Imagerie 4D de la contraction cardiaque du poisson-zèbre

Résumé

Ce protocole utilise l’imagerie par feuille de lumière pour étudier la fonction contractile cardiaque chez les larves de poisson-zèbre et mieux comprendre la mécanique cardiaque grâce au suivi cellulaire et à l’analyse interactive.

Résumé

Le poisson-zèbre est un organisme modèle intrigant connu pour sa remarquable capacité de régénération cardiaque. L’étude de la contraction du cœur in vivo est essentielle pour mieux comprendre les changements structurels et fonctionnels en réponse aux blessures. Cependant, l’obtention d’images en 4 dimensions (4D, 3D spatiale + 1D temporelle) à haute résolution et à grande vitesse du cœur du poisson-zèbre pour évaluer l’architecture et la contractilité cardiaques reste difficile. Dans ce contexte, un microscope à feuillet de lumière (LSM) interne et une analyse informatique personnalisée sont utilisés pour surmonter ces limitations techniques. Cette stratégie, impliquant la construction de systèmes LSM, la synchronisation rétrospective, le suivi de cellules uniques et l’analyse dirigée par l’utilisateur, permet d’étudier la microstructure et la fonction contractile dans l’ensemble du cœur à la résolution d’une seule cellule chez les larves transgéniques de poisson-zèbre Tg(myl7 :nucGFP). De plus, nous sommes en mesure d’incorporer davantage la micro-injection de composés à petites molécules pour induire des lésions cardiaques de manière précise et contrôlée. Dans l’ensemble, ce cadre permet de suivre les changements physiologiques et physiopathologiques, ainsi que la mécanique régionale au niveau de la cellule unique au cours de la morphogenèse et de la régénération cardiaques.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme modèle largement utilisé pour étudier le développement, la physiologie et la réparation cardiaques en raison de sa transparence optique, de sa traçabilité génétique et de sa capacité de régénération 1,2,3,4. Lors d’un infarctus du myocarde, alors que les changements structurels et fonctionnels ont un impact sur l’éjection cardiaque et l’hémodynamique, les limitations techniques continuent d’entraver la capacité d’étudier le processus dynamique pendant la régénération cardiaque avec une résolution spatio-temporelle élevée. Par exemple, les méthodes d’imagerie conventionnelles, telles que la microscopie confocale, ont des limites en termes de profondeur d’imagerie, de résolution temporelle ou de phototoxicité pour capturer les changements dynamiques et évaluer la fonction contractile cardiaque au cours de cycles cardiaques multiples⁵.

La microscopie à feuillet de lumière représente une méthode d’imagerie de pointe qui résout avec succès ces problèmes en balayant rapidement le laser sur le ventricule et l’oreillette du cœur, obtenant des images détaillées avec une résolution spatio-temporelle améliorée et des effets photo-blanchissants et phototoxiques négligeables 6,7,8,9,10,11.

Ce protocole introduit une stratégie d’imagerie complète qui comprend la construction du système LSM, la reconstruction d’images 4D, le suivi cellulaire 3D et l’analyse interactive pour capturer et analyser la dynamique des cardiomyocytes dans l’ensemble du cœur pendant plusieurs cycles cardiaques¹². Le système d’imagerie personnalisé et la méthodologie de calcul permettent de suivre la microstructure myocardique et la fonction contractile au niveau de la cellule unique chez les larves transgéniques de poisson-zèbre Tg(myl7 :nucGFP). De plus, des composés à petites molécules ont été administrés aux embryons par microinjection pour évaluer les lésions cardiaques induites par les médicaments et la régénération ultérieure. Cette stratégie holistique fournit un point d’entrée pour étudier in vivo les propriétés structurelles, fonctionnelles et mécaniques du myocarde au niveau de la cellule unique au cours du développement et de la régénération cardiaques.

Protocole

L’approbation de cette étude a été accordée par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Texas à Dallas, sous le numéro de protocole #20-07. Des larves de poisson-zèbre transgénique Tg(myl7 :nucGFP) ¹² ont été utilisées pour la présente étude. L’ensemble de l’acquisition des données et du post-traitement des images a été réalisé à l’aide de logiciels ou de plateformes open source disposant de licences de recherche ou d’enseignement. Les ressources sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

