青少年C57BL/6雄性和雌性小鼠的社交失败应激模型

摘要

我们为青少年 C57BL/6 小鼠开发了一种加速社交失败压力模型，该模型对男性和女性都有效，并允许在离散的青春期进行暴露。暴露于这种模型会引起社会回避，但仅在被击败的雄性和雌性小鼠的子集中。

摘要

青春期的社会逆境很普遍，会对心理健康轨迹产生负面影响。需要对青少年雄性和雌性啮齿动物的社会压力进行建模，以了解其对持续大脑发育和行为结果的影响。慢性社会失败应激范式 （CSDS） 已被广泛用于模拟成年 C57BL/6 雄性小鼠的社会压力，方法是利用成年雄性啮齿动物对入侵其领土的入侵者表现出的攻击行为。这种范式的一个优点是，它允许根据它们在最后一次失败后 24 小时的社会行为的个体差异，将被击败的小鼠分为有弹性的组和易感组。在青少年C57BL / 6小鼠中实施该模型一直具有挑战性，因为成年或青少年小鼠通常不会攻击早期的青春期雄性或雌性小鼠，并且因为青春期是生命的短暂时期，包括谨慎的脆弱性时间窗口。通过调整CSDS的加速版本以用于青少年雄性和雌性小鼠，克服了这一限制。这种为期 4 天的压力范式，每天进行 2 次物理攻击，使用 C57BL/6 雄性成年小鼠来激发 CD-1 小鼠的攻击性，使其很容易攻击雄性或雌性青少年小鼠。这种模型被称为青春期小鼠的加速社会失败压力（AcSD）。青少年暴露于AcSD在男性和女性24小时后都会诱导社交回避，但仅在被击败的小鼠子集中引起。尽管在有弹性的组和易受攻击的组之间的会话中，攻击数量是一致的，但仍会发生此漏洞。AcSD模型足够短，允许在青春期的离散时期进行暴露，允许根据社会回避行为的存在与否对小鼠进行隔离，并且是第一个可用于研究青少年C57BL / 6雌性小鼠社会失败压力的模型。

引言

慢性社会失败压力范式被广泛用于模拟成年产后日 （PND） >65 雄性啮齿动物的社会压力。这种范式是基于成年雄性啮齿动物在入侵者入侵其领土时的自然攻击行为。该模型用于多种啮齿动物物种，包括大鼠、仓鼠和小鼠 1,2,3,4,5,6,7,8,9，包括持续约 10 天的身体攻击和心理压力的组合，在此期间，入侵啮齿动物实验几分钟的身体攻击来自常驻啮齿动物。这两只啮齿动物留在居民的家中笼子里，由一个隔板隔开，允许感官接触，但不允许身体接触⁷.在小鼠实验中，最常用的常驻/侵略小鼠是退休的育种瑞士CD-1小鼠，它们对入侵小鼠表现出强大的领土行为^6,7。对于入侵小鼠，最典型的品系是近交系C57BL / 6品系^2,4,5。被打败的老鼠每天都会暴露在新的侵略者面前，以防止对侵略者产生习惯。对照小鼠每天饲养不同的同种小鼠。在最后一次失败会话后24小时，在社会互动测试（SIT）中测试实验小鼠，其中它们可以在没有（无目标）或存在新型CD-1小鼠（目标）的情况下探索开放领域。对照组小鼠在与目标的交互区花费更多时间，而不是在任务的非目标部分花费更多时间。根据社会互动比率（在侵略者在场的互动区花费的时间/在侵略者不存在的互动区花费的时间），被击败的小鼠被分类为易感（比率<1）或弹性（比率>1）。该程序提供了一个有用的工具来研究对压力反应的个体差异。

