Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Органоиды стали ценными инструментами для моделирования заболеваний. Внеклеточный матрикс (ВКМ) управляет судьбой клетки во время генерации органоидов, и использование системы, напоминающей нативную ткань, может повысить точность модели. В этом исследовании сравнивается генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из кишечных органоидов человека, в ВКМ животного происхождения и гидрогелях, не содержащих ксено.
Внеклеточный матрикс (ВКМ) играет решающую роль в поведении и развитии клеток. Органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), находятся в центре внимания многих областей исследований. Тем не менее, отсутствие физиологических сигналов в материалах классических клеточных культур препятствует эффективной дифференцировке iPSC. Включение коммерчески доступной ЭКМ в культуру стволовых клеток дает физические и химические сигналы, полезные для поддержания клеток. Коммерчески доступные продукты базальной мембраны животного происхождения состоят из белков ВКМ и факторов роста, которые поддерживают поддержание клеток. Поскольку ВКМ обладает тканеспецифичными свойствами, которые могут модулировать судьбу клеток, матрицы, свободные от ксеносов, используются для трансляции в клинические исследования. В то время как коммерчески доступные матрицы широко используются в работе с гиперПСК и органоидами, эквивалентность этих матриц еще не была оценена. Здесь было проведено сравнительное исследование поддержания hiPSC и генерации кишечных органоидов (hIO) человека в четырех различных матрицах: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) и VitroGel (Matrix 4-XF). Несмотря на то, что колонии не имели идеально круглой формы, спонтанная дифференцировка была минимальной, при этом более 85% клеток экспрессировали маркер стволовых клеток SSEA-4. Матрица 4-XF привела к образованию 3D круглых глыб. Кроме того, увеличение концентрации добавок и факторов роста в средах, используемых для изготовления раствора гидрогеля Matrix 4-XF, улучшило экспрессию SSEA-4 в 1,3 раза. Дифференциация ИПСК, поддерживаемого Matrix 2-AB, привела к меньшему количеству высвобождений сфероидов на средней/задней стадии кишечника по сравнению с другими базальными мембранами животного происхождения. По сравнению с другими, матрица органоидов, свободных от ксеносов (матрица 4-O3), приводит к увеличению размера и повышению зрелости гидрогелей, что позволяет предположить, что физические свойства гидрогелей, не содержащих ксено, могут быть использованы для оптимизации генерации органоидов. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что вариации в составе различных матриц влияют на стадии дифференцировки IO. Это исследование повышает осведомленность о различиях в коммерчески доступных матрицах и предоставляет руководство по оптимизации матриц во время работы с iPSC и IO.
Внеклеточный матрикс (ВКМ) является динамичным и многофункциональным компонентом тканей, который играет центральную роль в регулировании поведения и развития клеток. Будучи сложной сетью, она обеспечивает структурную поддержку, клеточные адгезивные лиганды1 и хранение факторов роста и цитокинов, которые регулируют клеточную сигнализацию. Например, во время заживления ран ВКМ служит каркасом для мигрирующих клеток и резервуаром факторов роста, участвующих в восстановлении тканей2. Аналогичным образом, нарушение регуляции в ВКМ может привести к увеличению тяжести различных заболеваний, таких как фиброз и рак
1. Обслуживание hiPSC
ВНИМАНИЕ: Все работы выполняются в шкафу биобезопасности (BSC) в соответствии со стандартными асептическими методами. Необходимо соблюдать стандарты безопасности OSHA для лабораторий, включая надлежащее использование средств индивидуальной защиты, таких как лабораторные халаты, перчатки и очки.
Следуя этому протоколу, коммерчески доступные базальные мембраны и гидрогелевая система, не содержащая ксено, были успешно использованы для культивирования клеток hiPSC и их дифференцировки в hIO. Основной целью этих экспериментов была систематическая оценка эквивалентности матриц из р?.......
Выбор оптимальной микросреды для работы со стволовыми клетками и органоидами является ключевым ранним шагом при использовании этих платформ для широкого спектра применений. Наши репрезентативные результаты показывают, что матрица 4-XFO3 в сочетании с более высокой концентрацией факто?.......
Доктор Джон Хуанг является основателем и генеральным директором компании TheWell Bioscience.
Авторы признают предыдущее обучение и общие рекомендации относительно начала работы с hiPSC и органоидами от докторов Кристины Пакак, Сильвели Сусуки-Хатано и Рассела Д'Соузы. Они благодарят доктора Челси Симмонс за ее руководство по использованию гидрогелевых систем для работы с клеточными культурами in vitro . Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить докторов Кристин Родригес и Томаса Эллисона из STEMCELL Technologies за их рекомендации по культивированию ИПСК Авторы также благодарят компанию TheWell Bioscience за покрытие расходов на публикацию.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-Well Plate (Culture treated, sterile) | Falcon | 353504 | |
37 °C water bath | VWR | ||
96-well plate | Fisher Scientific | FB012931 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
Anti-adherence Rinsing Solutio | STEMCELL Technologies | 7010 | |
Biological safety cabinet (BSC) | Labconco | Logic | |
Brightfield Microscope | Echo Rebel | REB-01-E2 | |
BXS0116 | ATCC | ACS-1030 | |
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) | ThermoScientific | 75002441 | |
Conical tubes, 15 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Conical tubes, 50 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Cultrex RGF BME, Type 2 | Bio-techne | 3533-005-02 | |
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME | Bio-techne | 3434-010-02 | |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor | Gibco | A14133-02 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) | Luminex | 0500-3115 | |
HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Scientific | 51033775 | |
JMP Software | SAS Institute | JMP 16 | |
MATLAB | MathWorks, Inc | R2022b | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free | Corning | 356231 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free | Corning | 354263 | |
mTeSR Plus Medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
Nunclon Delta surface treated 24-well plate | Thermo Scientific | 144530 | |
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) | BD Pharmingen | 566841 | |
PE Mouse Anti-human CDX2 | BD Pharmingen | 563428 | |
PE Mouse Anti-human FOXA2 | BD Pharmingen | 561589 | |
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 | BD Pharmingen | 561565 | |
ReLeSR | STEMCELL | 5872 | |
SCTi003-A | STEMCELL Technologies | 200-0510 | |
Serological pipettes (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Serological pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium | STEMCELL Technologies | 5145 | |
STEMdiff Intestinal Organoid Kit | STEMCELL Technologies | 5140 | |
Vitrogel Hydrogel Matrix | TheWell Bioscience | VHM01 | |
VitroGel ORGANOID Discovery Kit | TheWell Bioscience | VHM04-K |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены