Modelo de Estrés de Derrota Social para Ratones Adolescentes C57BL/6 Machos y Mujeres

Resumen

Desarrollamos un modelo de estrés de derrota social acelerado para ratones C57BL/6 adolescentes, que funciona tanto en machos como en hembras y permite la exposición durante períodos discretos de la adolescencia. La exposición a este modelo induce la evitación social, pero solo en un subconjunto de ratones machos y hembras derrotados.

Resumen

La adversidad social en la adolescencia es frecuente y puede tener un impacto negativo en las trayectorias de salud mental. Es necesario modelar el estrés social en roedores machos y hembras adolescentes para comprender sus efectos en el desarrollo continuo del cerebro y los resultados conductuales. El paradigma del estrés por derrota social crónica (CSDS, por sus siglas en inglés) se ha utilizado ampliamente para modelar el estrés social en ratones machos C57BL/6 adultos, aprovechando el comportamiento agresivo mostrado por un roedor macho adulto ante un intruso que invade su territorio. Una ventaja de este paradigma es que permite categorizar a los ratones derrotados en grupos resilientes y susceptibles en función de sus diferencias individuales en el comportamiento social 24 h después de la última sesión de derrota. La implementación de este modelo en ratones C57BL/6 adolescentes ha sido un desafío porque los ratones adultos o adolescentes no suelen atacar a ratones machos o hembras adolescentes tempranos y porque la adolescencia es un período corto de la vida, que abarca ventanas temporales discretas de vulnerabilidad. Esta limitación se superó mediante la adaptación de una versión acelerada de la CSDS para su uso en ratones machos y hembras adolescentes. Este paradigma de estrés de 4 días con 2 sesiones de ataque físico por día utiliza un macho adulto C57BL/6 para preparar al ratón CD-1 para una agresividad tal que ataque fácilmente al ratón adolescente macho o hembra. Este modelo se denominó estrés de derrota social acelerado (AcSD) para ratones adolescentes. La exposición de los adolescentes a la AcSD induce una evitación social 24 horas más tarde tanto en machos como en hembras, pero solo en un subconjunto de ratones derrotados. Esta vulnerabilidad se produce a pesar de que el número de ataques es coherente en todas las sesiones entre grupos resistentes y susceptibles. El modelo AcSD es lo suficientemente corto como para permitir la exposición durante períodos discretos dentro de la adolescencia, permite la segregación de ratones de acuerdo con la presencia o ausencia de comportamiento de evitación social, y es el primer modelo disponible para estudiar el estrés de derrota social en ratones hembra C57BL/6 adolescentes.

Introducción

El paradigma del estrés de derrota social crónica es ampliamente utilizado para modelar el estrés social en roedores adultos de día postnatal (DPN) >65 machos. Este paradigma se basa en el comportamiento agresivo natural de un roedor macho adulto cuando un intruso invade su territorio. Este modelo se utiliza en una variedad de especies de roedores, incluyendo ratas, hámsters y ratones 1,2,3,4,5,6,7,8,9, y consiste en una combinación de agresión física y estrés psicológico que dura unos 10 días, durante los cuales un roedor intruso experimenta unos minutos de agresión física por parte del roedor residente. Los dos roedores permanecen en la jaula del hogar del residente, separados por un divisor que permite el contacto sensorial pero no físico⁷. En experimentos con ratones, los ratones residentes/agresores más utilizados son ratones CD-1 suizos reproductores retirados, que muestran un comportamiento territorial robusto frente a ratones intrusos ^6,7. Para los ratones intrusos, la cepa mejor caracterizada es la cepa endogámica C57BL/6 ^2,4,5. El ratón derrotado está expuesto a un nuevo agresor todos los días para evitar la habituación al agresor. Los ratones de control se alojan con un congénere diferente cada día. A las 24 h después de la última sesión de derrota, los ratones experimentales se someten a una prueba de interacción social (SIT) en la que pueden explorar un campo abierto en ausencia (sin objetivo) o en presencia de un nuevo ratón CD-1 (objetivo). Los ratones de control pasan más tiempo en la zona de interacción con el objetivo que en la parte no objetivo de la tarea. Los ratones derrotados se clasifican como susceptibles (ratio<1) o resilientes (ratio>1) según una relación de interacción social (tiempo pasado en la zona de interacción con el agresor presente/tiempo pasado en la zona de interacción con el agresor ausente). Este procedimiento proporciona una herramienta útil para estudiar las diferencias individuales en respuesta al estrés.

