基底膜基质用于人类干细胞维持和肠道类器官生成的比较研究

摘要

类器官已成为疾病建模的宝贵工具。细胞外基质 （ECM） 在类器官生成过程中指导细胞命运，使用类似于天然组织的系统可以提高模型的准确性。这项研究比较了动物源性 ECM 和无异种水凝胶中诱导多能干细胞衍生的人肠道类器官的产生。

摘要

细胞外基质（ECM）在细胞行为和发育中起着关键作用。由人类诱导多能干细胞 （hiPSC） 产生的类器官是许多研究领域的焦点。然而，经典细胞培养材料中缺乏生理线索阻碍了有效的iPSC分化。将市售的ECM掺入干细胞培养中，可提供有益于细胞维持的物理和化学线索。动物源性市售基底膜产品由支持细胞维持的 ECM 蛋白和生长因子组成。由于 ECM 具有可以调节细胞命运的组织特异性，因此无异种基质用于将翻译上级到临床研究。虽然市售基质广泛用于 hiPSC 和类器官工作，但这些基质的等效性尚未得到评估。在这里，进行了四种不同基质中hiPSC维持和人肠道类器官（hIO）生成的比较研究：Matrigel（Matrix 1-AB）、Geltrex（Matrix 2-AB）、Cultrex（Matrix 3-AB）和VitroGel（Matrix 4-XF）。尽管这些菌落缺乏完美的圆形形状，但自发分化极小，超过85%的细胞表达干细胞标记物SSEA-4。基质 4-XF 导致 3D 圆形团块的形成。此外，在用于制备 Matrix 4-XF 水凝胶溶液的培养基中增加补充剂和生长因子的浓度可将 SSEA-4 的 hiPSC 表达提高 1.3 倍。与其他动物源性基底膜相比，基质 2-AB 维持的 hiPSC 的分化导致中/后肠阶段的球状体释放减少。与其他基质相比，无异种有机体基质（基质 4-O3）导致更大、更成熟的 hIO，这表明可以利用无异种水凝胶的物理特性来优化类器官的生成。总而言之，结果表明，不同基质组成的变化会影响IO分化的阶段。这项研究提高了人们对商用基质差异的认识，并为 iPSC 和 IO 工作期间的基质优化提供了指导。

引言

细胞外基质 （ECM） 是组织的动态和多功能组成部分，在调节细胞行为和发育方面发挥着核心作用。作为一个复杂的网络，它提供结构支持、细胞粘附配体¹ 以及调节细胞信号传导的生长因子和细胞因子的储存。例如，在伤口愈合过程中，ECM 充当迁移细胞的支架和参与组织修复的生长因子的储存库²。同样，ECM 中的失调会导致各种疾病（如纤维化和癌症）的严重程度增加 ^3,4。在胚胎发育过程中，ECM指导组织形态发生。例如，在心脏的发育中，ECM 组件在创建心脏组织的正确结构和功能方面发挥作用⁵.十多年的研究表明^，仅微环境的硬度^6,7就可以控制干细胞谱系规格。因此，在体外细胞分化过程中，ECM通过提供分化信号来影响干细胞的命运也就不足为奇了。

类器官可以由诱导多能干细胞 （iPSC） 产生。从正确表征的 iPSC 系开始，需要成功生成类器官。然而，经典细胞培养材料中缺乏生理线索阻碍了有效的 iPSC 分化和类器官生成。此外，最近的研究强调了细胞外基质 （ECM） 组成、细胞与 ECM

研究方案

1. hiPSC维持

注意：所有工作均在生物安全柜 （BSC） 中按照标准无菌技术完成。必须遵守 OSHA 实验室安全标准，包括正确使用实验室外套、手套和护目镜等个人防护设备。

1. 基质、等分试样和细胞培养基的制备
   1. 用于市售的动物源性基底膜（BMs;基质 1-AB、基质 2-AB、基质 3-AB），按照 表 1 中总结的制造商建议制备工作体积的等分试样，并将它们储存在 -20 °C 或 -80 °C 下以进行长期储存。避免气泡的形成。如果形成一些气泡，在储存之前，将样品在4°C，<200×g离心 ~ 1-2分钟，以迫使气泡到达表面。
      注意：制作一次性等分试样有助于避免破坏 ECM 架构的重复冻融循环。由于 BM 浓度随批号而变化，因此请务必遵循制造商的建议制备一次性等分试样并制备包衣溶液。高浓度的 BM 是粘稠的，难以移液;使用先前储存在-20°C的冷头。
   2. 按照制造商的建议制备干细胞培养基。为了制备本协议中使用的特定市售完全培养基，将 100 mL 5x 补充剂混合物加入 400 mL 基础培养基中。然后，将该培养基彻底混合并分装成40mL体积，储存在20°C下。 使用时，解冻每个等分试样的完全培养基，立即使用等分的完全培养基，或在2-8°C下储存长达2周。请勿重新冷冻。
   3. 制备含有 3 倍浓度的补充混合物的干细胞....

结果

按照该方案，成功地利用市售的基底膜和无异种水凝胶系统来培养hiPSC细胞并将它们分化为hIO。这些实验的主要目的是系统地评估来自各种来源的基质对hiPSC和hIO工作的等效性。该协议的第一部分侧重于维持和表征健康的 iPSC 培养物，该培养物可产生有效的肠道类器官。描述了用动物源性基质基质 Matrix 1-AB、Matrix 2-AB 和 Matrix 3-AB 包被培养皿的过程，并与无异种水凝胶系统 Matrix 4-XF 进行了比较。

.......

讨论

在将这些平台用于广泛的应用时，为干细胞和类器官工作选择最佳微环境是关键的早期步骤。我们的代表性结果表明，基质 4-XFO3 与更高浓度的生长因子相结合，可产生更大的类器官，这表明可以利用无异种水凝胶的物理特性来优化使用这些系统的类器官生成。先前已经表明，细胞外基质 （ECM） 的独特特性与器官¹² 内细胞的身份密切相关。由于细胞通过整合素和其他受体感知外.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K