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오가노이드는 질병 모델링을 위한 유용한 도구가 되었습니다. 세포외 기질(ECM)은 오가노이드 생성 중 세포의 운명을 안내하며, 자연 조직과 유사한 시스템을 사용하면 모델 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 이 연구는 동물 유래 ECM과 무이종 하이드로겔에서 유도만능줄기세포 유래 인간 장 오가노이드의 생성을 비교합니다.
세포외 기질(ECM)은 세포의 행동과 발달에 중요한 역할을 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 생성된 오가노이드는 많은 연구 분야에서 주목을 받고 있습니다. 그러나 기존 세포 배양 물질에는 생리학적 단서가 부족하여 효율적인 iPSC 분화를 방해합니다. 상업적으로 이용 가능한 ECM을 줄기 세포 배양에 통합하면 세포 유지 관리에 유용한 물리적, 화학적 단서를 얻을 수 있습니다. 동물 유래 상업적으로 이용 가능한 기저막 제품은 세포 유지를 지원하는 ECM 단백질과 성장 인자로 구성되어 있습니다. ECM은 세포의 운명을 조절할 수 있는 조직 특이적 특성을 가지고 있기 때문에 이종이 없는 매트릭스는 임상 연구로의 번역을 스트리밍하는 데 사용됩니다. 상업적으로 이용 가능한 매트릭스는 hiPSC 및 오가노이드 작업에 널리 사용되지만 이러한 매트릭스의 동등성은 아직 평가되지 않았습니다. 여기에서는 Matrigel(Matrix 1-AB), Geltrex(Matrix 2-AB), Cultrex(Matrix 3-AB) 및 VitroGel(Matrix 4-XF)의 4가지 매트릭스에서 hiPSC 유지 및 인간 장 오가노이드(hIO) 생성에 대한 비교 연구를 수행했습니다. 콜로니는 완벽하게 둥근 모양은 아니었지만 세포의 85% 이상이 줄기세포 마커 SSEA-4를 발현하는 등 자발적 분화가 최소화되었습니다. 매트릭스 4-XF는 3D 원형 덩어리를 형성했습니다. 또한, Matrix 4-XF 하이드로겔 용액을 만드는 데 사용된 배지에서 보충제 및 성장 인자의 농도를 증가시킴으로써 SSEA-4의 hiPSC 발현이 1.3배 개선되었습니다. Matrix 2-AB 유지 hiPSC의 분화는 다른 동물 유래 기저막에 비해 중기/후장 단계에서 스페로이드 방출이 더 적었습니다. 다른 것과 비교하여 무이물질 오가노이드 매트릭스(매트릭스 4-O3)는 더 크고 성숙한 hIO로 이어지며, 이는 무이물질 하이드로겔의 물리적 특성을 활용하여 오가노이드 생성을 최적화할 수 있음을 시사합니다. 전체적으로, 결과는 서로 다른 매트릭스의 구성 변화가 IO 분화 단계에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 이 연구는 상업적으로 이용 가능한 매트릭스의 차이점에 대한 인식을 높이고 iPSC 및 IO 작업 중 매트릭스 최적화를 위한 가이드를 제공합니다.
세포외 기질(ECM)은 세포의 행동과 발달을 조절하는 데 중심적인 역할을 하는 조직의 역동적이고 다기능적인 구성 요소입니다. 복잡한 네트워크로서 구조적 지지, 세포 접착 리간드(cell adhesive ligands)1, 세포 신호 전달을 조절하는 성장 인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine)의 저장을 제공합니다. 예를 들어, 상처 치유 중에 ECM은 세포의 이동을 위한 골격체이자 조직 복구에 관여하는 성장 인자의 저장소 역할을 한다2. 마찬가지로, ECM의 조절 장애는 섬유증 및 암과 같은 다양한 질병의 중증도를 증가시킬 수 있습니다 3,4. 배아 발달 동안 ECM은 조직 형태 형성을 안내합니다. 예를 들어, 심장의 발달에서 ECM 구성 요소는 심장 조직의 올바른 구조와 기능을 만드는 데 중요한 역할을 한다5. 10년 이상의 연구에 따르면 미세환경의 강성만으로도 줄기세포 계통 사양을 제어할 수 있습니다 6,7. 따라서 in vitro cell differentiation에서 ECM이 분화를 위한 신호를 제공하여 줄기세포의 운명에 영향을 미치는 것은 놀라운 일이 아닙니다.
