Ergen C57BL/6 Erkek ve Dişi Fareler için Sosyal Yenilgi Stres Modeli

Özet

Hem erkeklerde hem de kadınlarda çalışan ve ayrı ergenlik dönemlerinde maruz kalmaya izin veren ergen C57BL / 6 fareleri için hızlandırılmış bir sosyal yenilgi stres modeli geliştirdik. Bu modele maruz kalmak, sosyal kaçınmaya neden olur, ancak yalnızca mağlup erkek ve dişi farelerin bir alt kümesinde.

Özet

Ergenlik döneminde sosyal sıkıntı yaygındır ve ruh sağlığı yörüngelerini olumsuz yönde etkileyebilir. Ergen erkek ve dişi kemirgenlerde sosyal stresin modellenmesi, devam eden beyin gelişimi ve davranışsal sonuçlar üzerindeki etkilerini anlamak için gereklidir. Kronik sosyal yenilgi stresi paradigması (CSDS), yetişkin bir erkek kemirgenin kendi bölgesini istila eden bir davetsiz misafire karşı sergilediği saldırgan davranıştan yararlanarak yetişkin C57BL / 6 erkek farelerde sosyal stresi modellemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu paradigmanın bir avantajı, mağlup fareleri, son yenilgi seansından 24 saat sonra sosyal davranışlarındaki bireysel farklılıklarına dayanarak esnek ve duyarlı gruplara ayırmaya izin vermesidir. Bu modeli ergen C57BL / 6 farelerinde uygulamak zor olmuştur çünkü yetişkin veya ergen fareler tipik olarak erken ergen erkek veya dişi farelere saldırmaz ve ergenlik kısa bir yaşam periyodu olduğu için gizli zamansal kırılganlık pencerelerini kapsar. Bu sınırlama, ergen erkek ve dişi fareler için kullanılacak CSDS'nin hızlandırılmış bir versiyonunun uyarlanmasıyla aşıldı. Günde 2 fiziksel saldırı seansı içeren bu 4 günlük stres paradigması, CD-1 faresini erkek veya dişi ergen fareye kolayca saldıracak şekilde saldırganlığa hazırlamak için bir C57BL / 6 erkek yetişkin kullanır. Bu model, ergen fareler için hızlandırılmış sosyal yenilgi stresi (AcSD) olarak adlandırıldı. Ergenlerin AcSD'ye maruz kalması, hem erkeklerde hem de kadınlarda 24 saat sonra sosyal kaçınmaya neden olur, ancak yalnızca mağlup farelerin bir alt kümesinde. Bu güvenlik açığı, saldırı sayısının dayanıklı ve duyarlı gruplar arasındaki oturumlar arasında tutarlı olmasına rağmen oluşur. AcSD modeli, ergenlik dönemindeki ayrı dönemlerde maruz kalmaya izin verecek kadar kısadır, farelerin sosyal kaçınma davranışının varlığına veya yokluğuna göre ayrılmasına izin verir ve ergen C57BL / 6 dişi farelerde sosyal yenilgi stresini incelemek için mevcut olan ilk modeldir.

Giriş

Kronik sosyal yenilgi stresi paradigması, yetişkin doğum sonrası gün (PND) >65 erkek kemirgende sosyal stresi modellemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu paradigma, bir davetsiz misafir bölgesini istila ettiğinde yetişkin bir erkek kemirgenin doğal saldırgan davranışına dayanmaktadır. Bu model, sıçanlar, hamsterlar ve fareler 1,2,3,4,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere çeşitli kemirgen türlerinde kullanılır ve yaklaşık 10 gün süren fiziksel saldırganlık ve psikolojik stresin bir kombinasyonundan oluşur, bu sırada bir davetsiz misafir kemirgen, yerleşik kemirgenden birkaç dakikalık fiziksel saldırganlık deneyi yapar. İki kemirgen, sakinin ev kafesinde kalır ve duyusal ancak fiziksel temasa izin vermeyen bir bölücü ile ayrılır⁷. Fare deneylerinde, en yaygın olarak kullanılan yerleşik/saldırgan fareler, davetsiz misafir farelere^karşı sağlam bölgesel davranış gösteren emekli damızlık İsviçre CD-1 fareleridir ^6,7. Davetsiz misafir fareler için en iyi karakterize edilen suş, akrabalı C57BL/6 suşu 2,4,5'tir. Yenilen fare, saldırganın alışmasını önlemek için her gün yeni bir saldırgana maruz kalır. Kontrol fareleri her gün farklı bir türdeşle barındırılır. Son yenilgi seansından 24 saat sonra, deneysel fareler, yeni bir CD-1 faresinin (hedef) yokluğunda (hedefsiz) veya varlığında açık bir alanı keşfedebilecekleri bir sosyal etkileşim testinde (SIT) test edilir. Kontrol fareleri, görevin hedef olmayan kısmına kıyasla hedefle etkileşim bölgesinde daha fazla zaman harcarlar. Yenilen fareler, sosyal etkileşim oranına göre (saldırganın bulunduğu etkileşim bölgesinde geçirilen süre / saldırganın olmadığı etkileşim bölgesinde geçirilen süre) duyarlı (oran<1) veya dayanıklı (oran>1) olarak sınıflandırılır. Bu prosedür, strese yanıt olarak bireysel farklılıkları incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Son yıllara kadar, kronik sosyal yenilgi stresi modeli daha çok yetişkin erkek farelerde kullanılmıştır, çünkü vurgulanmış erkek egemenlik hiyerarşileri erkeklere karşı savaşmayı içerir, ancak dişilere karşı savaşmayı içermez ^6,7. Ayrıca, erkek kemirgenler tipik olarak dişilere saldırmazlar; bunun yerine çiftleşme davranışlarında bulunurlar¹⁰. Bu engellere rağmen, yetişkin dişi fareler için kronik sosyal yenilgi stresi paradigmasını uyarlamak için farklı stratejiler geliştirilmiştir. Örneğin, Kaliforniya faresinin sosyal yenilgi modeli, bu tek eşli türün bölgelerini savunurken her iki cinsiyetten de doğal saldırganlığına dayanmaktadır ^9,11. Diğer yaklaşımlar, ventromedial hipotalamuslarını tutarlı agresif davranışa^{sahip olmaları için uyararak CD-1 farelerinin agresif davranışını indüklemeye odaklanır 10,12} veya CD-1 saldırganlarından¹³ saldırılar almak için deneysel yetişkin dişi farelere erkek idrarı uygulayarak CD-1 farelerinin agresif davranışını indüklemeye odaklanır. CD-1 farelerinin bu yüksek ve tutarlı saldırganlığı, deneysel davetsiz misafir farenin, etkileşimin uzunluğu boyunca saldırgan tarafından tekrarlanan saldırılara karşı açık davranışsal itaat belirtileri göstermesi için kritik öneme sahiptir⁶.

Kronik sosyal yenilgi modelinin ergen C57BL/6 farelerde kullanılmak üzere uyarlanması
Ergenlik, beynin mikro ve makro mimarisindeki, özellikle prefrontal korteksteki değişikliklere paralel olarak ortaya çıkan, önemli psikososyal olgunlaşmanın damgasını vurduğu bir dönemdir. Hem insanlarda hem de kemirgenlerde, ergenlik döneminin spesifik başlangıcı ve sonu ile ilgili çok az fikir birliği vardır^14,15. Ayrıca, ergenlik döneminde devam eden beyin ve bilişsel gelişimin deneyim kaynaklı bozulması için kritik savunmasızlık pencereleri vardır 16,17,18,19. Ergenlik ve ergenlik aynı anda ortaya çıkar, ancak bu terimler eşanlamlı değildir. Ergenlik, cinsel olgunlaşmanın başlangıcını ifade ederken, ergenlik, gençlik durumundan bağımsızlığa ulaşmaya kademeli geçiş ile karakterize edilen daha geniş bir aşamayı temsil eder²⁰. Farklı gruplar, farelerde ergenliğin sütten kesmeden (PND 21) yetişkinliğe (PND 60) kadar uzandığını öne ^{sürmüştür21}. Özellikle, erken ergenlik sütten kesimden sonraki birinci ve ikinci haftalar (PND 21-34) ve orta ergenlik PND 35-48 dönemi olarak adlandırılabilir. Bu aralıklar, örneğin dopamin sisteminin^gelişimi 22,23,24, nöronal ağların geliştirilmesi üzerindeki ilaç etkilerine karşı savunmasızlık 17,25,26,27 ve farklı davranışsal özellikler^{16,20,28,29,30} ile ilgili ayrı gelişim dönemlerini kapsar 'dir.

Sosyal yenilgi protokolü için yerleşik farenin dövüş davranışı gereklidir. Bununla birlikte, dişi farelerde olduğu gibi, erkekler tipik olarak erken ergen farelerle agresif etkileşimlere girmezler, çünkü muhtemelen onları bir tehdit olarak algılamazlar. Ergen C57BL / 6 farelerinde kronik sosyal yenilginin etkilerini araştıran çalışmaların çoğu, orta ergenlik döneminde^{gerçekleştirilmiştir} 31,32,33,34,35; diğerleri ergenlik maruziyetinin doğum sonrası gününü^{belirtmez 36,37} veya yenilgi günlerini erken yetişkinliğe³⁸ uzatır veya duyusal temasa^{izin vermez 39}; Ergen fareler üzerinde yapılan diğer çalışmalar farklı suşlar kullanır ^40,41. Ergen erkek farelerde kronik sosyal yenilgi stresi kullanan bu çalışmaların özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir.

Araştırma grubumuz, C57BL / 6 farelerinde erken ergenlik de dahil olmak üzere belirli ergen maruz kalma pencerelerini hedeflemekle ilgilenmektedir. Farklı ergenlik dönemlerinin kısa sürmesi nedeniyle, kronik sosyal yenilgi stresi paradigmasının hızlandırılmış versiyonunun değiştirilmiş bir versiyonu tasarlanmıştır⁴². Bu model, ergen fareler için hızlandırılmış sosyal yenilgi stresi (AcSD) olarak adlandırıldı. Önceki çalışmalar, sıçanlarda ^{8,26,43,44,45} ergenlik döneminde sosyal strese duyarlılıkta ve ayrıca sosyal stresin insanlarda ruh sağlığı yörüngeleri üzerindeki zararlı etkilerinde önemli cinsiyet farklılıkları olduğunu göstermektedir 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56. AcSD modeli, ergen dişi fareler için de etkili bir şekilde çalışır ve potansiyel cinsiyete özgü sonuçları araştırmalarına ve nörobiyolojik temeli keşfetmelerine olanak tanır.

Tablo 1: Ergen erkek farelerde sosyal yenilgi stres paradigmalarını kullanan çalışmalar. Tür ve türler: Kaliforniya Faresi: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus siyah 6 akraba fare türü. C57BL/6J: Jackson'ın laboratuvarları tarafından sağlanan M. musculus siyah 6 akraba fare modeli. CD-1: M. musculus , İsviçre soyundan gelen albino fare türünden. ICR: M. musculus Kanser Araştırmaları Enstitüsü soyundan çıkmış albino fare türü. OF1: M. musculus Oncins France 1 soylu albino fare türü.
Kısaltmalar: wk = hafta; PND = Doğum sonrası gün; res = dirençli; Sus = duyarlı; unsus = duyarlı değil. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Deneysel prosedürler, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve McGill Üniversitesi ve Douglas Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı (hayvan deneyi onay numarası: 2005-5084). Tüm fareler, Douglas Ruh Sağlığı Üniversitesi Enstitüsü Nörofenotipleme Merkezi'nde sıcaklık ve nem kontrollü (21-22 ° C; % 60) bir koloni odasında ve 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde (8: 00 saatte yanar) barındırıldı. Fareler, deneyler boyunca yiyecek ve suya ad libitum erişimine sahipti. Fareler her deney koşuluna rastgele atandı. Deney hayvanları ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz . Tablo 2 , her deney aşaması için hayvanın özelliklerini özetlemektedir. Toplamda, 20 deneysel kohortta 489 ergen C57BL / 6J faresi (259 erkek; 230 kadın) kullanıldı.