Hasta hace pocos años, el modelo de estrés de derrota social crónica se ha utilizado principalmente en ratones machos adultos, ya que las jerarquías de dominancia masculina acentuadas implican luchar contra los machos pero no contra las hembras ^6,7. Además, los roedores machos no suelen atacar a las hembras; En cambio, se involucran en comportamientos de apareamiento¹⁰. A pesar de estos obstáculos, se han desarrollado diferentes estrategias para adaptar el paradigma del estrés de derrota social crónica en ratones hembra adultos. Por ejemplo, el modelo de derrota social del ratón de California se basa en la agresión natural de esta especie monógama de ambos sexos al defender su territorio ^9,11. Otros enfoques se centran en inducir el comportamiento agresivo de los ratones CD-1 estimulando su hipotálamo ventromeal para que tenga un comportamiento agresivo consistente^10,12, o mediante la aplicación de orina masculina en los ratones hembra adultos experimentales para recibir ataques de los agresores CD-1¹³. Esta agresión intensificada y consistente de los ratones CD-1 es fundamental para que el ratón intruso experimental muestre claros signos conductuales de subordinación hacia los ataques repetidos del agresor durante la duración de la interacción⁶.

Adaptación del modelo de derrota social crónica para su uso en adolescentes C57BL/6rate
La adolescencia es un período marcado por una maduración psicosocial sustancial, que se desarrolla en paralelo con cambios en la arquitectura micro y macro del cerebro, particularmente en la corteza prefrontal. Tanto en humanos como en roedores, existe poco consenso en cuanto al inicio y final específico del período adolescente^14,15. Además, existen ventanas críticas de vulnerabilidad dentro de la adolescencia para la interrupción inducida por la experiencia del desarrollo cerebral y cognitivo en curso 16,17,18,19. La pubertad y la adolescencia ocurren al mismo tiempo, pero estos términos no son sinónimos. La pubertad significa el inicio de la maduración sexual, mientras que la adolescencia representa una fase más amplia caracterizada por el paso gradual de un estado juvenil al logro de la independencia²⁰. Diferentes grupos han sugerido que la adolescencia en ratones abarca desde el destete (PND 21) hasta la edad adulta (PND 60)²¹. En particular, la adolescencia temprana puede denominarse primera y segunda semana después del destete (PND 21-34) y la adolescencia media como el período PND 35-48. Estos rangos abarcan períodos de desarrollo discretos en relación, por ejemplo, con el desarrollo del sistema dopaminérgico 22,23,24, la vulnerabilidad a los efectos de las drogas en las redes neuronales en desarrollo 17,25,26,27 y características conductuales distintas 16,20,28,29,30.

El comportamiento de lucha del ratón residente es necesario para el protocolo de derrota social. Sin embargo, al igual que con los ratones hembra, los machos no suelen participar en interacciones agresivas con ratones adolescentes tempranos, posiblemente porque no los perciben como una amenaza. La mayoría de los estudios que exploran los efectos de la derrota social crónica en ratones C57BL/6 adolescentes se han realizado durante el período de la adolescencia media 31,32,33,34,35; otros no especifican el día postnatal de la exposición adolescente ^36,37, o amplían los días para la derrota a la adultez temprana³⁸ o no permiten el contacto sensorial³⁹; Otros estudios en ratones adolescentes utilizan diferentes cepas^40,41. Las características de estos estudios que utilizan el estrés crónico de derrota social en ratones machos adolescentes se resumen en la Tabla 1.

