Imagerie 4D de la contraction cardiaque du poisson-zèbre

Résumé

Ce protocole utilise l’imagerie par feuille de lumière pour étudier la fonction contractile cardiaque chez les larves de poisson-zèbre et mieux comprendre la mécanique cardiaque grâce au suivi cellulaire et à l’analyse interactive.

Résumé

Le poisson-zèbre est un organisme modèle intrigant connu pour sa remarquable capacité de régénération cardiaque. L’étude de la contraction du cœur in vivo est essentielle pour mieux comprendre les changements structurels et fonctionnels en réponse aux blessures. Cependant, l’obtention d’images en 4 dimensions (4D, 3D spatiale + 1D temporelle) à haute résolution et à grande vitesse du cœur du poisson-zèbre pour évaluer l’architecture et la contractilité cardiaques reste difficile. Dans ce contexte, un microscope à feuillet de lumière (LSM) interne et une analyse informatique personnalisée sont utilisés pour surmonter ces limitations techniques. Cette stratégie, impliquant la construction de systèmes LSM, la synchronisation rétrospective, le suivi de cellules uniques et l’analyse dirigée par l’utilisateur, permet d’étudier la microstructure et la fonction contractile dans l’ensemble du cœur à la résolution d’une seule cellule chez les larves transgéniques de poisson-zèbre Tg(myl7 :nucGFP). De plus, nous sommes en mesure d’incorporer davantage la micro-injection de composés à petites molécules pour induire des lésions cardiaques de manière précise et contrôlée. Dans l’ensemble, ce cadre permet de suivre les changements physiologiques et physiopathologiques, ainsi que la mécanique régionale au niveau de la cellule unique au cours de la morphogenèse et de la régénération cardiaques.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme modèle largement utilisé pour étudier le développement, la physiologie et la réparation cardiaques en raison de sa transparence optique, de sa traçabilité génétique et de sa capacité de régénération 1,2,3,4. Lors d’un infarctus du myocarde, alors que les changements structurels et fonctionnels ont un impact sur l’éjection cardiaque et l’hémodynamique, les limitations techniques continuent d’entraver la capacité d’étudier le processus dynamique pendant la régénération cardiaque avec une....

Protocole

L’approbation de cette étude a été accordée par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Texas à Dallas, sous le numéro de protocole #20-07. Des larves de poisson-zèbre transgénique Tg(myl7 :nucGFP) ¹² ont été utilisées pour la présente étude. L’ensemble de l’acquisition des données et du post-traitement des images a été réalisé à l’aide de logiciels ou de plateformes open source disposant de licences de recherche ou d’enseignement. Les ressources sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

1. Élevage de poissons-zèbres et micro-injection d’embryons

Discussion

L’intégration du modèle du poisson-zèbre aux méthodes d’ingénierie présente un immense potentiel pour l’exploration in vivo de l’infarctus du myocarde, des arythmies et des malformations cardiaques congénitales. Tirant parti de sa transparence optique, de sa capacité de régénération et de ses similitudes génétiques et physiologiques avec les humains, les embryons et les larves de poisson-zèbre sont devenus largement utilisés dans la recherche ^1,2,4

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RESOURCE	SOURCE/Reference	IDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish	Burns Lab in Boston Children's Hospital	ZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLAB	The MathWorks Inc.	R2023a
LabVIEW	National Instruments Corporation	2017 SP1
HCImage Live	Hamamatsu Photonics	4.6.1.2
Python	The Python Software Foundation	3.9.0
Fiji-ImageJ	Schneider et al.18	1.54f
3DeeCellTracker	Chentao Wen et al.15	v0.5.2
Unity	Unity Software Inc.	2020.3.2f1
Amira	Thermo Fisher Scientific	2021.2
3D Slicer	Andriy Fedorov et al.17	5.2.1
ITK SNAP	Paul A Yushkevich et al.16	4
Light-sheet system
Cylindrical lens	Thorlabs	ACY254-050-A
4X Illumination objective	Nikon	MRH00045
20X Detection objective	Olympus	1-U2M585
sCMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
Motorized XYZ stage	Thorlabs	PT3/M-Z8
Two-axis tilt stage	Thorlabs	GN2/M
Rotation stepper motor	Pololu	1474
Fluorescent beads	Spherotech	FP-0556-2
473nm DPSS Laser	Laserglow	R471003GX
532nm DPSS laser	Laserglow	R531003FX
Microinjector and vacuum pump
Microinjector	WPI	PV850
Vacuum pump	Welch	2522B-01
Pre-Pulled Glass Pipettes	WPI	TIP10LT
Capillary tip for gel loading	Bio-Rad	2239912
Virtual reality hardware
VR headset	Meta	Quest 2
30mg/L PTU solution
PTU	Sigma-Aldrich	P7629
1X E3 working solution	-	-
1% Agarose	-	-
Low-melt agarose	Thermo Fisher	16520050
Deionized water	-	-
10g/L Tricaine stock solution
Tricaine	Syndel	SYNC-M-GR-US02
Deionized water	-	-
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution	-	-
Deionized water	-	-
60X E3 stock solution
Sodium Chloride	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	NaCl
Potassium Chloride	-	KCL
Calcium Chloride Dihydrate	-	CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate	-	MgSO4 x 7H2O
RO Water	-	-
1X E3 working solution
60X E3 stock solution	Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas	-
RO Water	-	-
1% Methylene Blue (optional)	-	C16H18ClN3S