Tablo 2: Her deney aşaması için hayvan denekler. ^†Bu hayvanlar ciddi şekilde yaralanmazsa, astarlama için yeniden kullanılabilirler. ^‡Bu hayvanlar ciddi şekilde yaralanmazsa, ^Douglas Ruh Sağlığı Üniversitesi Enstitüsü Nörofenotipleme Merkezi olan AcSD, § sırasında astarlama için yeniden kullanılabilirler. ^¶Erkeklerle yapılan deneyler için, #Dişilerle yapılan deneyler için, yenilgi karışıksa, astarlama için dişileri kullanın. ^††AcSD için kullanılmamalıdır. Kısaltmalar: AcSD = hızlandırılmış sosyal yenilgi stresi; PND = Doğum sonrası gün Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Alışma

NOT: Bu aşama en az 1 hafta sürmelidir.

1. 4 aylıktan daha eski ve ergen C57BL / 6J farelerinin iki katı miktarda erkek CD-1 emekli damızlık fareleri (Malzeme Tablosuna bakınız) satın alın (yani, 10 fare strese maruz kalacaksa, 20 CD-1 faresi satın alın).
   NOT: Bu miktarda CD-1 faresinin alınması önerilir, çünkü CD-1 farelerinin sadece küçük bir kısmı ergen farelere karşı agresif davranış gösterir.
2. CD-1 erkek farelerin, tarama ve astarlamadan önce 1 hafta boyunca yiyecek ve su ad libitum ile ev kafeslerinde yeni tesise alışmalarına izin verin.
3. Tarama ve hazırlama seansları için PND >65'te (yetişkinler) ve PND 25 ± 3'te (ergenler) C57BL / 3 kullanın (Tablo 2). Yaralanma riskini azaltmak için her yaştan 4 C57BL / 6 adet hazırlama işlemi için 4 C57BL / 6 fare edinin (yani, 3 günlük hazırlama için, 12 PND >65 ve 12 PND 25 ± 3) elde edin, çünkü bu hayvanlar tarama ve hazırlama işlemi için tekrar tekrar kullanılacaktır.

2. CD-1 taraması ve astarlama

NOT: Bu fazın süresi 3 günlük tarama (dişi fareler için 1 gün) ve 3-4 günlük astarlamadır (bu, dişi fareler için ve CD-1 farelerinin agresif davranışına bağlı olarak artabilir.)

