verirken, zebra balıklarında kardiyak aritmilerin 4D görüntülenmesi ve uzun süreli görüntüleme için kapsamlı bir çözüm hala geliştirilme aşamasındadır.

3. Hafif sayfa görüntüleme sistemi kurulumu ve yapılandırması

Süre: 3-14 gün

1. Aydınlatma kaynakları olarak 473 nm ve 532 nm gibi belirli dalga boylarında sürekli dalga diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer sistemleri kullanarak silindirik bir merceğe dayalı bir şirket içi LSM sistemi oluşturun (Şekil 2A).
2. Görüntü dizilerini yakalamak için translasyonel numune aşamasının, ışık tabakası aydınlatmasının ve sCMOS kameranın pozlamasının senkronizasyonu için LabVIEW ( Malzeme Tablosuna bakın) kontrol kodlarını özelleştirin.
   NOT: Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerde^bulunabilir 12,16,17. Araştırma gruplarını, sistem yapımı sırasında optik görüntüleme konusunda yerleşik uzmanlığa sahip laboratuvarlarla işbirliği fırsatları aramaya teşvik ediyoruz.

4. Zebra balığı görüntüleme hazırlığı ve veri toplama

Süre: 1 gün

1. Floresan boncuklarını ölçerek LSM sisteminin uzamsal çözünürlüğünü kalibre edin ve değişen derinliklerde opaklık değişimini en aza indirin.
   1. İlk olarak, 0,53 μm çapındaki floresan boncukları ( Malzeme Tablosuna bakınız) %0,8 düşük erime noktalı agaroz kullanarak 1: 1,5 x 10⁵ konsantrasyona seyreltin ve çözeltiyi segmentli FEP tüpüne aktarın.
   2. İkinci olarak, boncukları görüntülemek için LSM sistemini kullanın ve tüm numune boyunca nokta yayılma fonksiyonunu (PSF) ölçün, uzamsal çözünürlüğü ve sistem hizalamasını^{doğrulayın 12}.
      NOT: Bu sistemde, yarı maksimumda (FWHM) tam genişlik için temsili sonuçların analizi, sırasıyla 1,26 ± 0,15 ve 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 boncuk) yanal ve eksenel çözünürlükleri gösterir. Bu, görüntüleme derinliği boyunca tutarlı bir uzamsal çözünürlük önerir.
2. Monte edilmiş zebra balığı larvalı FEP tüpünü 6 eksenli (x, y, z, eğim, sapma ve yuvarlanma) motorlu numune tablasına güvenli bir şekilde takın ve tüpleri E3 suyla dolu numune haznesine daldırın. Yumurta sarısı kesesinin ışık saçmasını önlemek ve kalbin konumunu daha iyi bulmak için, zebra balığı larvalarını döndürerek ventral taraftan görüntü alın (Şekil 2B). Bu durumda, yakalanan görüntülerin çoğu hem ventrikülü hem de atriyumu içerecektir (Şekil 2C).
   NOT: Mevcut görüntüleme prosedürlerinin tipik olarak balık başına bir saatten az sürdüğü ve kontrollü bir oda sıcaklığı ortamında gerçekleştirildiği göz önüne alındığında, oda sıcaklığı kontrolü ve oksijen seviyesi düzenlemesi bu proje için isteğe bağlı olarak kabul edilir. Bununla birlikte, özellikle gelişimsel süreçlere odaklanan daha uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme çalışmaları için, zebra balığının fizyolojik ortamını sağlamak ve olası gelişimsel anormallikleri önlemek için numune odası içinde 27 ° C'de sürekli sıcaklık izleme ve düzenleme önerilmektedir.
3. Motorlu numune tablasını iş istasyonuna bağlayın ve istenen hareket modu da dahil olmak üzere gerekli tüm parametreleri yapılandırın.
4. sCMOS kamera ile iş istasyonu arasında bir bağlantı kurun. 5 ms'lik pozlama süresi ve istenen ilgi alanı gibi tüm temel ayarları yapın.
5. Özelleştirilmiş LabVIEW kontrol programı içindeki görüntü dizilerinin ve karelerin sayısını yapılandırın.
6. Lazeri açın ve numunenin LSM görüntülemesini başlatın. Tüm görüntü dizileri başarıyla kaydedilene kadar işlemi sürdürün.
7. Larvaların 3-5 kardiyak döngüsünü 200 kare/saniye kare hızıyla kapsayacak şekilde 2D görüntü dizisi olarak 300 kare kaydedin. Kayıt, ışık tabakası tarafından aydınlatılan seçici düzlemde kardiyak kasılmayı yakalar.
8. Numuneyi sanal olarak dilimlemek için larvayı ışık tabakası aydınlatması boyunca 1 μm'lik adım boyutunda hareket ettirin.
   NOT: Numune aşamasının adım boyutu, Nyquist-Shannon örnekleme teoremi¹² izlenerek hafif tabaka sisteminin eksenel çözünürlüğüne göre ayarlanmalıdır.
9. Tüm kalp kaplanana kadar yeni örnek dilimin başka bir görüntü dizisini kaydetmek için 7. adımı tekrarlayın. Genel olarak, 1 μm adım boyutuna sahip 100-200 görüntü dizisi, bir zebra balığı larvasının tüm kalbinin kapsanmasını sağlar (Şekil 2D).
   NOT: Adım 4.7-4.9, LabVIEW programı tarafından kontrol edilir ve LSM sistemi tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir (Şekil 3). Üretilen görüntü verilerinin büyük hacmi göz önüne alındığında, görüntü dizileri için standartlaştırılmış bir adlandırma kuralı önerilir. Örneğin, çeşitli görüntü dizileri arasında verileri kategorilere ayırmak için "z-1", "z-2" vb. adlara sahip klasörler atayın. Her dizide, görüntüler farklı zaman noktalarını belirtmek için sırayla adlandırılmalıdır (örneğin, "1", "2", ...). Bir zebra balığı larvası için balıkların montajı, görüntüleme açısının ayarlanması ve tüm verilerin toplanması için toplam süre yaklaşık 1 saattir.

