מודל לחץ תבוסה חברתית עבור עכברים מתבגרים C57BL/6 זכרים ונקבות

Summary

פיתחנו מודל לחץ חברתי מואץ עבור עכברי C57BL/6 מתבגרים, הפועל הן אצל זכרים והן אצל נקבות ומאפשר חשיפה במהלך תקופות התבגרות בדידות. חשיפה למודל זה גורמת להימנעות חברתית, אך רק בתת-קבוצה של עכברים זכרים ונקבות מובסים.

Abstract

מצוקה חברתית בגיל ההתבגרות נפוצה ויכולה להשפיע לרעה על מסלולי בריאות הנפש. מידול לחץ חברתי אצל מכרסמים מתבגרים זכרים ונקבות נחוץ כדי להבין את השפעותיו על התפתחות המוח המתמשכת ועל התוצאות ההתנהגותיות. פרדיגמת הלחץ החברתי הכרוני (CSDS) נמצאת בשימוש נרחב כדי למדל לחץ חברתי בעכברים זכרים בוגרים C57BL/6 על ידי מינוף ההתנהגות התוקפנית המוצגת על ידי מכרסם זכר בוגר לפולש הפולש לטריטוריה שלו. יתרון של פרדיגמה זו הוא שהיא מאפשרת לסווג עכברים מובסים לקבוצות עמידות ורגישות בהתבסס על ההבדלים האישיים שלהם בהתנהגות החברתית 24 שעות לאחר מפגש התבוסה האחרון. יישום מודל זה בעכברי C57BL/6 מתבגרים היה מאתגר מכיוון שעכברים בוגרים או מתבגרים אינם תוקפים בדרך כלל עכברים זכרים או נקבות בגיל ההתבגרות המוקדמות ומכיוון שגיל ההתבגרות הוא פרק זמן קצר, הכולל חלונות זמן דיסקרטיים של פגיעות. מגבלה זו התגברה על ידי התאמת גרסה מואצת של CSDS לשימוש עבור עכברים זכרים ונקבות מתבגרים. פרדיגמת מתח זו בת 4 ימים עם 2 מפגשי תקיפה פיזית ביום משתמשת בבוגר זכר C57BL/6 כדי לכוון את עכבר CD-1 לתוקפנות כך שהוא תוקף בקלות את העכבר המתבגר הזכר או הנקבה. מודל זה נקרא לחץ תבוסה חברתית מואצת (AcSD) עבור עכברים מתבגרים. חשיפה של מתבגרים ל- AcSD גורמת להימנעות חברתית 24 שעות מאוחר יותר הן אצל זכרים והן אצל נקבות, אך רק בתת-קבוצה של עכברים מובסים. פגיעות זו מתרחשת למרות שמספר ההתקפות עקבי בין הפעלות בין קבוצות עמידות ורגישות. מודל AcSD קצר מספיק כדי לאפשר חשיפה בתקופות דיסקרטיות בתוך גיל ההתבגרות, מאפשר הפרדה של עכברים על פי נוכחות או היעדר התנהגות של הימנעות חברתית, והוא המודל הראשון הזמין לחקר לחץ תבוסה חברתית אצל עכברות מתבגרות C57BL/6.

Introduction

פרדיגמת הלחץ של התבוסה החברתית הכרונית נמצאת בשימוש נרחב כדי למדל לחץ חברתי במכרסמים בוגרים לאחר יום הלידה (PND) >65 מכרסמים זכרים. פרדיגמה זו מבוססת על ההתנהגות התוקפנית הטבעית של מכרסם זכר בוגר כאשר פולש פולש לטריטוריה שלו. מודל זה משמש במגוון מיני מכרסמים, כולל חולדות, אוגרים ועכברים 1,2,3,4,5,6,7,8,9, והוא מורכב משילוב של תוקפנות פיזית ולחץ פסיכולוגי הנמשך כ-10 ימים, במהלכם מכרסם פולש מתנסה בכמה דקות של תוקפנות פיזית מהמכרסם התושב. שני המכרסמים נשארים בכלוב הביתי של הדייר, מופרדים על ידי מחיצה המאפשרת מגע חושי אך לא פיזי⁷. בניסויי עכברים, העכברים התושבים/התוקפנים הנפוצים ביותר הם מגדלים בדימוס עכברי CD-1 שוויצריים, המראים התנהגות טריטוריאלית חזקה נגד עכברים פולשים ^6,7. עבור העכברים הפולשים, הזן המאופיין ביותר הוא הזן C57BL/6 ^2,4,5. העכבר המובס נחשף לתוקפן חדש מדי יום כדי למנוע התרגלות לתוקפן. עכברי ביקורת שוכנים עם קונפרט שונה בכל יום. 24 שעות לאחר מפגש התבוסה האחרון, עכברי ניסוי נבדקים במבחן אינטראקציה חברתית (SIT) שבו הם יכולים לחקור שדה פתוח בהיעדר (ללא מטרה), או נוכחות של עכבר CD-1 חדשני (מטרה). עכברי בקרה מבלים זמן רב יותר באזור האינטראקציה עם המטרה לעומת החלק שאינו מטרה של המשימה. עכברים מובסים מסווגים כרגישים (יחס<1) או גמישים (יחס>1) על פי יחס אינטראקציה חברתית (הזמן שבילה באזור האינטראקציה עם התוקפן בהווה/זמן שבילה באזור האינטראקציה עם התוקפן נעדר). הליך זה מספק כלי שימושי לחקר הבדלים אינדיבידואליים בתגובה ללחץ.

עד לשנים האחרונות, מודל הלחץ החברתי הכרוני שימש בעיקר בעכברים זכרים בוגרים מכיוון שהיררכיות הדומיננטיות הגברית המודגשת כוללות לחימה נגד זכרים אך לא נגד נקבות ^6,7. יתר על כן, מכרסמים זכרים בדרך כלל אינם תוקפים נקבות; במקום זאת, הם עוסקים בהתנהגויות הזדווגות¹⁰. למרות מכשולים אלה, פותחו אסטרטגיות שונות כדי להתאים את פרדיגמת הלחץ של התבוסה החברתית הכרונית עבור נקבות עכברים בוגרות. לדוגמה, מודל העכבר הקליפורני לתבוסה חברתית מבוסס על תוקפנות טבעית של מין מונוגמי זה משני המינים בעת הגנה על הטריטוריה שלהם ^9,11. גישות אחרות מתמקדות בגרימת התנהגות תוקפנית של עכברי CD-1 על ידי גירוי ההיפותלמוס הוונטרומדיאלי שלהם להתנהגות תוקפנית עקבית ^10,12, או על ידי מריחת שתן זכרי בעכברות הבוגרות הניסיוניות כדי לקבל התקפות מתוקפי CD-1¹³. תוקפנות מוגברת ועקבית זו של עכברי CD-1 היא קריטית עבור עכבר הפולש הניסיוני להראות סימנים התנהגותיים ברורים של כפיפות כלפי התקפות חוזרות ונשנות על ידי התוקפן במהלך האינטראקציה⁶.

התאמת מודל התבוסה החברתית הכרונית לשימוש בעכברי C57BL/6 מתבגרים
גיל ההתבגרות הוא תקופה המאופיינת בהתבגרות פסיכו-סוציאלית משמעותית, המתרחשת במקביל לשינויים בארכיטקטורה המיקרו והמאקרו של המוח, במיוחד בקליפת המוח הקדם-מצחית. הן בבני אדם והן במכרסמים, אין הסכמה לגבי תחילתה וסיומה הספציפיים של תקופת ההתבגרות^14,15. יתר על כן, ישנם חלונות קריטיים של פגיעות בגיל ההתבגרות לשיבוש כתוצאה מחוויה של התפתחות מוחית וקוגניטיבית מתמשכת 16,17,18,19. גיל ההתבגרות וההתבגרות מתרחשים בו זמנית, אך מונחים אלה אינם נרדפים. ההתבגרות המינית מסמלת את תחילת ההתבגרות המינית, ואילו גיל ההתבגרות מייצג שלב רחב יותר המאופיין במעבר הדרגתי ממצב נעורים להשגת עצמאות²⁰ . קבוצות שונות הציעו כי גיל ההתבגרות בעכברים משתרע מגמילה (PND 21) ועד בגרות (PND 60)²¹. בפרט, ניתן להתייחס לגיל ההתבגרות המוקדם כאל השבוע הראשון והשני שלאחר הגמילה (PND 21-34) ואמצע גיל ההתבגרות כתקופת PND 35-48. טווחים אלה כוללים תקופות התפתחות דיסקרטיות הנוגעות למשל להתפתחות מערכת הדופמין 22,23,24, פגיעות להשפעות תרופתיות על התפתחות רשתות נוירונים 17,25,26,27, ומאפיינים התנהגותיים מובהקים 16,20,28,29,30 .

התנהגות לחימה מעכבר תושב נדרשת לפרוטוקול התבוסה החברתית. עם זאת, בדומה לנקבות עכברים, זכרים בדרך כלל אינם עוסקים באינטראקציות אגרסיביות עם עכברים מתבגרים מוקדמים, אולי משום שהם אינם תופסים אותם כאיום. רוב המחקרים שבדקו את ההשפעות של תבוסה חברתית כרונית בעכברי C57BL/6 בגיל ההתבגרות בוצעו במהלך תקופת אמצע גיל ההתבגרות 31,32,33,34,35; אחרים אינם מציינים את יום החשיפה שלאחר הלידה^36,37, או מאריכים את ימי התבוסה לבגרות המוקדמת³⁸ או אינם מאפשרים מגע חושי³⁹; מחקרים אחרים על עכברים מתבגרים משתמשים בזנים שונים^40,41. המאפיינים של מחקרים אלה המשתמשים בסטרס כרוני של תבוסה חברתית בעכברים זכרים מתבגרים מסוכמים בטבלה 1.

קבוצת המחקר שלנו מעוניינת להתמקד בחלונות חשיפה ספציפיים של מתבגרים, כולל גיל ההתבגרות המוקדם, בעכברי C57BL/6. בגלל משך הזמן הקצר של תקופות ההתבגרות השונות, תוכננה גרסה שונה של הגרסה המואצת של פרדיגמת הלחץ התבוסה החברתית הכרונית⁴². מודל זה נקרא לחץ תבוסה חברתית מואצת (AcSD) עבור עכברים מתבגרים. עבודות קודמות מראות כי קיימים הבדלים משמעותיים בין המינים ברגישות ללחץ חברתי בגיל ההתבגרות בחולדות ^{8,26,43,44,45}, כמו גם בהשפעות המזיקות של לחץ חברתי על מסלולי בריאות הנפש בבני אדם 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56. מודל AcSD עובד ביעילות גם עבור עכברות מתבגרות, ומאפשר להן לחקור השלכות פוטנציאליות ספציפיות למין, כמו גם לחקור את הבסיס הנוירוביולוגי.

טבלה 1: מחקרים המשתמשים בפרדיגמות לחץ של תבוסה חברתית בעכברים זכרים מתבגרים. זן ומינים: עכבר קליפורניה: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 inbred mouse strain. C57BL/6J: M. musculus שחור 6 מודל עכבר מוטבע שסופק על ידי מעבדות ג'קסון. CD-1: M. musculus מזן עכבר לבקנים שוויצרי. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research גבר על זן עכברים לבקנים. OF1: M. musculus Oncins France 1 זן עכבר לבקנים.
קיצורים: wk = שבוע; PND = יום לאחר הלידה; res = גמיש; sus = רגיש; unsus = לא רגיש. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Protocol

הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי אוניברסיטת מקגיל וועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים דאגלס (מספר אישור ניסויים בבעלי חיים: 2005-5084). כל העכברים שוכנו בחדר מושבה מבוקר טמפרטורה ולחות (21-22 מעלות צלזיוס; 60%) ובמחזור אור-חושך של 12 שעות (אור דולק בשעה 8:00 שעות) במרכז נוירופנוטיפ של המכון האוניברסיטאי לבריאות הנפש דאגלס. לעכברים הייתה גישה למזון ומים לאורך כל הניסויים. עכברים חולקו באופן אקראי לכל תנאי ניסוי. חיות ניסוי התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). טבלה 2 מסכמת את מאפייני בעל החיים עבור כל שלב ניסוי. בסך הכל, 489 עכברי C57BL/6J מתבגרים (259 זכרים; 230 נקבות) שימשו ב-20 קבוצות ניסוי.