1. CD-1 saldırılarını aşağıda açıklandığı gibi kaydetmek için saldırının işlemsel tanımını kullanın.
   1. Bir saldırı, CD-1 faresinin C57BL/6J fareyi ısırması ve C57BL/6J farenin ısırığa yanıt olarak uzaklaşması olarak tanımlanır. Isırma, CD-1 farenin dişlerini C57BL/6J farenin vücudunun herhangi bir yerine yerleştirmesi olarak tanımlanır. Uzaklaşma, C57BL/6J farenin her iki arka pençesini CD-1 ona çarpmadan önce bulundukları konumdan hareket ettirmesi olarak tanımlanır.
   2. Ayrı saldırılar arasında en az ~2 sn fark olduğundan emin olun. Birden fazla ısırık <2 saniye arayla meydana gelirse, bir saldırı olarak sayın.
   3. CD-1 faresi ara vermeden (<~2 saniye aralıkla) art arda birden fazla kez ısırırsa, hayvanları plastik bir cetvelle nazikçe ayırın. CD-1 fare ısırır ve bırakmazsa, hayvanları nazikçe ayırın. C57BL/6J fare bir köşede sıkışırsa veya CD-1 fare tarafından sabitlenirse ve bir ısırığa tepki olarak hareket edemezse, hayvanları bir cetvelle nazikçe ayırın. Bunların hepsini tek bir saldırı olarak sayın (ayrılmaya kadar).
2. Tarama
   1. Tüm hayvan muameleleri için nitril muayene eldivenleri kullanın ve parfüm veya koku kullanmaktan kaçının.
   2. Taramanın 1^{. gününü} sadece CD-1 farelerinin ev kafesinde davetsiz misafir olarak (PND >65) yetişkin C57BL / 6 erkek farelerle gerçekleştirin. Yeni bir deneyden önce daima CD-1 farelerini tarayın.
   3. Yetişkin bir erkek C57BL/6 fare PND >65'i 3 dakika boyunca bir CD-1 erkek farenin ev kafesinde tanıtın. İlk saldırganlığın gecikmesini ve kaç tane saldırganlık gerçekleştirildiğini kaydedin (Ek Tablo 1'e bakınız).
   4. Taramanın 2^. gününden son gününe kadar, yetişkin bir erkek C57BL / 6 PND>65'i 1 dakika boyunca tanıtın (CD-1 çok agresifse 30 saniye ile sınırlayın) ve ardından 5 dakika boyunca bir ergen C57BL / 6 PND 25 ± 3 ile değiştirin.
      NOT: Taramanın ergen farelerle yapılması önemlidir, çünkü yetişkin C57BL / 6 erkek fareye saldıran tüm fareler ergen C57BL / 6'ya saldırmayacaktır. Aslında, ergen farelere saldıran CD-1 fareleri her zaman yetişkin C57BL / 6 erkeklere saldırmaz.
   5. Deney dişi farelere karşı saldırganlık içinse, deney fareleri her iki cinsiyeti de içerse bile, ergen dişi farelerle tarama ve astarlama yapın.
   6. İlk saldırganlığın gecikmesini, saldırı sayısını ve tüm C57BL / 6 fareleri tarafından alınan yaraları kaydedin (Ek Tablo 2'ye bakınız).
   7. Her türlü etkileşimi kaydedin: kovalama, montaj davranışları, koklama, tımar etme veya ısırma. CD-1, ergen C57BL/6 farelerine yaklaşmazsa kaydedin; bu davranış 2 gün boyunca tekrarlanırsa, CD-1'i hazırlamaya dahil etmeyin.
   8. Hazırlama aşaması için, ergen C57BL/6'yı kovalama, takma davranışları, koklama, takip etme, tımar etme veya ısırma gibi davranışlar sergileyen tüm CD-1 farelerini seçin.
   9. Seçili olmayan CD-1 farelerini saklayın ve bunları sosyal etkileşim testi (SIT) için kullanın.
      NOT: Bölgesel davranış zamanla artar; bu nedenle, seçilmemiş CD-1 fareleri bir sonraki deneyde ergen farelere karşı agresif hale gelebilir.
3. CD-1 agresif davranışının hazırlanması
   1. Astarlama için seçilen CD-1 farelerini, astarlamanın son gününe kadar ev kafeslerinde saklayın.
   2. Yetişkin bir erkek C57BL/6J fare PND >65'i 30 saniye boyunca CD-1 ev kafesine yerleştirin ve ardından 5 dakika boyunca ergen bir C57BL/6 PND 25 ± 3 fare ile değiştirin.
   3. İlk saldırganlığın gecikmesini, saldırı sayısını ve herhangi bir etkileşimi kaydedin (Ek Tablo 3'e bakın).
   4. Hazırlamayı 3-4 gün boyunca günde 2 kez, yenilgilerin planlandığı saatte (09:00 ve 14:00) yapın.
      NOT: Tüm CD-1 fareleri, özellikle hazırlama dişi farelere doğru ise, ilk günlerde ergen farelere saldırmaz. Hazırlama için gün sayısı, CD-1 fareleri tarafından gösterilen agresif davranışa bağlı olarak artabilir veya azalabilir.
   5. Hazırlama günlerinin sayısını azaltmak için, erkek farelerle daha önce bir sosyal yenilgi deneyinden geçmiş CD-1 farelerini yeniden kullanın. CD-1 fareleri artan saldırganlık göstermezse, kriterlere ulaşana kadar hazırlama günlerini uzatın.
   6. CD-1 fareleri aşırı agresif davranış gösteriyorsa (C57BL / 6 fareler aşırı yaralanma gösterirse) sosyal yenilgi sırasında ciddi yaralanmaları önlemek için hazırlama günlerini azaltın.
   7. Deneyin bir sonraki aşaması için, art arda 2 gün boyunca ergen farelere en az 10x (erkek) veya 5x (dişi) saldıran CD-1 farelerini seçin.

3. AcSD protokolü

NOT: Bu aşama 3 günlük alışkanlık ve 4 günlük AcSD'ye maruz kalmaktan oluşur.

1. Alışkanlık
   1. Sosyal yenilgi için fare kafeslerini kurun (Şekil 1A-F). Uygun akrilik cam bölücüler kullanarak fare kafeslerini 2 bölmeye bölün (Şekil 1B,D; bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Kafesin her iki tarafına sert talaş yatak takımı ekleyin, yatak malzemesi olarak her iki tarafa pamuklu bir kare ekleyin (Şekil 1D). Tel üst kısmının bağlayıcı klipslerle sabitlendiğinden emin olun (Şekil 1E). Fare kafesinin koruyucu pamuk olmadan kapak kapağıyla kapatıldığından emin olun (Şekil 1F).
   3. Kafesin bir tarafındaki her kafes için bir CD-1 fare yerleştirin. Her farenin kolay tanımlanması için kafesin dışına bir etiket yerleştirin.
   4. Seçilen CD-1 farelerini, AcSD protokolü başlamadan 2 veya 3 gün önce (CD-1 bölgesel davranışını geliştirmek için) sosyal yenilgi aparatında (Şekil 1F) barındırın.
   5. Deneyden 1 gün önce bir hazırlama seansı yapın; Bu, saldırganlığı tutarlı tutmak için önemlidir.
2. Oturumları yenin
   1. Günde 2 seans (ilk seans: sabah 9, ikinci seans: 14:00) olmak üzere 4 gün boyunca toplam 8 seans uygulayın. Saldırganın her seans için farklı olmasını sağlamak için bir program yapın (bakınız Ek Tablo 4 ve Ek Tablo 5).
   2. C57BL/6 ergen fareyi kafesin CD-1 tarafına sokmadan önce tartın. Yetişkin bir erkek C57BL/6 fareyi >65 30 saniye boyunca yenilgi kafesinin CD-1 tarafına sokun ve ardından 10 dakikalık uzun bir yenilgi bölümü veya oturum başına maksimum 10 saldırı için ergen bir C57BL/6 PND 24-28 fare ile değiştirin.
   3. Her saldırıdan sonra hayvanları plastik bir cetvelle ayırın. Her yenilgi seansından sonra, yaralanmaları kontrol edin ve ağrı kesici krem ile tedavi edin. Yaralanma sayısını kaydedin.
   4. Ergen C57BL/6J fareyi bir sonraki seansa kadar tanımadığınız bir saldırganın yanındaki serbest bölmeye yerleştirin. İşlemi her seansta farklı bir saldırganla tekrarlayın.
   5. Oturumu, önceki oturumda eşleştirilmemiş olan deneysel ve saldırgan farelerle başlatın. Astarlama için kullanılan yetişkin C57BL/6J erkek farelerin yaralanmalarını izleyin (Ek Tablo 6'ya bakınız).
3. Hayvan refahı ve insancıl son noktalar için aşağıdaki tavsiyelere uyun.
   1. Sosyal yenilgiler için ilgili kurumsal inceleme kurulunun standart çalışma prosedürünü takip edin ve sürekli veteriner değerlendirmesini sağlayın.
   2. Hayvanların acı çekmesini ve ölümünü önlemek için çalışma boyunca farelerin sağlığını izleyin.
   3. Farelerin diğer bölmeye geçmesini önlemek için delikli bölücünün doğru şekilde ayarlandığını doğrulayın.
   4. Bir hayvanın uygun izleme için bir yarası olduğunda veteriner bakım personelini bilgilendirin ve yara tamamen iyileşene kadar her gün ağrı kesici krem uygulayın.
   5. Bir yaralanma kötüleşirse (yaraların boyutu artarsa), iyileşmeye izin vermek için bir sonraki seansta atakları 5 ile sınırlayın. Ciddi yaralanmalar olup olmadığını kontrol edin. Ağır yaralanmalar toplam 1 cm> ulaşan yaralar olarak tanımlanır.
   6. İlk vücut ağırlığından ağırlıklarında% 15 -% 20'lik bir azalma gösteren hayvanları derhal çıkarın ve ötenazi yapın; azalmış / azalmış lokomotor aktivite ve bozulmuş tımar; 1 cm'> yaraları olan fareler; kopmuş penis veya ön ayakların şişmesi ile ısırık izleri.
      NOT: Birincil ötanazi, izofluran / CO2 gaz odaları aracılığıyla gerçekleştirilir, ardından servikal çıkık ile yapılan ikincil ötanazi yapılır.
4. Kontrol fareleri
   1. Günde 2 seans (ilk seans: sabah 9, ikinci seans: 14:00) olmak üzere 4 gün boyunca toplam 8 seans uygulayın. Kontrol farelerinin kafesi her seansta farklı bir C57BL / 6J varyantı ile paylaştığından emin olmak için bir program yapın (Ek Tablo 7 ve Ek Tablo 8'e bakınız).
      NOT: Kontrol fareleri bir saldırgana maruz kalmaz. Her yenilgi seansında yeni bir CD-1 faresine girişi taklit etmek için, kontrol fareleri her seansta yeni bir aynı cinsiyetten ve aynı yaştan türdeş (çöp olmayan) ile eşleştirilir.
   2. Kontrol farelerini sosyal yenilgi aparatında (Şekil 1) AcSD farelerininkinden ayrı bir odaya yerleştirin.
   3. Kafesin her iki tarafına birer tane olmak üzere kafes başına iki kontrol faresi yerleştirin. Fareleri kafesin farklı bir tarafında veya tamamen farklı bir kafeste barındırın, böylece kokuyu tanımazlar. Kontrol farelerini her seansta döndürün.