Nuestro grupo de investigación está interesado en enfocarse en ventanas específicas de exposición de adolescentes, incluida la adolescencia temprana, en ratones C57BL/6. Debido a la corta duración de los diferentes períodos de la adolescencia, se diseñó una versión modificada de la versión acelerada del paradigma del estrés de derrota social crónica⁴². Este modelo se denominó estrés de derrota social acelerado (AcSD) para ratones adolescentes. Trabajos previos muestran que existen diferencias significativas entre los sexos en la sensibilidad al estrés social en la adolescencia en ratas ^{8,26,43,44,45}, así como en los efectos nocivos del estrés social en las trayectorias de salud mental en humanos 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56. El modelo AcSD también funciona eficazmente para ratones hembra adolescentes, lo que les permite investigar las posibles consecuencias específicas del sexo, así como explorar la base neurobiológica.

Tabla 1: Estudios que utilizan paradigmas de estrés de derrota social en ratones machos adolescentes. Cepa y especie: Ratón de California: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus negro 6 cepa de ratón endogámico. C57BL/6J: Modelo de ratón endogámico M . musculus black 6 proporcionado por los laboratorios de Jackson. CD-1: M. musculus de la cepa de ratones albinos suizos. ICR: M . musculus Institute of Cancer Research superó a la cepa de ratones albinos. OF1: M. musculus Oncins France 1 cepa de ratón albino supercriado.
Abreviaturas: semana = semana; PND = Día postnatal; res = resiliente; sus = susceptible; unsus = insusceptible. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Protocolo

Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad McGill y el Hospital Douglas (número de aprobación de experimentos con animales: 2005-5084). Todos los ratones se alojaron en una sala de colonias con temperatura y humedad controladas (21-22 °C; 60%) y en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (se enciende a las 8:00 h) en el Centro de Neurofenotipado del Instituto Universitario de Salud Mental Douglas. Los ratones tuvieron acceso ad libitum a comida y agua durante todos los experimentos. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a cada condición experimental. Los animales de experimentación se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). En la Tabla 2 se resumen las características del animal para cada fase experimental. En total, se utilizaron 489 ratones C57BL/6J adolescentes (259 machos; 230 hembras) en 20 cohortes experimentales.

Tabla 2: Sujetos animales para cada fase experimental. ^†Si estos animales no están gravemente heridos, se pueden reutilizar para el cebado. ^‡Si estos animales no están gravemente heridos, pueden ser reutilizados para el cebado durante el AcSD, ^§Centro de Neurofenotipado del Instituto Universitario de Salud Mental de Douglas. ^¶Para experimentos con machos, ^#Para experimentos con hembras, si la derrota es mixta, use hembras para cebar. ^††No debe usarse para AcSD. Abreviaturas: AcSD = estrés de derrota social acelerado; PND = Día postnatal Haga clic aquí para descargar esta tabla.

1. Aclimatación

NOTA: Esta fase debe durar 1 semana como mínimo.

1. Compre ratones machos CD-1 reproductores retirados (consulte la Tabla de materiales) de más de 4 meses de edad y el doble de la cantidad de ratones C57BL/6J adolescentes (es decir, si 10 ratones estarán expuestos al estrés, compre 20 ratones CD-1).
   NOTA: Se recomienda adquirir esta cantidad de ratones CD-1 porque solo una pequeña proporción de ratones CD-1 muestran un comportamiento agresivo hacia los ratones adolescentes.
2. Deje que los ratones machos CD-1 se habitúen a la nueva instalación en su jaula doméstica con comida y agua ad libitum durante 1 semana antes de la detección y el cebado.
3. Utilice C57BL/6 en PND >65 (adultos) y PND 25 ± 3 (adolescentes) (Tabla 2) para las sesiones de cribado y preparación. Adquiera 4 ratones C57BL/6 de cada edad por día de cebado (es decir, durante 3 días de cebado, adquiera 12 PND >65 y 12 PND 25 ± 3) para disminuir el riesgo de lesiones porque estos animales se emplearán repetidamente para el proceso de selección y cebado.

2. Cribado y cebado de CD-1

NOTA: La duración de esta fase es de 3 días de cribado (1 día para ratones hembra) y 3-4 días de cebado (esto puede aumentar para ratones hembra y dependiendo del comportamiento agresivo de los ratones CD-1).