טבלה 2: נבדקים בבעלי חיים עבור כל שלב ניסוי. ^†אם בעלי חיים אלה אינם פצועים קשה, ניתן לעשות בהם שימוש חוזר לצורך הקדמה. ^‡אם בעלי חיים אלה אינם פצועים קשה, ניתן לעשות בהם שימוש חוזר להכנה במהלך AcSD, ^§מרכז נוירופנוטיפ של המכון האוניברסיטאי לבריאות הנפש דאגלס. ^¶לניסויים עם זכרים, ^#לניסויים עם נקבות, אם התבוסה מעורבת, השתמשו בנקבות לפריימינג. ^††אין להשתמש עבור AcSD. קיצורים: AcSD = מתח תבוסה חברתית מואצת; PND = יום לאחר הלידה אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

1. התאקלמות

הערה: שלב זה אמור להימשך שבוע אחד לפחות.

1. רכשו עכברי CD-1 זכרים שפרשו לגמלאות (ראו טבלת חומרים) מעל גיל 4 חודשים וכמות כפולה מזו של עכברי C57BL/6J מתבגרים (כלומר, אם 10 עכברים יהיו חשופים ללחץ, רכשו 20 עכברי CD-1).
   הערה: מומלץ לרכוש כמות זו של עכברי CD-1 מכיוון שרק חלק קטן מעכברי CD-1 מראים התנהגות תוקפנית כלפי עכברים מתבגרים.
2. תנו לעכברי CD-1 להתרגל למתקן החדש בכלוב הביתי שלהם עם מזון ומים למשך שבוע לפני ההקרנה והפריימינג.
3. השתמש ב- C57BL/6 ב- PND >65 (מבוגרים) וב- PND 25 ± 3 (מתבגרים) (טבלה 2) עבור מפגשי ההקרנה והפריימינג. רכוש 4 עכברי C57BL/6 בכל גיל ליום של פריימינג (כלומר, במשך 3 ימים של פריימינג, רכוש 12 PND >65 ו- 12 PND 25 ± 3) כדי להפחית את הסיכון לפציעות מכיוון שבעלי חיים אלה יועסקו שוב ושוב בתהליך סינון ופריימינג.

2. הקרנת CD-1 ופריימינג

הערה: משך שלב זה הוא 3 ימים של הקרנה (יום אחד עבור נקבות עכברים) ו 3-4 ימים של פריימינג (זה יכול לעלות עבור עכברות נקבות בהתאם להתנהגות התוקפנית של עכברי CD-1).

1. השתמש בהגדרה המבצעית של התקפה כדי לרשום את ההתקפות של CD-1 כמתואר להלן.
   1. התקפה אחת מוגדרת כאשר עכבר CD-1 נושך את עכבר C57BL/6J, ועכבר C57BL/6J מתרחק בתגובה לנשיכה. נשיכה מוגדרת כאשר עכבר CD-1 מניח את שיניו על חלק כלשהו בגוף העכבר C57BL/6J. התרחקות מוגדרת כמצב שבו עכבר C57BL/6J מזיז את שתי כפותיו האחוריות מהמיקום שבו היו לפני שה-CD-1 הפעיל אותו.
   2. ודא שיש הבדל של לפחות ~2 שניות בין התקפות נפרדות. אם מתרחשת יותר מנשיכה אחת בהפרש של <2 שניות, יש לספור כהתקף אחד.
   3. אם עכבר CD-1 נושך יותר מפעם אחת ברציפות ללא הפסקה (<~ 2 שניות זה מזה), הפריד בעדינות בין בעלי חיים באמצעות סרגל פלסטיק. אם עכבר CD-1 נושך ולא מרפה, הפרידו בעדינות בין בעלי החיים. אם עכבר C57BL/6J נלכד בפינה או מוצמד על ידי עכבר CD-1 ואינו יכול לזוז משם בתגובה לנשיכה, הפרד בעדינות בין בעלי חיים באמצעות סרגל. ספרו את כל אלה כהתקפה אחת (עד הפרדה).
2. ההקרנה
   1. השתמשו בכפפות לבדיקת ניטרילים לכל טיפול בבעלי חיים והימנעו משימוש בבושם או ניחוחות.
   2. בצע את היום^הראשון של ההקרנה רק עם עכברים זכרים בוגרים C57BL/6 כפולשים (PND >65) בכלוב הביתי של עכברי CD-1. תמיד לסנן את עכברי CD-1 לפני ניסוי חדש.
   3. הצג עכבר זכר בוגר C57BL/6 PND >65 בכלוב הביתי של עכבר זכר CD-1 למשך 3 דקות. רשום את ההשהיה לתוקפנות הראשונה וכמה תוקפנות מבוצעות (ראה טבלה משלימה 1).
   4. מיום ה-2^ועד היום האחרון של ההקרנה, הציגו זכר בוגר C57BL/6 PND>65 למשך דקה אחת (מוגבל ל-30 שניות אם ה-CD-1 אגרסיבי מאוד) ולאחר מכן החליפו אותו ב-C57BL/6 PND 25 ± 3 למשך 5 דקות.
      הערה: חשוב לבצע את הבדיקה עם עכברים מתבגרים מכיוון שלא כל העכברים התוקפים את העכבר הזכר C57BL/6 הבוגר יתקפו את העכבר המתבגר C57BL/6. למעשה, עכברי CD-1 התוקפים עכברים מתבגרים לא תמיד יתקפו זכרי C57BL/6 בוגרים.
   5. אם הניסוי נועד לתוקפנות כלפי נקבות עכברים, בצעו את הסינון והפריימינג עם נקבות עכברים מתבגרות, גם אם עכברי הניסוי כוללים את שני המינים.
   6. רשום את ההשהיה לתוקפנות הראשונה, את מספר ההתקפות ואת הפצעים שקיבלו כל עכברי C57BL/6 (ראה טבלה משלימה 2).
   7. רשום כל סוג של אינטראקציה: מרדף, התנהגויות גוברות, רחרוח, טיפוח או נשיכה. הירשם אם CD-1 אינו מתקרב לעכברי C57BL/6 מתבגרים; אם אופן פעולה זה חוזר על עצמו במשך יומיים, אל תכלול את CD-1 ב- Priming.
   8. עבור שלב הפריימינג, בחר את כל עכברי CD-1 המציגים התנהגויות כגון מרדף, התנהגויות הרכבה, רחרוח, מעקב, טיפוח או נשיכה של C57BL/6 המתבגר.
   9. שמור את עכברי CD-1 שלא נבחרו והשתמש בהם למבחן האינטראקציה החברתית (SIT).
      הערה: התנהגות טריטוריאלית עולה עם הזמן; לכן, עכברי CD-1 שלא נבחרו עלולים להיות תוקפניים כלפי עכברים מתבגרים בניסוי הבא.
3. התנהגות תוקפנית של CD-1
   1. אחסנו את עכברי ה-CD-1 שנבחרו להכנה בכלוב הביתי שלהם עד היום האחרון של הפריימינג.
   2. הציגו עכבר זכר בוגר מסוג C57BL/6J PND >65 למשך 30 שניות לכלוב הביתי CD-1 ולאחר מכן החליפו אותו בעכבר C57BL/6 PND 25 ± 3 מתבגרים למשך 5 דקות.
   3. רשום את ההשהיה לתוקפנות הראשונה, את מספר ההתקפות וכל אינטראקציה (ראה טבלה משלימה 3).
   4. בצע את ההכנה 2 פעמים ביום במשך 3-4 ימים באותו זמן התבוסות מתוכננות (9:00 בבוקר ו 2:00 אחר הצהריים).
      הערה: לא כל עכברי CD-1 יתקפו את העכברים המתבגרים במהלך הימים הראשונים, במיוחד אם הפריימינג הוא כלפי נקבות עכברים. מספר הימים להכנה יכול לעלות או לרדת בהתאם להתנהגות התוקפנית המוצגת על ידי עכברי CD-1.
   5. כדי להפחית את מספר ימי ההקדמה, עשו שימוש חוזר בעכברי CD-1 שעברו ניסוי תבוסה חברתית קודם עם עכברים זכרים. אם עכברי CD-1 אינם מראים תוקפנות מוגברת, האריכו את ימי ההכנה עד שיגיעו לקריטריונים.
   6. קצר את ימי ההכנה אם עכברי CD-1 מראים התנהגות תוקפנית קיצונית (עכברי C57BL/6 מראים פציעה מוגזמת) כדי למנוע פציעות חמורות במהלך תבוסה חברתית.
   7. עבור השלב הבא של הניסוי, בחר את עכברי CD-1 שתוקפים את העכברים המתבגרים לפחות 10x (זכרים) או 5x (נקבות) במשך יומיים רצופים.

3. פרוטוקול AcSD

הערה: שלב זה מורכב מ-3 ימי התרגלות ו-4 ימי חשיפה ל-AcSD.

1. התרגלות
   1. הכינו את כלובי החולדות לתבוסה חברתית (איור 1A-F). חלקו את כלובי החולדות לשני תאים באמצעות מחיצות מתאימות מזכוכית אקרילית (איור 1B,D; ראו טבלת חומרים).
   2. הוסיפו מצעי עץ קשים משני צידי הכלוב, הוסיפו ריבוע כותנה לכל צד כחומר מצע (איור 1D). ודא שראש החוט מאובטח באמצעות תפסי קלסרים (איור 1E). ודאו שכלוב החולדות מכוסה במכסה הכיסוי ללא כותנת המגן (איור 1F).
   3. הניחו עכבר CD-1 לכל כלוב בצד אחד של הכלוב. הניחו תג בצד החיצוני של הכלוב לזיהוי קל של כל עכבר.
   4. אחסן את עכברי CD-1 שנבחרו במנגנון התבוסה החברתית (איור 1F) יומיים או שלושה לפני הפעלת פרוטוקול AcSD (כדי לשפר את ההתנהגות הטריטוריאלית של CD-1).
   5. לבצע פגישה ראשונית 1 יום לפני הניסוי; זה חשוב כדי לשמור על תוקפנות עקבית.
2. מפגשי תבוסה
   1. בצעו 2 מפגשים ביום (מפגש ראשון: 9:00, מפגש שני: 14:00) במשך 4 ימים, 8 מפגשים בסך הכל. קבע לוח זמנים כדי להבטיח שהתוקפן יהיה שונה עבור כל מפגש (ראה טבלה משלימה 4 וטבלה משלימה 5).
   2. שקול את העכבר המתבגר C57BL/6 לפני הצגתו לצד CD-1 של הכלוב. הכנס עכבר C57BL/6 זכר בוגר >65 למשך 30 שניות לצד CD-1 של כלוב התבוסה ולאחר מכן החלף אותו בעכבר C57BL/6 PND 24-28 מתבגר לפרק תבוסה ארוך של 10 דקות או 10 התקפות לכל היותר בכל הפעלה.
   3. הפרידו את החיות לאחר כל התקפה בעזרת סרגל פלסטיק. לאחר כל מפגש של תבוסה, לבדוק פציעות, ולטפל בהם עם קרם לשיכוך כאבים. רשום את מספר הפציעות.
   4. הניחו את עכבר C57BL/6J המתבגר בתא החופשי ליד תוקפן לא מוכר עד לפגישה הבאה. חזור על ההליך עם תוקפן אחר בכל פגישה.
   5. התחל את הפגישה עם עכברי הניסוי והתוקפן שלא היו מזווגים בפגישה הקודמת. עקוב אחר הפציעות של עכברים זכרים בוגרים C57BL/6J המשמשים לפריימינג (ראה טבלה משלימה 6).
3. עקוב אחר ההמלצות הבאות עבור רווחת בעלי חיים ונקודות קצה הומאניות.
   1. בצע את נוהל ההפעלה הסטנדרטי של ועדת הבדיקה המוסדית המתאימה לתבוסות חברתיות והבטח הערכה וטרינרית מתמדת.
   2. עקוב אחר בריאותם של עכברים במהלך המחקר כדי למנוע סבל ומוות של בעלי חיים.
   3. ודא שהמחיצה המחוררת מוגדרת כראוי כדי למנוע מעבר עכברים לתא השני.
   4. יש להודיע לצוות הווטרינרי כאשר לבעל חיים יש פצע לצורך מעקב מתאים ולמרוח קרם לשיכוך כאבים מדי יום עד להחלמה מוחלטת של הפצע.
   5. אם הפציעה מחמירה (הפצעים גדלים), הגבילו את ההתקפים ל-5 בפגישה הבאה כדי לאפשר התאוששות. בדוק אם יש פציעות חמורות. פציעות חמורות מוגדרות כפציעות בהיקף של > 1 ס"מ.
   6. להסיר ולהרדים באופן מיידי בעלי חיים תוך הפחתה של 15%-20% ממשקלם ממשקל גופם ההתחלתי; פעילות מוטורית מופחתת/מופחתת וטיפוח לקוי; עכברים עם פצעים > 1 ס"מ; פין קטוע, או סימני נשיכה עם נפיחות של הגפיים הקדמיות.
      הערה: המתת חסד ראשונית מתבצעת באמצעות תאי גזים איזופלורן / CO2 ואחריה המתת חסד משנית הנעשית על ידי פריקת צוואר הרחם.
4. עכברי בקרה
   1. בצעו 2 מפגשים ביום (מפגש ראשון: 9:00, מפגש שני: 14:00) במשך 4 ימים, 8 מפגשים בסך הכל. קבעו לוח זמנים כדי להבטיח שעכברי הביקורת יחלקו את הכלוב עם C57BL/6J שונה בכל מפגש (ראו טבלה משלימה 7 וטבלה משלימה 8).
      הערה: עכברי ביקורת אינם חשופים לתוקפן. כדי לחקות את ההקדמה לעכבר CD-1 חדשני בכל סשן תבוסה, עכברי ביקורת משויכים לעכבר חדש מאותו מין ומאותו גיל ספציפי (שאינו חבר להמלטה) בכל סשן.
   2. מקמו את עכברי הבקרה במנגנון התבוסה החברתית (איור 1) בחדר נפרד מזה של עכברי AcSD.
   3. הניחו שני עכברי ביקורת בכל כלוב, אחד בכל צד של הכלוב. שכן את העכברים בצד אחר של הכלוב או בכלוב אחר לגמרי, כך שהם לא יזהו את הריח. סובב את עכברי הבקרה בכל הפעלה.

איור 1: מנגנון לדחק תבוסה חברתית מואץ (AcSD) עבור עכברים מתבגרים. (A) משמאל לימין, צמרות חוטי פלדה מזווגים עם הפרדה של 0.6 ס"מ בין הסורגים, מחיצת פוליקרבונט מחוררת שקופה בקוטר נקבים של 0.6 ס"מ, אטבי קלסרים לאבטחת ראשי החוטים, כלוב חולדות שקוף עם מכסה כיסוי (ללא שכבת מגן כותנה). (B) למעלה: השוואה בין מחיצות הפוליקרבונט לתבוסה חברתית כרונית במבוגרים (משמאל) לבין AcSD במתבגרים (מימין); למטה: קרוב למחיצת הפוליקרבונט לעכברים מתבגרים. (C) למעלה: השוואה בין צמרות חוטי הפלדה לתבוסה חברתית כרונית במבוגרים (משמאל) לבין AcSD במתבגרים (מימין); למטה: תקריב של צמרות חוטי הפלדה. (ד-ו) הרכבת מנגנון התבוסה החברתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מבחן אינטראקציה חברתית

1. בצע את SIT לאחר AcSD כפי שתואר קודם 57,58,59.
   1. בצע את SIT 24 שעות לאחר ההפעלה האחרונה של AcSD. בצע את SIT בתנאי אור אדום (לא בתנאי אור צהוב) בין השעות 09:00-16:00.
   2. הגדר את הזירה הראשית בריבוע ואת מצלמת הווידאו העילית (ראה טבלת חומרים). הזירה המרכזית מחולקת לשלושה אזורים: אזור האינטראקציה החברתית (SIZ), הפינות והמרכז; אזורים אלה צריכים להיות מסומנים בזירה בקו שחור (השתמש בטוש קבוע שחור). השתמש בממדים ובקריטריונים הבאים עבור כל אזור.
      1. ודא שה-SIZ הוא השטח הריבועי בגודל 14 ס"מ x 9 ס"מ, המקיף את המתחם. הפינות הן שטחים קטנים ומרובעים (9X9 ס"מ) בפינות הקיר מול המתחם ומייצגות את הנקודה הרחוקה ביותר מה-SIZ. המרכז הוא השטח שבין ה-SIZ לפינות.
   3. נקו את הזירה ואת המתחמים בתמיסת מימן פרוקסידאז לניקוי.
   4. הניחו תגי זיהוי לכל חיה על הרצפה לצורך ניתוח. תעד את כל התנהגות בעלי החיים לניתוח לא מקוון.
2. מפגש ראשון לקביעת חקירה בסיסית
   1. הניחו מתחם רשת תיל ריק על אחד מקירות הזירה. מקם את עכבר הניסוי (המובס או הנשלט) C57BL/6 במרכז הזירה. אפשרו לו לחקור את הזירה בחופשיות במשך 2.5 דקות. אחזר את העכבר.
   2. נקו את הזירה ואת המתחמים בתמיסת מימן פרוקסידאז לניקוי.
3. מפגש שני לאינטראקציה חברתית
   1. מקם עכבר CD-1 לא מוכר בתוך מארז רשת התיל. מקם את המארז באותו מיקום כמו בהפעלה הקודמת.
   2. הציגו מחדש את אותו עכבר C57BL/6 מתבגר לזירה. אפשרו לו לחקור את הזירה בחופשיות במשך 2.5 דקות. אחזר את העכברים.