1. Élevage de poissons-zèbres et micro-injection d’embryons

Durée : 2 jours

1. Maintenir et élever des poissons-zèbres adultes grâce à des procédures de soins et de race standard. Pour les méthodes détaillées, voir le rapport précédent¹³.
2. Effectuer la micro-injection en suivant le protocole^{établi 14}. Pour la présente étude, la micro-injection a été réalisée au stade 1-2 cellules (zygote).
   REMARQUE : Il est crucial d’identifier avec précision cette étape pour une micro-injection efficace et d’assurer la cohérence du développement. Au cours de la phase unicellulaire, un petit dôme se forme au sommet du jaune, et cette étape dure généralement environ 12 minutes. En progressant vers le stade à deux cellules, deux dômes adjacents deviennent visibles, et ce stade dure environ 45 minutes après la fécondation¹⁵. Des informations plus détaillées sur la construction du système peuvent être trouvées dans d’autres rapports ou protocoles 12,16,17.

2. Préparation et montage des embryons/larves de poisson-zèbre

Délai : 7 jours

1. Transférer les embryons 1 jour après la fécondation (dpf) dans de l’eau E3 avec 0,2 mM de 1-phényl-2-thiourée (PTU) (voir le tableau des matériaux) pour prévenir la formation de pigments.
2. Remplacez le milieu par de l’eau fraîche E3 avec du PTU tous les jours jusqu’à l’imagerie LSM.
3. Imagez les embryons ou les larves au stéréomicroscope pour enregistrer leur développement aux points temporels souhaités entre 0 et 7 dpf.
4. Préparer des tubes segmentés d’éthylène-propylène fluoré (FEP) de 2 mm de diamètre intérieur pour l’enrobage des larves de poisson-zèbre dans le système LSM¹².
   REMARQUE : Le tube FEP est utilisé pour fixer l’échantillon avec des matériaux correspondant à l’indice de réfraction qui ressemblent étroitement au milieu environnant, comme l’eau.
5. À partir de 3 dpf, transférer les poissons dans une solution de tricaïne (MS-222) à 150 mg/L (voir le tableau des matériaux) pour immobiliser les poissons avant l’imagerie.
6. Préparer de l’agarose à bas point de fusion à 0,8 % avec 150 mg/L de tricaïne et utiliser une pipette de transfert pour déplacer les poissons anesthésiés vers l’agarose une fois qu’elle a refroidi à température ambiante¹⁸.
7. Utilisez une autre pipette de transfert pour monter le poisson avec de l’agarose dans des tubes FEP (figure 1).
   NOTE : Pour s’assurer du stress minimal chez les embryons en développement, des examens pré et post-fixation de l’activité cardiaque, tels que la fréquence cardiaque, ont été effectués sous observation microscopique. Ces évaluations visaient à identifier toute différence significative avant et après l’anesthésie à la tricaïne. Un examen supplémentaire de la peau et de la musculature pour détecter des irrégularités dans la structure cardiaque, telles qu’un œdème, pourrait également être effectué après la fixation. La concentration de tricaïne joue également un rôle crucial dans l’imagerie cardiaque¹⁹, et donc la solution de tricaïne à concentration de 150 mg/L a été utilisée pour l’imagerie de la contraction chez les larves de poisson-zèbre dans ce projet. Alors que la présente synchronisation rétrospective nous permet de traiter les battements cardiaques irréguliers²⁰, une solution complète pour l’imagerie 4D des arythmies cardiaques et l’imagerie à long terme chez le poisson zèbre est toujours en cours de développement.

3. Installation et configuration du système d’imagerie à feuille de lumière

Durée : 3-14 jours

1. Construire un système LSM interne basé sur une lentille cylindrique en utilisant des systèmes laser à semi-conducteurs à diode à ondes continues (DPSS) à des longueurs d’onde spécifiques telles que 473 nm et 532 nm comme sources d’éclairage (Figure 2A).
2. Personnalisez les codes de contrôle LabVIEW (voir Table des matériaux) pour la synchronisation de l’étage d’échantillonnage translationnel, de l’éclairage de la feuille de lumière et de l’exposition de la caméra sCMOS pour capturer des séquences d’images.
   REMARQUE : Des informations plus détaillées sur la construction du système peuvent être trouvées dans d’autres rapports ou protocoles 12,16,17. Nous encourageons les groupes de recherche à rechercher des opportunités de collaboration avec des laboratoires qui possèdent une expertise établie en imagerie optique lors de la construction de systèmes.