5. Paralel hesaplama ile 4D görüntü rekonstrüksiyonu

Süre: 1 gün
NOT: Grubumuz tarafından geliştirilen 4D rekonstrüksiyon algoritması ve örnek veriler kamuya açıktır²¹. Bu yöntem, önceki adımlarda toplanan görüntü dizilerinden 4D kalp görüntüsünün yeniden oluşturulmasına olanak tanır (Tablo 1).

1. test_Parallel.m dosyasını MATLAB'da açın (Malzeme Tablosu'na bakın). Ham görüntü dizilerinin saklandığı klasör konumunu "baseDir" değişkeninde belirtin.
2. "numOfSlice" değişkenini toplam görüntü dizisi sayısıyla (genellikle 100-150) ve "numOfImage" değişkenini her dizideki görüntü sayısıyla (genellikle 300-500) atayın.
3. Zebra balığı kalbinin orta düzlemini gösteren görüntü dizisini inceleyin (örneğin, toplam 101 diziden 51^. dizi). Bu dizideki birinci ve dördüncü sistollerin çerçeve numaralarını belirleyin ve bunları systolicPoint_1st ve systolicPoint_4th değişkenlerine atayın.
4. İşlemi başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.
   NOT: Her bir görüntü dizisindeki kardiyak siklusun uzunluğu, ilk olarak MATLAB programı tarafından farklı zaman noktalarındaki görüntüler arasındaki benzerliğin (kare farkların toplamı) karşılaştırılmasıyla tanımlanacaktır. Daha sonra, kardiyak döngü, tüm görüntü dizilerinden döngü uzunluklarının ortalaması kullanılarak tahmin edilecektir. Daha sonra, farklı eksenel konumlardaki görüntü dizilerinin başlangıç noktaları, ilk görüntü dizisinden son görüntü dizisine görüntü benzerliğinin yinelemeli bir karşılaştırması yoluyla program tarafından hizalanacaktır.
5. Çıktı klasöründeki sonuçları kontrol edin. Program, görüntüleri zaman damgalı ".tif" dosyaları olarak kaydedecektir. Her ".tif" dosyası, belirli bir zaman noktasında bir 3D kalp görüntüsüdür. İki 3D görüntü arasındaki zaman aralığı, ayarlanan pozlama süresine eşittir.
   NOT: 4D (3D uzamsal + 1D zamansal) kardiyak kasılmaları tasvir etmek için önceki adımlardan elde edilen görüntüleri yeniden oluşturun. Geriye dönük eşitleme sırasında yüksek verimli araştırmalarda yeterliliği artırmak için bu yaklaşım, MATLAB paralel bilgi işlem araç kutusu aracılığıyla birden çok CPU çekirdeğinden yararlanarak ve görüntüleri gpuArray biçimine dönüştürerek bir GPU üzerinde eşzamanlı hesaplama işlemlerine olanak tanır.