1. Utilice la definición operacional de ataque para registrar los ataques del CD-1 como se describe a continuación.
   1. Un ataque se define como cuando el ratón CD-1 muerde al ratón C57BL/6J y el ratón C57BL/6J se aleja en respuesta a la mordida. Una mordida se define como cuando el ratón CD-1 coloca sus dientes en cualquier parte del cuerpo del ratón C57BL/6J. El alejamiento se define como cuando el ratón C57BL/6J mueve ambas patas traseras de la posición en la que estaban antes de que el CD-1 lo enganchara.
   2. Asegúrese de que haya una diferencia de al menos ~2 s entre ataques separados. Si se produce más de una mordedura con <2 s de diferencia, cuente como un ataque.
   3. Si el ratón CD-1 muerde más de una vez seguidas sin descanso (<~2 s de distancia), separe suavemente a los animales con una regla de plástico. Si el ratón CD-1 muerde y no lo suelta, separe suavemente a los animales. Si el ratón C57BL/6J queda atrapado en una esquina o es inmovilizado por el ratón CD-1 y no puede alejarse en respuesta a una mordedura, separe suavemente a los animales con una regla. Cuenta todo esto como un ataque (hasta la separación).
2. Chequeo
   1. Utilice guantes de examen de nitrilo para toda manipulación de animales y evite el uso de perfumes o fragancias.
   2. Realizar el^1er día del cribado solo con ratones machos C57BL/6 adultos como intrusos (PND >65) en la jaula doméstica de los ratones CD-1. Siempre examine los ratones CD-1 antes de un nuevo experimento.
   3. Introduzca un ratón macho adulto C57BL/6 PND >65 en la jaula de un ratón macho CD-1 durante 3 min. Registre la latencia hasta la primera agresión y cuántas agresiones se realizan (consulte la Tabla complementaria 1).
   4. Desde el^{2º hasta} el último día de cribado, introducir un macho adulto C57BL/6 PND>65 durante 1 min (límite a 30 s si el CD-1 es muy agresivo) y luego cambiarlo por un C57BL/6 PND 25 adolescente ± 3 durante 5 min.
      NOTA: Es importante realizar el cribado con ratones adolescentes porque no todos los ratones que atacan al ratón macho C57BL/6 adulto atacarán al C57BL/6 adolescente. De hecho, los ratones CD-1 que atacan a ratones adolescentes no siempre atacarán a los machos C57BL/6 adultos.
   5. Si el experimento es para la agresividad hacia los ratones hembra, realice el cribado y el cebado con ratones hembra adolescentes, incluso si los ratones experimentales incluyen ambos sexos.
   6. Registre la latencia a la primera agresión, el número de ataques y las heridas recibidas por todos los ratones C57BL/6 (ver Tabla complementaria 2).
   7. Registre cualquier tipo de interacción: persecución, comportamientos de monta, olfateo, acicalamiento o mordisco. Registre si el CD-1 no se acerca a los ratones C57BL/6 adolescentes; si este comportamiento se repite durante 2 días, no incluya el CD-1 en el cebado.
   8. Para la fase de preparación, seleccione todos los ratones CD-1 que muestren comportamientos como persecución, comportamientos de montaje, olfateo, seguimiento, acicalamiento o mordida al C57BL/6 adolescente.
   9. Conserve los ratones CD-1 no seleccionados y utilícelos para la prueba de interacción social (SIT).
      NOTA: El comportamiento territorial aumenta con el tiempo; por lo tanto, los ratones CD-1 no seleccionados pueden volverse agresivos hacia los ratones adolescentes en el próximo experimento.
3. Cebado del comportamiento agresivo del CD-1
   1. Aloje a los ratones CD-1 seleccionados para el cebado en su jaula doméstica hasta el último día de cebado.
   2. Introduzca un ratón macho adulto C57BL/6J PND >65 durante 30 s en la jaula doméstica CD-1 y luego cámbielo por un ratón C57BL/6 PND 25 ± 3 adolescentes durante 5 min.
   3. Registre la latencia hasta la primera agresión, el número de ataques y cualquier interacción (consulte la Tabla complementaria 3).
   4. Realice el cebado 2 veces al día durante 3-4 días a la misma hora que se programan las derrotas (9:00 am y 2:00 pm).
      NOTA: No todos los ratones CD-1 atacarán a los ratones adolescentes durante los primeros días, especialmente si el cebado es hacia ratones hembra. El número de días para el cebado puede aumentar o disminuir dependiendo del comportamiento agresivo mostrado por los ratones CD-1.
   5. Para disminuir el número de días de cebado, reutilice ratones CD-1 que hayan pasado por un experimento previo de derrota social con ratones machos. Si los ratones CD-1 no muestran un aumento de la agresividad, extienda los días de cebado hasta alcanzar los criterios.
   6. Disminuya los días de cebado si los ratones CD-1 muestran un comportamiento agresivo extremo (los ratones C57BL/6 muestran heridas excesivas) para prevenir lesiones graves durante la derrota social.
   7. Para la siguiente fase del experimento, seleccione los ratones CD-1 que ataquen a los ratones adolescentes al menos 10 veces (machos) o 5 veces (hembras) durante 2 días consecutivos.