4. Préparation de l’imagerie du poisson-zèbre et collecte de données

Durée : 1 jour

1. Calibrez la résolution spatiale du système LSM et minimisez les variations d’opacité à différentes profondeurs en mesurant les billes de fluorescence.
   1. Tout d’abord, diluer des billes fluorescentes (voir Tableau des matériaux) d’un diamètre de 0,53 μm à une concentration de 1 :1,5 x 10⁵ à l’aide d’une agarose à bas point de fusion à 0,8 % et transférer la solution dans le tube FEP segmenté.
   2. Deuxièmement, utilisez le système LSM pour imager les billes et mesurer la fonction d’étalement des points (PSF) sur l’ensemble de l’échantillon, validant la résolution spatiale et l’alignement du système¹².
      NOTE : Dans ce système, l’analyse des résultats représentatifs pour la pleine largeur à mi-maximum (FWHM) indique des résolutions latérales et axiales de 1,26 ± 0,15 et 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 billes), respectivement. Cela suggère une résolution spatiale constante sur toute la profondeur d’imagerie.
2. Fixez solidement le tube FEP avec la larve de poisson-zèbre montée à la platine d’échantillonnage motorisée à 6 axes (x, y, z, tangage, lacet et roulis) et immergez les tubes dans la chambre d’échantillonnage remplie d’eau E3. Pour éviter la diffusion de la lumière par le sac vitellin et mieux localiser la position du cœur, faites pivoter la larve de poisson-zèbre pour prendre l’image de la face ventrale (Figure 2B). Dans ce cas, la plupart des images capturées incluraient à la fois le ventricule et l’oreillette (Figure 2C).
   REMARQUE : Étant donné que les procédures d’imagerie actuelles durent généralement moins d’une heure par poisson et sont effectuées dans un environnement à température ambiante contrôlée, le contrôle de la température de la chambre et la régulation du niveau d’oxygène sont jugés facultatifs pour ce projet. Cependant, pour les études d’imagerie à plus long terme, en particulier celles axées sur les processus de développement, une surveillance et une régulation continues de la température à 27 °C dans la chambre d’échantillonnage sont suggérées pour assurer l’environnement physiologique du poisson-zèbre et prévenir toute anomalie potentielle du développement.
3. Connectez la platine d’échantillonnage motorisée au poste de travail et configurez tous les paramètres nécessaires, y compris le mode de déplacement souhaité.
4. Établissez une connexion entre la caméra sCMOS et le poste de travail. Ajustez tous les paramètres essentiels, tels qu’un temps d’exposition de 5 ms et la région d’intérêt souhaitée.
5. Configurez le nombre de séquences d’images et d’images dans le programme de contrôle LabVIEW personnalisé.
6. Allumez le laser et lancez l’imagerie LSM de l’échantillon. Maintenez le processus jusqu’à ce que toutes les séquences d’images aient été enregistrées avec succès.
7. Enregistrez 300 images sous forme de séquence d’images 2D pour couvrir 3 à 5 cycles cardiaques de la larve avec une fréquence d’images de 200 images/seconde. L’enregistrement capture la contractilité cardiaque au niveau du plan sélectif éclairé par la feuille de lumière.
8. Déplacez la larve à la taille de 1 μm à travers l’éclairage de la feuille de lumière pour découper virtuellement l’échantillon.
   REMARQUE : La taille du pas de la platine d’échantillonnage doit être définie en fonction de la résolution axiale du système de feuillet de lumière, conformément au théorème^{d’échantillonnage de} Nyquist-Shannon 12.
9. Répétez l’étape 7 pour enregistrer une autre séquence d’images de la nouvelle tranche d’échantillon jusqu’à ce que tout le cœur soit couvert. Généralement, 100 à 200 séquences d’images avec une taille de pas de 1 μm assurent la couverture de tout le cœur d’une larve de poisson-zèbre (Figure 2D).
   REMARQUE : Les étapes 4.7 à 4.9 sont contrôlées par le programme LabVIEW et exécutées automatiquement par le système LSM (Figure 3). Compte tenu du volume important de données d’images générées, une convention de dénomination normalisée est recommandée pour les séquences d’images. Par exemple, désignez des dossiers portant des noms tels que « z-1 », « z-2 », etc., pour classer les données dans différentes séquences d’images. Dans chaque séquence, les images doivent être nommées séquentiellement (par exemple, « 1 », « 2 », ...) pour indiquer des points temporels distincts. Le temps total pour monter le poisson, ajuster l’angle d’imagerie et collecter toutes les données pour une larve de poisson-zèbre est d’environ 1 h.