오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 생성할 수 있습니다. 오가노이드를 성공적으로 생성하려면 적절하게 특성화된 iPSC 라인으로 시작해야 합니다. 그러나 기존 세포 배양 물질에는 생리학적 단서가 없기 때문에 효율적인 iPSC 분화와 오가노이드 생성을 방해합니다. 더욱이, 최근의 연구는 세포외 기질(ECM)의 구성, 세포와 ECM사이의 상호 작용8, 오가노이드 확장 및 분화의 맥락에서 기계적 및 기하학적 단서(9,10,11)의 중요성을 강조하고 있다12. 재현성을 개선하여 오가노이드 기술을 발전시키려면 조직 특이적인 물리적, 화학적 단서를 통합해야 합니다.
오가노이드는 생리학적으로 유사한 미세환경 내에서 네이티브 조직을 재현하는 것을 목표로 합니다. 본래 조직 ECM을 밀접하게 모방하는 ECM 시스템을 선택하는 것은 세포의 행동, 기능 및 자극에 대한 반응에 관한 생리학적 타당성을 달성하는 데 매우 중요하다13. ECM 구성 요소의 선택은 줄기 세포가 오가노이드 내의 특정 세포 유형으로 분화하는 데 영향을 미칠 수 있습니다. 다양한 ECM 단백질과 그 조합은 세포의 운명을 안내하는 단서를 제공할 수 있다14. 예를 들어, 연구에 따르면 특정 ECM 구성 요소를 사용하면 장 줄기 세포가 성숙한 장 세포 유형으로 분화하는 것을 촉진하여 생리학적으로 관련된 장 오가노이드를 생성할 수 있습니다15. 오가노이드는 질병 모델링 및 약물 테스트 중에 유용한 도구이지만, 적절한 ECM 시스템을 선택하는 것이 이 응용 분야에서 매우 중요합니다. 적절한 ECM 시스템은 영향을 받은 조직(16)과 유사한 미세환경을 생성함으로써 질병 모델링의 정확도를 향상시킬 수 있다. 또한 조직 특이적 ECM은 질병 관련 표현형 및 약물 반응을 더 잘 요약하는 오가노이드를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다17. 오가노이드 분화에 사용되는 ECM 시스템을 최적화하는 것은 원하는 분화 결과를 달성하는 데 매우 중요합니다.
동물 ECM 소스(예: Matrigel, Cultrex) 및 무이종 하이드로겔(예: VitroGel)에서 파생된 상업적으로 이용 가능한 기저막 시스템은 iPSC 및 오가노이드 연구에 널리 사용됩니다. 이를 상용화하는 회사와 이를 사용하는 연구자들은 수년에 걸쳐 특정 제품과 응용 분야에 대한 많은 지침을 제시했습니다. 이러한 지침의 대부분은 이 프로토콜의 생성을 위한 가이드 역할을 했습니다. 더욱이, 그들의 내재적 특성과 관련된 이점과 단점은 많은 사람들에 의해 개별적으로 언급되어 왔다 18,19,20,21. 그러나 iPSC 및 오가노이드 작업을 위한 최적의 시스템 선택을 안내하는 체계적인 워크플로우는 없습니다. 여기에서는 iPSC 및 오가노이드 작업을 위해 다양한 소스의 ECM 시스템 동등성을 체계적으로 평가할 수 있는 워크플로우를 제공합니다. 이것은 Matrigel(Matrix 1-AB), Geltrex(Matrix 2-AB), Cultrex(Matrix 3-AB) 및 VitroGel(Matrix 4-XF)의 네 가지 다른 매트릭스에서 두 가지 다른 인간 iPSC 라인(hiPSC) 및 인간 장 오가노이드(hIO) 생성의 유지에 대한 비교 연구입니다. 오가노이드 배양의 경우 이전에 오가노이드 배양에 최적화된 이종이 없는 matrix VitroGel의 4가지 버전인 ORGANOID 1(매트릭스 4-O1), ORGANOID 2(매트릭스 4-O2), ORGANOID 3(매트릭스 4-O3), ORGANOID 4(매트릭스 4-O4)가 사용되었습니다. 또한 오가노이드에 최적화된 동물 유래 매트릭스인 Matrigel High Concentration(Matrix 1-ABO) 및 Cultrex Type 2(Matrix 3-ABO)가 사용되었습니다. 시판되는 줄기세포 배양 배지(mTeSR Plus)와 오가노이드 분화 키트(STEMdiff intestinal organoid kit)를 사용하였다. 이 프로토콜은 제품 제조업체의 개별 지침과 실험실 경험을 결합하여 판독기가 특정 iPSC 및 오가노이드 작업을 위해 ECM을 성공적으로 최적화할 수 있도록 안내합니다. 이 프로토콜과 대표적인 결과는 줄기세포 작업과 오가노이드 분화를 위한 최적의 미세환경 선택의 중요성을 강조합니다.