直到最近几年，慢性社会失败压力模型主要用于成年雄性小鼠，因为强调的雄性优势等级涉及与雄性战斗，而不是与雌性战斗 ^6,7。此外，雄性啮齿动物通常不会攻击雌性;相反，它们从事交配行为¹⁰.尽管存在这些障碍，但已经开发出不同的策略来适应成年雌性小鼠的慢性社会失败压力范式。例如，加利福尼亚老鼠的社会失败模型是基于这种一夫一妻制物种在保卫自己的领土时来自两性的自然侵略性 ^9,11。其他方法侧重于通过刺激其腹内侧下丘脑具有一致的攻击行为^10,12 或在实验成年雌性小鼠中应用雄性尿液以接受 CD-1 侵略者的攻击¹³ 来诱导 CD-1 小鼠的攻击行为。CD-1 小鼠的这种高度和一致的攻击性对于实验入侵小鼠在相互作用期间表现出对侵略者的反复攻击的明显从属行为迹象至关重要⁶.

调整慢性社会失败模型以用于青少年 C57BL/6 小鼠
青春期是一个以社会心理高度成熟为标志的时期，它与大脑微观和宏观结构的变化同时展开，尤其是前额叶皮层的变化。在人类和啮齿动物中，关于青春期的具体开始和结束几乎没有共识^14,15。此外，在青春期存在关键的脆弱性窗口，即经验引起的对正在进行的大脑和认知发展的破坏16,17,18,19。青春期和青春期同时发生，但这些术语不是同义词。青春期标志着性成熟的开始，而青春期则代表着一个更广泛的阶段，其特征是从少年状态逐渐转变为实现独立²⁰.不同的研究小组认为，小鼠的青春期从断奶（PND 21）到成年期（PND 60）²¹。特别是，青春期早期可称为断奶后第一周和第二周（PND 21-34），青春期中期称为PND 35-48期。这些范围包括离散的发育期，例如多巴胺系统的发育 22,23,24，^对发育中的神经元网络的药物影响的脆弱性 17,25,26,27，^以及不同的行为特征 16,20,28,29,30。

社交失败协议需要常驻老鼠的战斗行为。然而，与雌性小鼠一样，雄性小鼠通常不会与早期青春期小鼠进行攻击性互动，可能是因为它们不认为它们是威胁。大多数探索青少年C57BL / 6小鼠慢性社交失败影响的研究都是在青春期中期进行的31,32,33,34,35;其他人没有指定青少年暴露的产后日^36,37，或将失败的日子延长到成年早期³⁸ 或不允许感官接触³⁹;对青少年小鼠的其他研究使用不同的菌株^40,41。表1总结了这些研究使用青春期雄性小鼠慢性社交失败压力的特征。

我们的研究小组对针对 C57BL/6 小鼠的特定青少年暴露窗口（包括青春期早期）感兴趣。由于不同青春期的持续时间较短，因此设计了慢性社会失败压力范式的加速版本的修改版本⁴²。这种模型被称为青春期小鼠的加速社会失败压力（AcSD）。先前的研究表明，大鼠在青春期对社会压力的敏感性方面存在显着的性别差异 8,26,43,44,45，以及社会压力对人类心理健康轨迹的有害影响 46,47,48,49,50,51,52^， 53,54,55,56.AcSD模型对青春期雌性小鼠也有效，使它们能够研究潜在的性别特异性后果，并探索神经生物学基础。

表1：在青春期雄性小鼠中使用社交失败压力范式的研究。 品系和物种：加利福尼亚小鼠： Peromyscus californicus。 C57BL/6： Mus musculus black 6 近交系小鼠品系。C57BL/6J：杰克逊实验室提供的M . musculus black 6近交小鼠模型。CD-1：来自瑞士近交白化小鼠品系的 肌肉分枝 杆菌。ICR： M. musculus 癌症研究所的白化小鼠品系优于近交系。OF1： M. musculus Oncins France 1 超过白化小鼠品系。
缩写：wk = 周;PND = 产后日;res = 弹性;SUS = 易感;UNSUS = 不易受影响。 请按此下载此表格。