6. 3D hücre segmentasyonu ve hücre takibi

Süre: 1 gün

1. 3DeeCellTracker paketini indirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve Python ortamını kurun²².
2. ITK-SNAP açıklama yazılımını²³ indirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve eğitim ve doğrulama veri kümelerini oluşturmak için 3D kalp görüntüsünü biri ventriküler diyastolde ve diğeri ventriküler sistolde olmak üzere seçilen iki zaman noktasında manuel olarak etiketlemek için kullanın.
   NOT: Diğer etiketleme yazılımları da geçerli olabilir.
3. Python'da, 3DeeCellTracker eğitim programını çalıştırın ve önceden tanımlanmış 3D U-Net modelini ayarlamak için TrainingUNet3D işlevinde noise_level(bu durumda 100), folder_path ve model parametrelerini başlatın.
4. MATLAB'da, eğitim ve doğrulama veri kümesini yükleme için uygun biçime dönüştürmek ve yeniden adlandırmak için imageDimConverter.m programını kullanın.
5. Python'da trainer.load_dataset() ve trainer.draw_dataset() işlevlerini kullanarak eğitim ve doğrulama veri kümelerini yükleyin.
6. Python'da, 3DeeCellTracker izleme programının ilk bölümünü çalıştırın ve parametreleri başlatın.
   NOT: Bu, görüntü boyutlarını karakterize etmek için görüntü parametrelerini, hücre segmentasyonu için uygulanan makine öğrenimi modelini seçmek için segmentasyon parametrelerini ve hücre kaydı için kullanılan önceden eğitilmiş derin sinir ağı modellerini seçmek için izleme parametrelerini tanımlamayı içerir. İlk kullanımda, hücre segmentasyonu için U-Net modelinin ve hücre kaydı için FFN+ PR-GLS'nin kullanılması önerilir. Verilerin, modellerin ve sonuçların bu adımda otomatik olarak oluşturulacak klasörlerde saklanması gerekir.
7. MATLAB'da, tüm 3B kalp görüntülerini uygun formata dönüştürmek ve yeniden adlandırmak ve bunları son adımda oluşturulan veri klasörüne aktarmak için imageDimConverter.m programını kullanın.
8. Python'da, segmentasyonu başlatmak için 3DeeCellTracker programının ikinci bölümünü çalıştırın.
9. İlk 3D görüntü bölümlere ayrıldıktan sonra, segmentasyon sonucunu ham görüntüyle karşılaştırın ve herhangi bir yanlış segmentasyon bulunursa manuel düzeltme yapın. Düzeltilmiş segmentasyonu oluşturulan "/manual_vol1" klasörüne taşıyın.
10. Python'da, tüm görüntüleri bölümlere ayırmak için 3DeeCellTracker programının üçüncü bölümünü çalıştırın.
11. İzlenen hücrelerin konumlarını karşılık gelen ham görüntülerle karşılaştırarak izleme sonuçlarının görsel bir değerlendirmesini yapmak için Amira'yı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Test sonuçları tatmin edici değilse, yordamı adım 6.6'dan yeniden başlatın, segmentasyon veya hücre kaydı için alternatif bir makine öğrenimi modeli kullanın ve ardından izleme işlemini yeniden başlatın.
    NOT: Segmentasyondan sonra, hücre etiketlerinin verileri varsayılan olarak 8 bitlik bir görüntü (0 - 255) olarak depolanır, bu da hücre sınıflandırması için etiket olarak yalnızca 256 ölçek sağlandığı anlamına gelir. Ek sınıflara ihtiyaç duyulduğunda bu sorunu çözmek için iki çözüm vardır. Çözümlerden biri, hücre etiketlerinin veri formatını izleme programında 16 bitlik bir görüntü olarak ayarlamaktır, bu da mevcut durumda işlem süresinde iki günden fazla üstel bir artışa neden olacaktır. Diğer çözüm, aynı etiketlere sahip hücreleri fiziksel konumlarına göre ayıracak ve her hücreye farklı bir etiket atayacak olan hücre etiketlerini sonradan işlemek için "separateTrackingResults.py" programını kullanmaktır. Bu durumda bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer.