3. Protocolo AcSD

NOTA: Esta fase consta de 3 días de habituación y 4 días de exposición a la AcSD.

1. Habituación
   1. Preparar las jaulas de ratas para la derrota social (Figura 1A-F). Divida las jaulas para ratas en 2 compartimentos utilizando divisores de vidrio acrílico apropiados (Figura 1B, D; consulte la Tabla de materiales).
   2. Agregue ropa de cama de astillas de madera dura a ambos lados de la jaula, agregue un cuadrado de algodón por lado como material de cama (Figura 1D). Asegúrese de que la parte superior del cable esté asegurada con clips de carpeta (Figura 1E). Asegúrese de que la jaula para ratas esté cubierta con la tapa de la cubierta sin el algodón protector (Figura 1F).
   3. Coloque un ratón CD-1 por jaula en un lado de la jaula. Coloque una etiqueta en el exterior de la jaula para facilitar la identificación de cada ratón.
   4. Aloje a los ratones CD-1 seleccionados en el aparato de derrota social (Figura 1F) 2 o 3 días antes de que comience el protocolo AcSD (para mejorar el comportamiento territorial de CD-1).
   5. Realice una sesión de cebado 1 día antes del experimento; Esto es importante para mantener la agresión constante.
2. Sesiones de derrota
   1. Realizar 2 sesiones al día (primera sesión: 9 AM, segunda sesión: 2 PM) durante 4 días, 8 sesiones en total. Elabore un horario para asegurarse de que el agresor será diferente en cada sesión (véase la Tabla Complementaria 4 y la Tabla Suplementaria 5).
   2. Pese el ratón adolescente C57BL/6 antes de introducirlo en el lado CD-1 de la jaula. Introduzca un ratón macho adulto C57BL/6 >65 durante 30 s en el lado CD-1 de la jaula de derrota y luego cámbielo por un ratón C57BL/6 PND 24-28 adolescente para un episodio de derrota de 10 minutos de duración o 10 ataques como máximo por sesión.
   3. Separa a los animales después de cada ataque con una regla de plástico. Después de cada sesión de derrota, compruebe si hay lesiones y trátelas con una crema para aliviar el dolor. Registre el número de lesiones.
   4. Coloque el ratón C57BL/6J adolescente en el compartimento libre junto a un agresor desconocido hasta la próxima sesión. Repita el procedimiento con un agresor diferente en cada sesión.
   5. Inicie la sesión con los ratones experimentales y agresores que no se emparejaron en la sesión anterior. Monitorizar las lesiones de los ratones machos C57BL/6J adultos utilizados para el cebado (véase la Tabla complementaria 6).
3. Siga las recomendaciones que se indican a continuación para el bienestar animal y los criterios de valoración humanitarios.
   1. Seguir el procedimiento operativo estándar de la junta de revisión institucional correspondiente para las derrotas sociales y asegurar una evaluación veterinaria constante.
   2. Monitoree la salud de los ratones durante todo el estudio para evitar el sufrimiento y la muerte de los animales.
   3. Verifique que el divisor perforado esté configurado correctamente para evitar que los ratones crucen al otro compartimento.
   4. Notifique al personal de atención veterinaria cuando un animal tenga una herida para un control adecuado y aplique crema para aliviar el dolor diariamente hasta que la herida esté completamente curada.
   5. Si una lesión empeora (las heridas aumentan de tamaño), limite los ataques a 5 en la siguiente sesión permitiendo la recuperación. Verifique si hay lesiones graves. Las lesiones graves se definen como heridas de un total de > 1 cm.
   6. Retirar y sacrificar inmediatamente a los animales que presenten una reducción del 15%-20% de su peso con respecto al peso corporal inicial; reducción o disminución de la actividad locomotora y deterioro del aseo personal; ratones con heridas > 1 cm; pene cortado o marcas de mordeduras con hinchazón de las extremidades delanteras.
      NOTA: La eutanasia primaria se lleva a cabo a través de cámaras de gas de isoflurano/CO2, seguida de una eutanasia secundaria mediante luxación cervical.
4. Ratones de control
   1. Realizar 2 sesiones al día (primera sesión: 9 AM, segunda sesión: 2 PM) durante 4 días, 8 sesiones en total. Elabore un horario para asegurarse de que los ratones de control compartan la jaula con un congénere C57BL/6J diferente en cada sesión (consulte la Tabla complementaria 7 y la Tabla complementaria 8).
      NOTA: Los ratones de control no están expuestos a un agresor. Para imitar la introducción de un nuevo ratón CD-1 en cada sesión de derrota, los ratones de control se emparejan con un nuevo conespecífico del mismo sexo y de la misma edad (no compañero de camada) en cada sesión.
   2. Aloje a los ratones de control en el aparato de derrota social (Figura 1) en una habitación separada de la de los ratones AcSD.
   3. Coloque dos ratones de control por jaula, uno a cada lado de la jaula. Aloja a los ratones en un lado diferente de la jaula o en una jaula completamente diferente, para que no reconozcan el olor. Gire los ratones de control en cada sesión.