研究方案

实验程序按照加拿大动物护理委员会的指导方针进行，并得到麦吉尔大学和道格拉斯医院动物护理委员会的批准（动物实验批准号：2005-5084）。所有小鼠被饲养在温度和湿度控制（21-22°C;60%）的菌落室中，并在道格拉斯心理健康大学研究所的神经表型中心进行12小时的明暗循环（8：00小时开光）。在整个实验过程中，小鼠可以 随意 获取食物和水。小鼠被随机分配到每个实验条件。实验动物是从商业来源获得的（见 材料表）。 表2 总结了每个实验阶段的动物特征。总共在20个实验队列中使用了489只青少年C57BL / 6J小鼠（259只雄性;230只雌性）。

表2：每个实验阶段的动物受试者。 ^†如果这些动物没有受到严重伤害，它们可以重新用于启动。 ^‡如果这些动物没有受到严重伤害，它们可以在AcSD期间重新用于启动， ^§道格拉斯心理健康大学研究所的神经表型中心。 ^¶对于男性的实验， ^#对于女性的实验，如果失败是混合的，请使用女性进行启动。 ^††不能用于 AcSD。缩写：AcSD = 加速的社会失败压力;PND = 产后日 请点击这里下载此表格。

1. 适应

注意：此阶段应至少持续 1 周。

1. 购买年龄超过4个月的雄性CD-1退休种小鼠（见 材料表），其数量是青少年C57BL / 6J小鼠的两倍（即，如果10只小鼠将暴露于压力下，则购买20只CD-1小鼠）。
   注意：建议获取此数量的CD-1小鼠，因为只有一小部分CD-1小鼠对青少年小鼠表现出攻击性行为。
2. 让CD-1雄性小鼠在筛选和启动前1周内用食物和水 随意 适应家庭笼中的新设施。
3. 在 PND >65（成人）和 PND 25 ± 3（青少年）（表 2）使用 C57BL/6 进行筛选和启动疗程。每天启动时获得每个年龄的4只C 57BL / 6小鼠（即，启动3天，获取12 PND >65和12 PND 25±3）以降低受伤的风险，因为这些动物将被重复用于筛选和启动过程。