Şekil 1: Ergen fareler için hızlandırılmış sosyal yenilgi stresi (AcSD) için aparat . (A) Soldan sağa, çubuklar arasında 0,6 cm mesafe bulunan eşleştirilmiş çelik tel üst kısımlar, 0,6 cm delik çapında şeffaf delikli polikarbonat bölücü, tel üst kısımları sabitlemek için bağlayıcı klipsler, kapak kapaklı şeffaf fare kafesi (pamuk koruyucu tabaka olmadan). (B) Yukarı: yetişkinlerde kronik sosyal yenilgi için polikarbonat bölücüler (solda) ve ergenlerde AcSD (sağda) arasında karşılaştırma; Aşağı: Ergen fareler için polikarbonat bölücüye yakın. (C) Yukarı: yetişkinlerde kronik sosyal yenilgi için çelik tel tepeler (solda) ve ergenlerde AcSD (sağda) arasında karşılaştırma; Aşağı: çelik tel üst kısımların yakın çekimi. (D-F) Toplumsal yenilgi aygıtının bir araya getirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Sosyal etkileşim testi

1. Daha önce^57,58,59 açıklandığı gibi AcSD'yi takiben SIT'i gerçekleştirin.
   1. AcSD'nin son seansından 24 saat sonra SIT'i gerçekleştirin. SIT'i kırmızı ışık koşullarında (sarı ışık koşullarında değil) sabah 9 ile akşam 4 arasında gerçekleştirin.
   2. Ana kare arenayı ve baş üstü video kamerayı kurun (Malzeme Tablosuna bakın). Ana arena 3 alana ayrılmıştır: sosyal etkileşim bölgesi (SIZ), köşeler ve merkez; Bu alanlar arenada siyah bir çizgi ile işaretlenmelidir (siyah bir kalıcı işaretleyici kullanın). Her alan için aşağıdaki boyutları ve ölçütleri kullanın.
      1. SIZ'nin, kasayı çevreleyen 14 cm x 9 cm kare alan olduğundan emin olun. Köşeler, muhafazanın karşısındaki duvarın köşelerinde küçük, kare alanlardır (9 cm x 9 cm) ve SIZ'den en uzak noktayı temsil eder. Merkez, SIZ ile köşeler arasındaki alandır.
   3. Arenayı ve muhafazaları bir temizleme hidrojen peroksidaz solüsyonu ile temizleyin.
   4. Analiz için her hayvan için tanımlama etiketlerini yere yerleştirin. Çevrimdışı analiz için tüm hayvan davranışlarını kaydedin.
2. Temel keşfi belirlemek için ilk oturum
   1. Arenanın duvarlarından birine boş bir tel örgü muhafaza yerleştirin. Deneysel (mağlup veya kontrol) ergen C57BL/6 fareyi arenanın ortasına yerleştirin. 2,5 dakika boyunca arenayı özgürce keşfetmesine izin verin. Fareyi geri alın.
   2. Arenayı ve muhafazaları bir temizleme hidrojen peroksidaz solüsyonu ile temizleyin.
3. Sosyal etkileşim için ikinci oturum
   1. Tanımadığınız bir CD-1 fareyi tel örgü muhafazanın içine yerleştirin. Kasayı önceki oturumla aynı konuma yerleştirin.
   2. Aynı ergen C57BL/6 fareyi arenaya yeniden tanıtın. 2,5 dakika boyunca arenayı özgürce keşfetmesine izin verin. Fareleri alın.