Figura 1: Aparato para el estrés de derrota social acelerado (AcSD) para ratones adolescentes. (A) De izquierda a derecha, tapas de alambre de acero emparejadas con 0,6 cm de separación entre barras, divisor de policarbonato perforado transparente con diámetro de perforación de 0,6 cm, clips de encuadernación para asegurar las tapas de alambre, jaula de ratas transparente con tapa de cubierta (sin capa protectora de algodón). (B) Arriba: comparación entre los divisores de policarbonato para la derrota social crónica en adultos (izquierda) y la AcSD en adolescentes (derecha); Abajo: Acércate al divisor de policarbonato para ratones adolescentes. (C) Arriba: comparación entre las tapas de alambre de acero para la derrota social crónica en adultos (izquierda) y la AcSD en adolescentes (derecha); Abajo: Primer plano de las tapas de alambre de acero. (D-F) Montaje del aparato de derrota social. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Test de interacción social

1. Realice el SIT siguiendo el AcSD como se describió anteriormente 57,58,59.
   1. Realizar el SIT 24 h después de la última sesión de AcSD. Realice el SIT en condiciones de luz roja (no en condiciones de luz amarilla) entre las 9 a.m. y las 4 p.m.
   2. Instale la arena cuadrada principal y la cámara de video superior (ver Tabla de Materiales). La arena principal se divide en 3 áreas: la zona de interacción social (SIZ), las esquinas y el centro; Estas áreas deben estar marcadas en la arena con una línea negra (use un marcador permanente negro). Utilice las siguientes dimensiones y criterios para cada área.
      1. Asegúrese de que la SIZ sea el área cuadrada de 14 cm x 9 cm, que rodea el recinto. Las esquinas son pequeñas áreas cuadradas (9 cm x 9 cm) en las esquinas de la pared opuestas al cerramiento y representan el punto más alejado de la ZIC. El centro es el área entre la SIZ y las esquinas.
   3. Limpie la arena y los recintos con una solución limpiadora de peroxidasa de hidrógeno.
   4. Coloque etiquetas de identificación para cada animal en el piso para su análisis. Registre todo el comportamiento de los animales para su análisis fuera de línea.
2. Primera sesión para determinar la exploración de línea base
   1. Coloque un recinto de malla de alambre vacío contra una de las paredes de la arena. Coloque el ratón C57BL/6 adolescente experimental (derrotado o de control) en el centro de la arena. Deja que explore la arena libremente durante 2,5 minutos. Recupere el ratón.
   2. Limpie la arena y los recintos con una solución limpiadora de peroxidasa de hidrógeno.
3. Segunda sesión de interacción social
   1. Coloque un mouse CD-1 desconocido dentro de la carcasa de malla de alambre. Coloque el recinto en el mismo lugar que en la sesión anterior.
   2. Vuelve a introducir el mismo ratón C57BL/6 adolescente en la arena. Deja que explore la arena libremente durante 2,5 minutos. Recupera los ratones.