2. CD-1 筛选和启动

注意：此阶段的持续时间为3天的筛选（雌性小鼠为1天）和3-4天的启动期（对于雌性小鼠，这可能会增加，并且取决于CD-1小鼠的攻击性行为。

1. 使用攻击的操作定义来注册 CD-1 的攻击，如下所述。
   1. 一次攻击定义为 CD-1 小鼠咬伤 C57BL/6J 小鼠，而 C57BL/6J 小鼠响应咬伤而移开。咬伤定义为 CD-1 小鼠将其牙齿放在 C57BL/6J 小鼠身体的任何部位。移开定义为当 C57BL/6J 鼠标将其后爪从 CD-1 接合之前的位置移动时。
   2. 确保单独的攻击之间至少相差 ~2 秒。如果发生不止一次咬伤<间隔 2 秒，则计为一次攻击。
   3. 如果CD-1小鼠连续多次咬伤而没有中断（相隔<~2秒），则用塑料尺轻轻分开动物。如果CD-1小鼠咬人并且不放手，请轻轻地将动物分开。如果 C57BL/6J 鼠标被困在角落或被 CD-1 鼠标压住并且无法因咬伤而移开，请用尺子轻轻地将动物分开。将所有这些算作一次攻击（直至分离）。
2. 筛分
   1. 使用丁腈检查手套处理所有动物，避免使用香水或香料。
   2. 仅在CD-1小鼠家庭笼中将成年C 57BL / 6雄性小鼠作为入侵者（PND >65）进行筛选的^第一天 。在进行新的实验之前，始终筛选CD-1小鼠。
   3. 将成年雄性C57BL / 6小鼠PND >65引入CD-1雄性小鼠的家庭笼中3分钟。记录第一次攻击的延迟以及执行的攻击次数（请参阅 补充表 1）。
   4. 从筛选的^{第 2 天} 到最后一天，引入成年男性 C57BL/6 PND>65 1 分钟（如果 CD-1 非常具有攻击性，则限制为 30 秒），然后将其与青少年 C57BL/6 PND 25 ± 3 交换 5 分钟。
      注意：对青少年小鼠进行筛选很重要，因为并非所有攻击成年C57BL / 6雄性小鼠的小鼠都会攻击青少年C57BL / 6。事实上，攻击青春期小鼠的CD-1小鼠并不总是攻击成年C57BL / 6雄性。
   5. 如果实验是为了对雌性小鼠的攻击性，则对青春期雌性小鼠进行筛选和启动，即使实验小鼠包括两性。
   6. 记录所有C57BL / 6小鼠的第一次攻击的潜伏期，攻击次数和受到的伤口（参见 补充表2）。
   7. 记录任何类型的互动：追逐、安装行为、嗅探、梳理或咬人。如果 CD-1 不接近青少年 C57BL/6 小鼠，请注册;如果此行为重复 2 天，请不要在启动中包含 CD-1。
   8. 对于启动阶段，选择所有表现出追逐、安装行为、嗅探、跟随、梳理或咬青少年 C57BL/6 等行为的 CD-1 小鼠。
   9. 保留未选择的CD-1小鼠，并将它们用于社交互动测试（SIT）。
      注意：领土行为随着时间的推移而增加;因此，在下一次实验中，未选择的CD-1小鼠可能会对青少年小鼠具有攻击性。
3. 启动 CD-1 攻击性行为
   1. 将选择用于启动的CD-1小鼠饲养在其家庭笼中，直到启动的最后一天。
   2. 将成年雄性C57BL / 6J小鼠PND >65引入CD-1家庭笼中30秒，然后将其与青少年C 57BL / 6 PND 25±3小鼠交换5分钟。
   3. 记录第一次攻击的延迟、攻击次数和任何交互（请参阅 补充表 3）。
   4. 每天进行 2 次启动，持续 3-4 天，同时安排失败（上午 9：00 和下午 2：00）。
      注意：并非所有的CD-1小鼠都会在第一天攻击青春期小鼠，特别是如果启动是针对雌性小鼠。启动的天数可以增加或减少，具体取决于CD-1小鼠表现出的攻击性行为。
   5. 为了减少启动天数，重复使用已经经历过雄性小鼠社会失败实验的CD-1小鼠。如果CD-1小鼠没有表现出增加的攻击性，则延长启动天数，直到达到标准。
   6. 如果CD-1小鼠表现出极端的攻击性行为（C57BL / 6小鼠表现出过度伤害），则减少启动天数，以防止在社交失败期间造成严重伤害。
   7. 对于实验的下一阶段，选择连续2天至少10次（雄性）或5次（雌性）攻击青少年小鼠的CD-1小鼠。