1. hiPSC 유지 보수
주의 : 모든 작업은 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행됩니다. 실험실 가운, 장갑 및 고글과 같은 개인 보호 장비의 적절한 사용을 포함하여 실험실에 대한 OSHA 안전 표준을 따라야 합니다.
그림 1: 최적의 덩어리 크기. 최적의 응집 크기의 예를 보여주는 iPSC 세포주 SCTi003A의 덩어리 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. hiPSC 분화 및 장 오가노이드 생성
주의 : 모든 작업은 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행됩니다. 실험실 가운, 장갑 및 고글과 같은 개인 보호 장비의 적절한 사용을 포함하여 실험실에 대한 OSHA 안전 표준을 따라야 합니다.
그림 2. 돔 형성에 권장되는 기술 개략도. 회로도는 모든 시스템에서 성공적인 돔 형성을 위해 권장되는 단계별 프로세스를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. IO 크기 특성화
참고: 오가노이드의 크기는 4x 및 10x에서 촬영한 명시야 이미지로 특징지어졌습니다. 이미지 처리 분석은 MATLAB을 사용하여 자동화되었습니다. 프로세스의 전체 단계는 아래에 설명되어 있으며 코드 샘플은 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.
이 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 기저막과 무이종 하이드로겔 시스템을 사용하여 hiPSC 세포를 배양하고 hIO로 분화시키는 데 성공했습니다. 이 실험의 주요 목적은 hiPSC 및 hIO 작업을 위해 다양한 소스의 매트릭스 동등성을 체계적으로 평가하는 것이었습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 효율적인 장 오가노이드 생성을 생성하는 건강한 iPSC 배양의 유지 및 특성 분석에 초점을 ?...
줄기 세포 및 오가노이드 작업을 위한 최적의 미세환경을 선택하는 것은 광범위한 응용 분야에서 이러한 플랫폼을 사용할 때 중요한 초기 단계입니다. 당사의 대표적인 결과는 Matrix 4-XFO3가 더 높은 농도의 성장 인자와 결합하여 더 큰 오가노이드로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 무계 하이드로겔의 물리적 특성을 활용하여 이러한 시스템을 사용하여 오가노이드 생성을 최적화할 수 있음을 시?...
John Huang 박사는 TheWell Bioscience의 설립자 겸 CEO입니다.
저자는 Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano 및 Russell D'Souza 박사로부터 hiPSC 및 오가노이드 작업 시작에 대한 이전 교육 및 일반적인 권장 사항을 인정합니다. 그들은 체외 세포 배양 작업을 위해 하이드로겔 시스템을 사용하는 방법에 대한 Chelsey Simmons 박사의 지도에 감사드립니다. 또한 저자들은 hiPSC 배양에 대한 지도를 해준 STEMCELL Technologies의 Christine Rodriguez와 Thomas Allison 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 저자들은 또한 출판 비용을 부담해 준 TheWell Bioscience에 감사를 표합니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-Well Plate (Culture treated, sterile) | Falcon | 353504 | |
37 °C water bath | VWR | ||
96-well plate | Fisher Scientific | FB012931 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
Anti-adherence Rinsing Solutio | STEMCELL Technologies | 7010 | |
Biological safety cabinet (BSC) | Labconco | Logic | |
Brightfield Microscope | Echo Rebel | REB-01-E2 | |
BXS0116 | ATCC | ACS-1030 | |
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) | ThermoScientific | 75002441 | |
Conical tubes, 15 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Conical tubes, 50 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Cultrex RGF BME, Type 2 | Bio-techne | 3533-005-02 | |
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME | Bio-techne | 3434-010-02 | |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor | Gibco | A14133-02 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) | Luminex | 0500-3115 | |
HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Scientific | 51033775 | |
JMP Software | SAS Institute | JMP 16 | |
MATLAB | MathWorks, Inc | R2022b | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free | Corning | 356231 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free | Corning | 354263 | |
mTeSR Plus Medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
Nunclon Delta surface treated 24-well plate | Thermo Scientific | 144530 | |
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) | BD Pharmingen | 566841 | |
PE Mouse Anti-human CDX2 | BD Pharmingen | 563428 | |
PE Mouse Anti-human FOXA2 | BD Pharmingen | 561589 | |
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 | BD Pharmingen | 561565 | |
ReLeSR | STEMCELL | 5872 | |
SCTi003-A | STEMCELL Technologies | 200-0510 | |
Serological pipettes (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Serological pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium | STEMCELL Technologies | 5145 | |
STEMdiff Intestinal Organoid Kit | STEMCELL Technologies | 5140 | |
Vitrogel Hydrogel Matrix | TheWell Bioscience | VHM01 | |
VitroGel ORGANOID Discovery Kit | TheWell Bioscience | VHM04-K |
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