   3. נקו את הזירה ואת המתחמים בתמיסת מימן פרוקסידאז לניקוי.
   4. חזור על התהליך עבור כל עכברי C57BL/6 מתבגרים (עכברי לחץ וביקורת) בסדר מאוזן.
   5. השתמש ביותר מעכבר CD-1 אחד עבור SIT כדי להפחית את הלחץ וההטיות של הטיפול (לדוגמה, עבור קבוצה של 30 עכברי C57BL/6, השתמש ב- 4 עכברי CD-1). לאזן אותם בין העכברים המתבגרים.
      הערה: מבחן זה מודד את הגישה ו/או התנהגות ההימנעות של עכברי הניסוי כלפי מטרה חברתית, כפי שתואר לראשונה על ידי קרישנאן⁵ וגולדן⁷.
4. ניתוח
   1. רשמו את הזמן שבילו באזור האינטראקציה ובפינות במהלך שני מפגשי המבחן.
   2. חשב את יחס האינטראקציה החברתית כזמן המושקע באזור האינטראקציה עם התוקפן CD-1 נוכח חלקי הזמן המושקע באזור האינטראקציה עם התוקפן CD-1 נעדר.
   3. סווגו עכברים לחוצים עם יחס < 1.00 כרגישים ויחס ≥ 1.00 כגמישים.
   4. אין לכלול בעלי חיים שאינם חוקרים את הזירה במהלך המפגש הראשון (כלומר, בילו 0 שניות בכל אחד מהאזורים המיועדים לכך) מכל הניתוחים כדי לשלוט בהבדלים בפעילות המוטורית.
   5. אל תכלול את כל בעלי החיים שקיבלו 0 התקפות ב-≥4 מפגשי תבוסה חברתית מכל הניתוחים כדי למנוע בעלי חיים עמידים שאינם מייצגים.
   6. אל תכלול עכברים (שאינם רגישים) שאינם מבלים לפחות 61 שניות בתוך אזור האינטראקציה כדי להבטיח שיחסי אינטראקציה חברתית גבוהים משקפים עניין ממשי ביעד החברתי.
   7. אל תכלול עכברים עם ציוני יחס אינטראקציה חריגים.

תוצאות

בסך הכל בוצעו ארבעה ניסויים שונים באמצעות מודל הלחץ הכרוני של תבוסה חברתית בעכברים זכרים מתבגרים C57BL/6 (PND 21). עם זאת, מודל זה הציג מגבלות חשובות לשימוש בו בעכברי C57BL/6 בגיל ההתבגרות המוקדם.

ציוד נדרש לשינויים עבור עכברי C57BL/6 מתבגרים
המגבלה הראשונה הייתה שהציוד ששימש ...

Discussion

התנהגות עקבית ותוקפנית בעכברי CD-1
במהלך שלב המיון, חשוב מאוד לשים לב לכל ההתנהגויות המוצגות על ידי CD-1 (מרדף, התנהגויות הרכבה, רחרוח, טיפוח או נשיכה) ולעקוב מקרוב אחר רשומות אלה בעת בחירת עכברי CD-1 עבור AcSD. סביר להניח כי עכבר CD-1 אשר אינטראקציה עם העכבר המתבגר מבלי לתקוף אותו יפתח תוק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.