3. AcSD协议

注意：此阶段包括 3 天的习惯和 4 天的 AcSD 暴露。

1. 习惯
   1. 设置社会失败的老鼠笼（图1A-F）。使用适当的丙烯酸玻璃隔板将大鼠笼分成2个隔室（图1B，D;参见材料表）。
   2. 在笼子的两侧添加硬木屑垫料，每侧添加一个棉方作为垫料（图1D）。确保电线顶部用活页夹固定（图 1E）。确保老鼠笼被盖子盖住，没有保护棉（图1F）。
   3. 将每个笼子的 CD-1 鼠标放在笼子的一侧。放置一个标签 在笼子的外面，以便于识别每只老鼠。
   4. 在AcSD协议开始前2或3天将选定的CD-1小鼠饲养在社交失败装置（图1F）中（以增强CD-1领土行为）。
   5. 在实验前 1 天进行启动疗程;这对于保持攻击性的一致性很重要。
2. 击败会话
   1. 每天进行 2 个疗程（第一次疗程：上午 9 点，第二次疗程：下午 2 点），持续 4 天，共 8 个疗程。制定一个时间表，以确保攻击者在每次会话中都不同（见 补充表 4 和 补充表 5）。
   2. 称重C57BL / 6青少年小鼠，然后将其引入笼子的CD-1侧。将成年雄性 C57BL/6 小鼠 >65 引入失败笼的 CD-1 侧 30 秒，然后将其与青少年 C57BL/6 PND 24-28 小鼠交换，进行 10 分钟长的失败发作或每次最多 10 次攻击。
   3. 每次攻击后用塑料尺将动物分开。每次失败后，检查是否有受伤，并用止痛膏治疗。登记受伤人数。
   4. 将青少年 C57BL/6J 小鼠放在不熟悉的侵略者旁边的空闲隔间中，直到下一次治疗。每个会话对不同的侵略者重复该过程。
   5. 从上一次会话中未配对的实验小鼠和侵略小鼠开始会话。监测用于启动的成年C57BL / 6J雄性小鼠的损伤（参见 补充表6）。
3. 请遵循以下关于动物福利和人道终点的建议。
   1. 遵循相应机构审查委员会的标准操作程序，以应对社会失败，并确保持续的兽医评估。
   2. 在整个研究过程中监测小鼠的健康状况，以避免动物的痛苦和死亡。
   3. 确认穿孔分隔器设置正确，以防止老鼠穿越到另一个隔间。
   4. 当动物有伤口时，通知兽医护理人员进行适当的监测，并每天涂抹止痛霜，直到伤口完全愈合。
   5. 如果损伤恶化（伤口增大），在下一次治疗中将攻击次数限制为 5 次，以便恢复。检查是否有严重伤害。严重伤害定义为总> 1 厘米的伤口。
   6. 立即移除并安乐死动物，使其体重比初始体重减轻15%-20%;运动活动减少/减少和仪容障碍;伤口>1厘米的小鼠;阴茎切断，或前肢肿胀的咬痕。
      注意：初次安乐死是通过异氟烷/CO2 毒气室进行的，然后通过颈椎脱位进行二次安乐死。
4. 对照小鼠
   1. 每天进行 2 个疗程（第一次疗程：上午 9 点，第二次疗程：下午 2 点），持续 4 天，共 8 个疗程。制定时间表以确保对照小鼠每次会话与不同的C57BL / 6J同种小鼠共享笼子（参见 补充表7 和 补充表8）。
      注意：对照小鼠不会暴露于侵略者。为了在每次失败会话中模仿对新型CD-1小鼠的介绍，对照小鼠每次会话都与新的同性和同龄同种（非同窝）配对。
   2. 将与AcSD小鼠的房间分开的房间内，将对照小鼠安置在社会失败装置（图1）中。
   3. 每个笼子放置两个对照小鼠，笼子的每一侧一个。将老鼠饲养在笼子的另一侧或完全不同的笼子中，这样它们就不会识别气味。每个会话旋转对照鼠标。

图 1：用于青少年小鼠加速社交失败应激 （AcSD） 的装置。 （A） 从左到右，成对的钢丝顶部，杆之间相距 0.6 厘米，透明穿孔聚碳酸酯分隔器，穿孔直径为 0.6 厘米，用于固定金属丝顶部的活页夹，带盖子的透明老鼠笼（不带棉保护层）。（B） 上：聚碳酸酯分隔器对成人慢性社交失败（左）和青少年（右）的AcSD的比较;向下：靠近青少年小鼠的聚碳酸酯分隔器。（C） 上图：成人（左）和青少年（右）慢性社交失败的钢丝顶部比较;下图：钢丝顶部的特写。（D-F）组装社会失败机器。 请点击这里查看此图的较大版本.

