Сравнительное исследование матриц базальной мембраны для поддержания стволовых клеток человека и генерации кишечных органоидов

Резюме

Органоиды стали ценными инструментами для моделирования заболеваний. Внеклеточный матрикс (ВКМ) управляет судьбой клетки во время генерации органоидов, и использование системы, напоминающей нативную ткань, может повысить точность модели. В этом исследовании сравнивается генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из кишечных органоидов человека, в ВКМ животного происхождения и гидрогелях, не содержащих ксено.

Аннотация

Внеклеточный матрикс (ВКМ) играет решающую роль в поведении и развитии клеток. Органоиды, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), находятся в центре внимания многих областей исследований. Тем не менее, отсутствие физиологических сигналов в материалах классических клеточных культур препятствует эффективной дифференцировке iPSC. Включение коммерчески доступной ЭКМ в культуру стволовых клеток дает физические и химические сигналы, полезные для поддержания клеток. Коммерчески доступные продукты базальной мембраны животного происхождения состоят из белков ВКМ и факторов роста, которые поддерживают поддержание клеток. Поскольку ВКМ обладает тканеспецифичными свойствами, которые могут модулировать судьбу клеток, матрицы, свободные от ксеносов, используются для трансляции в клинические исследования. В то время как коммерчески доступные матрицы широко используются в работе с гиперПСК и органоидами, эквивалентность этих матриц еще не была оценена. Здесь было проведено сравнительное исследование поддержания hiPSC и генерации кишечных органоидов (hIO) человека в четырех различных матрицах: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) и VitroGel (Matrix 4-XF). Несмотря на то, что колонии не имели идеально круглой формы, спонтанная дифференцировка была минимальной, при этом более 85% клеток экспрессировали маркер стволовых клеток SSEA-4. Матрица 4-XF привела к образованию 3D круглых глыб. Кроме того, увеличение концентрации добавок и факторов роста в средах, используемых для изготовления раствора гидрогеля Matrix 4-XF, улучшило экспрессию SSEA-4 в 1,3 раза. Дифференциация ИПСК, поддерживаемого Matrix 2-AB, привела к меньшему количеству высвобождений сфероидов на средней/задней стадии кишечника по сравнению с другими базальными мембранами животного происхождения. По сравнению с другими, матрица органоидов, свободных от ксеносов (матрица 4-O3), приводит к увеличению размера и повышению зрелости гидрогелей, что позволяет предположить, что физические свойства гидрогелей, не содержащих ксено, могут быть использованы для оптимизации генерации органоидов. В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что вариации в составе различных матриц влияют на стадии дифференцировки IO. Это исследование повышает осведомленность о различиях в коммерчески доступных матрицах и предоставляет руководство по оптимизации матриц во время работы с iPSC и IO.

Введение

Внеклеточный матрикс (ВКМ) является динамичным и многофункциональным компонентом тканей, который играет центральную роль в регулировании поведения и развития клеток. Будучи сложной сетью, она обеспечивает структурную поддержку, клеточные адгезивные лиганды¹ и хранение факторов роста и цитокинов, которые регулируют клеточную сигнализацию. Например, во время заживления ран ВКМ служит каркасом для мигрирующих клеток и резервуаром факторов роста, участвующих в восстановлении тканей². Аналогичным образом, нарушение регуляции в ВКМ может привести к увеличению тяжести различных заболеваний, таких как фиброз и рак

протокол

1. Обслуживание hiPSC

ВНИМАНИЕ: Все работы выполняются в шкафу биобезопасности (BSC) в соответствии со стандартными асептическими методами. Необходимо соблюдать стандарты безопасности OSHA для лабораторий, включая надлежащее использование средств индивидуальной защиты, таких как лабораторные халаты, перчатки и очки.

1. Приготовление матриц, аликвот и клеточных культуральных сред
   1. Для коммерчески доступных базальных мембран животного происхождения (БМ; Матрица 1-АВ, Матрица 2-АВ, Матрица 3-АВ), подготавливают аликвоты рабочих объемов в соответствии с рекомендацией производителя, обобщенной в таблице 1

Результаты

Следуя этому протоколу, коммерчески доступные базальные мембраны и гидрогелевая система, не содержащая ксено, были успешно использованы для культивирования клеток hiPSC и их дифференцировки в hIO. Основной целью этих экспериментов была систематическая оценка эквивалентности матриц из р?.......

Обсуждение

Выбор оптимальной микросреды для работы со стволовыми клетками и органоидами является ключевым ранним шагом при использовании этих платформ для широкого спектра применений. Наши репрезентативные результаты показывают, что матрица 4-XFO3 в сочетании с более высокой концентрацией факто?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K