   3. Arenayı ve muhafazaları bir temizleme hidrojen peroksidaz solüsyonu ile temizleyin.
   4. İşlemi tüm ergen C57BL / 6 fareleri (stresli ve kontrol fareleri) için dengeli bir sırayla tekrarlayın.
   5. Kullanım stresini ve yanlılığını azaltmak için SIT için birden fazla CD-1 fare kullanın (örneğin, 30 C57BL / 6 fareden oluşan bir kohort için 4 CD-1 fare kullanın). Onları ergen fareler arasında dengeleyin.
      NOT: Bu test, ilk olarak Krishnan⁵ ve Golden⁷ tarafından tanımlandığı gibi, deney farelerinin sosyal bir hedefe yaklaşma ve/veya kaçınma davranışını ölçer.
4. Analiz
   1. Testin her iki oturumu sırasında etkileşim bölgesinde ve köşelerde geçirilen süreyi kaydedin.
   2. Sosyal etkileşim oranını, CD-1 saldırganı varken etkileşim bölgesinde geçirilen sürenin, CD-1 saldırganı yokken etkileşim bölgesinde geçirilen süreye bölünmesiyle hesaplayın.
   3. Stresli fareleri 1.00 < duyarlı ve 1.00 ≥ dirençli olarak sınıflandırın.
   4. Lokomotor aktivitedeki farklılıkları kontrol etmek için ilk seans sırasında arenayı keşfetmeyen (yani, belirlenen alanlardan herhangi birinde 0 s geçiren) hayvanları tüm analizlerden hariç tutun.
   5. Temsili olmayan dayanıklı hayvanları önlemek için ≥4 sosyal yenilgi oturumunda 0 saldırı alan tüm hayvanları tüm analizlerden hariç tutun.
   6. Yüksek sosyal etkileşim oranlarının sosyal hedefteki gerçek ilgiyi yansıttığından emin olmak için etkileşim alanı içinde en az 61 saniye geçirmeyen fareleri (duyarlı değil) hariç tutun.
   7. Aykırı değer etkileşim oranı puanlarına sahip fareleri hariç tutun.

Sonuçlar

Ergen C57BL / 6 erkek farelerde (PND 21) kronik sosyal yenilgi stresi modeli kullanılarak toplam dört farklı deney yapıldı. Bununla birlikte, bu model, erken ergen C57BL / 6 farelerinde kullanımı için önemli sınırlamalar sunmuştur.

Ergen C57BL/6 fareler için gerekli ekipman modifikasyonları
İlk sınırlama, sosyal yenilgi aygıtı için kullanılan ekipmanın yetişkin fareler için tasarlanmış olmasıydı. Büyüklükleri nedeniyle, PND 21'deki ergen C57BL...

Tartışmalar

CD-1 farelerinde tutarlı, agresif davranış
Tarama aşamasında, CD-1 tarafından görüntülenen tüm davranışları (kovalama, takma davranışları, koklama, tımar etme veya ısırma) not etmek ve AcSD için CD-1 farelerini seçerken bu kayıtları yakından takip etmek çok önemlidir. Ergen fareye saldırmadan etkileşime giren bir CD-1 faresinin, hazırlama sırasında ergen farelere karşı saldırganlık geliştirmesi muhtemeldir. Buna karşılık, yetişkin bir fareye saldıran ancak erge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.