5. Reconstruction d’images 4D avec calcul parallèle

Durée : 1 jour
NOTE : L’algorithme de reconstruction 4D développé par notre groupe et les données d’échantillon sont accessibles au public²¹. Cette méthode permet de reconstruire l’image du cœur 4D à partir des séquences d’images collectées dans les étapes précédentes (Tableau 1).

1. Ouvrez le fichier test_Parallel.m dans MATLAB (voir Table of Materials). Spécifiez l’emplacement du dossier dans lequel les séquences d’images brutes sont stockées dans la variable « baseDir ».
2. Attribuez la variable « numOfSlice » au nombre total de séquences d’images (généralement 100-150) et la variable « numOfImage » au nombre d’images (généralement 300-500) dans chaque séquence.
3. Inspectez la séquence d’images qui montre le plan médian du cœur du poisson-zèbre (par exemple, la 51^e séquence sur 101 séquences au total). Identifiez les numéros d’image des première et quatrième systoles de cette séquence et attribuez-les aux variables systolicPoint_1st et systolicPoint_4th.
4. Cliquez sur Exécuter pour lancer le processus.
   REMARQUE : la durée du cycle cardiaque dans chaque séquence d’images sera d’abord identifiée par le programme MATLAB en comparant la similarité (somme des différences au carré) entre les images à différents moments. Par la suite, le cycle cardiaque sera estimé à l’aide de la moyenne des durées de cycle de toutes les séquences d’images. Ensuite, les points de départ des séquences d’images à différents endroits axiaux seront alignés par le programme grâce à une comparaison itérative de la similitude des images de la première séquence d’images à la dernière séquence d’images.
5. Vérifiez les résultats dans le dossier de sortie. Le programme enregistrera les images sous forme de fichiers « .tif » avec des horodatages. Chaque fichier « .tif » est une image de cœur 3D à un moment précis. L’intervalle de temps entre deux images 3D est égal au temps d’exposition défini.
   REMARQUE : Reconstruisez les images acquises lors des étapes précédentes pour représenter les contractions cardiaques 4D (3D spatiale + 1D temporelle). Pour améliorer les compétences dans les investigations à haut débit lors de la synchronisation rétrospective, cette approche permet des opérations de calcul simultanées sur un GPU en exploitant plusieurs cœurs CPU via la boîte à outils de calcul parallèle MATLAB et en transformant les images au format gpuArray.

6. 3D segmentation et suivi des cellules

Durée : 1 jour

1. Téléchargez le package 3DeeCellTracker (voir Table of Materials) et configurez l’environnement Python²².
2. Téléchargez le logiciel d’annotation ITK-SNAP²³ (voir Tableau des matériaux) et utilisez-le pour étiqueter manuellement l’image cardiaque 3D à deux moments sélectionnés, l’un au niveau de la diastole ventriculaire et l’autre au niveau de la systole ventriculaire, afin de créer les ensembles de données d’entraînement et de validation.
   REMARQUE : D’autres logiciels d’étiquetage peuvent également être applicables.
3. En Python, exécutez le programme d’entraînement 3DeeCellTracker et initialisez les paramètres noise_level(100 dans ce cas), folder_path et modèle dans la fonction TrainingUNet3D pour définir le modèle 3D U-Net prédéfini.
4. Dans MATLAB, utilisez le programme imageDimConverter.m pour convertir et renommer le jeu de données d’entraînement et de validation au format approprié pour le chargement.
5. En Python, chargez les jeux de données d’entraînement et de validation à l’aide des fonctions trainer.load_dataset() et trainer.draw_dataset().
6. En Python, lancez la première partie du programme de suivi 3DeeCellTracker et initialisez les paramètres.
   REMARQUE : Cela inclut la définition de paramètres d’image pour caractériser les dimensions de l’image, les paramètres de segmentation pour sélectionner le modèle d’apprentissage automatique appliqué à la segmentation cellulaire et les paramètres de suivi pour sélectionner les modèles de réseau neuronal profond pré-entraînés utilisés pour l’enregistrement des cellules. Pour la première utilisation, il est recommandé d’utiliser le modèle U-Net pour la segmentation des cellules et FFN+ PR-GLS pour le repérage des cellules. Il est nécessaire de stocker les données, le modèle et les résultats dans des dossiers qui seront automatiquement créés à cette étape.
7. Dans MATLAB, utilisez le programme imageDimConverter.m pour convertir et renommer toutes les images 3D du cœur au format approprié et les transférer dans le dossier de données créé à la dernière étape.
8. En Python, exécutez la deuxième partie du programme 3DeeCellTracker pour lancer la segmentation.
9. Une fois la première image 3D segmentée, comparez le résultat de la segmentation avec l’image brute et effectuez une correction manuelle si une segmentation incorrecte est détectée. Déplacez la segmentation corrigée vers le dossier « /manual_vol1 » créé.
10. En Python, exécutez la troisième partie du programme 3DeeCellTracker pour segmenter toutes les images.
11. Utilisez Amira (voir Tableau des matériaux) pour effectuer une évaluation visuelle des résultats du suivi en comparant les positions des cellules suivies avec leurs images brutes correspondantes. Si les résultats des tests ne sont pas satisfaisants, recommencez la procédure à partir de l’étape 6.6, utilisez un autre modèle d’apprentissage automatique pour la segmentation ou l’enregistrement des cellules, puis relancez le processus de suivi.
    REMARQUE : Après la segmentation, les données des étiquettes de cellule sont stockées sous forme d’image 8 bits (0 à 255) par défaut, ce qui signifie que seules 256 échelles sont fournies comme étiquettes pour la classification des cellules. Il existe deux solutions pour résoudre ce problème lorsque des cours supplémentaires sont nécessaires. Une solution consiste à définir le format des données des étiquettes de cellules sous forme d’image 16 bits dans le programme de suivi, ce qui entraînera une augmentation exponentielle du temps de traitement, plus de deux jours dans le cas présent. L’autre solution consiste à utiliser le programme « separateTrackingResults.py » pour post-traiter les étiquettes des cellules, qui séparera les cellules avec les mêmes étiquettes en fonction de leur emplacement physique et attribuera à chaque cellule une étiquette différente. Ce processus prend environ 10 minutes dans ce cas.

7. Analyse de la contractilité cardiaque en mode réalité virtuelle

Durée : 1 jour

1. Obtenir le résultat du suivi des cellules des étapes précédentes.
2. Validez manuellement les données et sélectionnez les cellules avec une intensité d’image constante sur tous les volumes (environ 500 cellules sur environ 600).
3. Utilisez le script cellLabelsToObj.ipynb ²¹ pour générer un maillage de surface pour chaque cellule individuelle via le logiciel 3D Slicer²⁴ (voir la Table des matériaux) et attribuez un code couleur unique à chaque cellule.
4. Exportez chaque modèle 3D, composé de toutes les cellules d’un seul point temporel, sous la forme d’un seul fichier .obj composé de plusieurs sous-objets accompagnés d’un fichier .mtl pour décrire l’étiquette de la cellule.
5. Importez les modèles dans Unity à l’aide de la licence éducative, un moteur de développement utilisé pour la réalité étendue.
6. Appliquez les scripts personnalisés composés de fonctions écrites en C# aux modèles et aux éléments de l’interface utilisateur pour permettre la visualisation 4D et l’analyse interactive. Effectuez une interaction VR en suivant l’étape 7.7.
7. Interagissez avec les modèles en réalité virtuelle (VR) à l’aide des fonctions suivantes (Figure 4) :
   1. Sélection de cellules : sélectionnez jusqu’à deux cellules à la fois et affichez leurs trajectoires, vitesses, volumes, surfaces et distances relatives.
   2. Sélection de points temporels : choisissez un point temporel spécifique dans les données pour analyser les sorties des cellules sélectionnées, par exemple à t = 0 ms pendant la diastole, ou à t = 200 ms pendant la systole.
   3. Pause temporelle : figez le modèle dynamique pour vous concentrer sur les cellules sélectionnées et leurs sorties.
   4. Contraste : Modulez le contraste entre les cellules sélectionnées et les cellules environnantes dans le modèle.

Résultats

Le protocole actuel se compose de trois étapes principales : la préparation et la micro-injection de poisson-zèbre, l’imagerie par feuille de lumière et la reconstruction d’images 4D, ainsi que le suivi cellulaire et l’interaction VR. Les poissons-zèbres adultes ont été autorisés à s’accoupler, les œufs fécondés ont été collectés et ont effectué des micro-injections au besoin pour les expériences proposées (Figure 1). Cette étape fournit un point d’entrée pour e...

Discussion

L’intégration du modèle du poisson-zèbre aux méthodes d’ingénierie présente un immense potentiel pour l’exploration in vivo de l’infarctus du myocarde, des arythmies et des malformations cardiaques congénitales. Tirant parti de sa transparence optique, de sa capacité de régénération et de ses similitudes génétiques et physiologiques avec les humains, les embryons et les larves de poisson-zèbre sont devenus largement utilisés dans la recherche ^1,2,4

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S