7. Sanal gerçeklik modunda kardiyak kasılma analizi

Süre: 1 gün

1. Önceki adımlardan hücre izleme sonucunu alın.
2. Verileri manuel olarak doğrulayın ve tüm birimlerde tutarlı görüntü yoğunluğuna sahip hücreleri seçin (yaklaşık 600 hücreden yaklaşık 500'ü).
3. 3B Dilimleyici yazılımı 24 aracılığıyla her bir hücre için bir yüzey ağı oluşturmak ve her hücreye benzersiz bir renk kodu atamak için cellLabelsToObj.ipynb komut dosyası^21'i kullanın.
4. Tek bir zaman noktasındaki tüm hücrelerden oluşan her 3B modeli, hücre etiketini açıklamak için bir .mtl dosyasıyla birlikte birden çok alt nesneden oluşan tek bir .obj dosyası olarak dışa aktarın.
5. Genişletilmiş gerçeklik için kullanılan bir geliştirme altyapısı olan eğitim lisansını kullanarak modelleri Unity'ye aktarın.
6. 4B görselleştirme ve etkileşimli analize izin vermek için C# ile yazılmış işlevlerden oluşan özelleştirilmiş komut dosyalarını modellere ve kullanıcı arabirimi öğelerine uygulayın. Adım 7.7'yi izleyerek VR etkileşimi gerçekleştirin.
7. Aşağıdaki işlevleri kullanarak sanal gerçeklikteki (VR) modellerle etkileşim kurun (Şekil 4):
   1. Hücre seçimi: Bir seferde en fazla iki hücre seçin ve yörüngelerini, hızlarını, hacimlerini, yüzey alanlarını ve göreli mesafelerini görüntüleyin.
   2. Zaman noktası seçimi: Seçilen hücrelerin çıktılarını analiz etmek için verilerde belirli bir zaman noktası seçin, örneğin diyastol sırasında t = 0 ms veya sistol sırasında t = 200 ms.
   3. Zaman duraklatma: Seçili hücrelere ve çıktılarına odaklanmak için dinamik modeli dondurun.
   4. Kontrast: Modeldeki seçili hücreler ve çevresindeki hücreler arasındaki kontrastı modüle edin.

Sonuçlar

Mevcut protokol üç ana adımdan oluşmaktadır: zebra balığı hazırlama ve mikroenjeksiyon, ışık tabakası görüntüleme ve 4D görüntü rekonstrüksiyonu ve hücre izleme ve VR etkileşimi. Yetişkin zebra balıklarının çiftleşmesine izin verildi, döllenmiş yumurtalar toplandı ve önerilen deneyler için gerektiğinde mikroenjeksiyon yapıldı (Şekil 1). Bu adım, kardiyak gelişim ve rejenerasyonun araştırılmasında zebra balığı uygulamalarını keşfetmek için bir...

Tartışmalar

Zebra balığı modelinin mühendislik yöntemleriyle entegrasyonu, miyokard enfarktüsü, aritmiler ve konjenital kalp kusurlarının in vivo araştırılması için büyük bir potansiyele sahiptir. Optik şeffaflığından, rejeneratif kapasitesinden ve insanlarla genetik ve fizyolojik benzerliklerinden yararlanarak, zebra balığı embriyoları ve larvaları araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır ^1,2,4

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S