   3. Limpie la arena y los recintos con una solución limpiadora de peroxidasa de hidrógeno.
   4. Repita el proceso para todos los ratones C57BL/6 adolescentes (ratones estresados y de control) en un orden contrabalanceado.
   5. Utilice más de un ratón CD-1 para el SIT a fin de disminuir el estrés de manipulación y el sesgo (por ejemplo, para una cohorte de 30 ratones C57BL/6, utilice 4 ratones CD-1). Contrarrestarlos entre los ratones adolescentes.
      NOTA: Esta prueba mide el acercamiento y/o comportamiento de evitación de los ratones experimentales hacia un objetivo social, como lo describieron por primera vez Krishnan⁵ y Golden⁷.
4. Análisis
   1. Registre el tiempo (s) pasado (s) en la zona de interacción y las esquinas durante ambas sesiones de la prueba.
   2. Calcule la relación de interacción social como el tiempo pasado en la zona de interacción con el agresor CD-1 presente dividido por el tiempo pasado en la zona de interacción con el agresor CD-1 ausente.
   3. Clasificar a los ratones estresados con una proporción < 1,00 como susceptibles y una proporción ≥ 1,00 como resistentes.
   4. Excluir de todos los análisis para controlar las diferencias en la actividad locomotora a los animales que no exploraron el campo durante la primera sesión (es decir, que pasaron 0 s en cualquiera de las áreas designadas).
   5. Excluir de todos los análisis a todos los animales que reciben 0 ataques en ≥4 sesiones de derrota social para evitar animales resilientes no representativos.
   6. Excluya a los ratones (no susceptibles) que no pasan al menos 61 s dentro de la zona de interacción para garantizar que las altas proporciones de interacción social reflejen el interés real en el objetivo social.
   7. Excluya los ratones con puntuaciones de proporción de interacción atípica.

Resultados

Se realizaron un total de cuatro experimentos diferentes utilizando el modelo de estrés de derrota social crónica en ratones machos adolescentes C57BL/6 (PND 21). Sin embargo, este modelo presentó limitaciones importantes para su uso en ratones C57BL/6 adolescentes tempranos.

Modificaciones necesarias para el equipo de los ratones C57BL/6 adolescentes
La primera limitación fue que el equipo utilizado para el aparato de derrota social estaba diseñado para ratones adulto...

Discusión

Comportamiento consistente y agresivo en ratones CD-1
Durante la fase de cribado, es muy importante tomar nota de todos los comportamientos mostrados por el CD-1 (persecución, comportamientos de montaje, olfateo, acicalamiento o mordedura) y seguir de cerca estos registros al seleccionar los ratones CD-1 para el AcSD. Es probable que un ratón CD-1 que interactúa con el ratón adolescente sin atacarlo desarrolle agresividad hacia los ratones adolescentes durante el cebado. Por el contrario, un rató...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.