4.社交互动测试

1. 按照 AcSD 执行 SIT，如前所述 57,58,59。
   1. 在 AcSD 最后一次会话后 24 小时执行 SIT。在上午 9 点至下午 4 点之间在红灯条件下（而不是在黄灯条件下）执行 SIT。
   2. 设置主广场和高架摄像机（见 材料表）。主竞技场分为3个区域：社交互动区（SIZ）、角落和中心;这些区域在竞技场上应用黑线标记（使用黑色永久性记号笔）。对每个区域使用以下维度和条件。
      1. 确保 SIZ 是围绕外壳的 14 cm x 9 cm 的平方区域。角落是墙角中与围护结构相对的小方形区域 （9 cm x 9 cm），代表离 SIZ 最远的点。中心是 SIZ 和角落之间的区域。
   3. 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
   4. 将每只动物的识别标签放在地板上进行分析。记录所有动物行为以供离线分析。
2. 确定基线勘探的第一次会议
   1. 将一个空的金属丝网外壳靠在竞技场的一面墙上。将实验性（击败或对照）青少年C57BL / 6小鼠放在竞技场的中间。让它自由探索竞技场 2.5 分钟。取回鼠标。
   2. 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
3. 第二节课：社交互动
   1. 将不熟悉的 CD-1 鼠标放入金属丝网外壳内。将存储模块放置在与上一个会话相同的位置。
   2. 将相同的青少年 C57BL/6 小鼠重新引入竞技场。让它自由探索竞技场 2.5 分钟。取回老鼠。
   3. 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
   4. 以平衡顺序对所有青少年C57BL / 6小鼠（应激和对照小鼠）重复该过程。
   5. 使用多个 CD-1 小鼠进行 SIT 以减少处理压力和偏差（例如，对于 30 只 C57BL/6 小鼠的队列，使用 4 只 CD-1 小鼠）。在青春期小鼠中平衡它们。
      注意：该测试测量实验小鼠对社会目标的接近和/或回避行为，如 Krishnan⁵ 和 Golden⁷ 首次描述的那样。
4. 分析
   1. 记录在两个测试会话期间在交互区域和角落花费的时间。
   2. 计算社交互动比率，即在 CD-1 侵略者在场的互动区花费的时间除以 CD-1 侵略者不在的互动区中花费的时间。
   3. 将比率< 1.00 的应激小鼠分类为易感小鼠，将比率≥ 1.00 的小鼠分类为弹性小鼠。
   4. 从所有分析中排除在第一次会话期间未探索竞技场的动物（即，在任何指定区域花费 0 秒），以控制运动活动的差异。
   5. 从所有分析中排除在 ≥4 次社会失败会话中接受 0 次攻击的所有动物，以防止非代表性弹性动物。
   6. 排除在互动区内至少停留61秒的小鼠（不易感），以确保高社交互动率反映对社交目标的实际兴趣。
   7. 排除具有异常交互比分数的小鼠。

结果

在青少年 C57BL/6 雄性小鼠 （PND 21） 中使用慢性社交失败应激模型共进行了四个不同的实验。然而，该模型在早期青春期 C57BL/6 小鼠中的使用存在重要局限性。

青少年 C57BL/6 小鼠所需的设备修改
第一个限制是用于社会失败装置的设备是为成年小鼠设计的。由于它们的大小，PND 21 的青少年 C57BL/6 小鼠能够穿过分隔器的穿孔到达侵略侧。这打断了感官接触的时期?...

讨论

CD-1小鼠中一致的攻击性行为
在筛选阶段，注意 CD-1 显示的所有行为（追逐、安装行为、嗅探、梳理或咬合）并在为 AcSD 选择 CD-1 小鼠时密切遵循这些记录非常重要。CD-1小鼠与青春期小鼠相互作用而不攻击青春期小鼠，可能会在启动过程中对青春期小鼠产生攻击性。相比之下，攻击成年小鼠但不接近青春期小鼠的CD-1小鼠可能不会对青春期小鼠产生攻击性。

CD-1?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.