Modelo de estresse de derrota social para camundongos adolescentes C57BL / 6 machos e fêmeas

Resumo

Desenvolvemos um modelo de estresse de derrota social acelerada para camundongos adolescentes C57BL/6, que funciona em machos e fêmeas e permite a exposição durante períodos discretos da adolescência. A exposição a esse modelo induz evitação social, mas apenas em um subconjunto de camundongos machos e fêmeas derrotados.

Resumo

A adversidade social na adolescência é prevalente e pode impactar negativamente as trajetórias de saúde mental. A modelagem do estresse social em roedores adolescentes machos e fêmeas é necessária para entender seus efeitos no desenvolvimento contínuo do cérebro e nos resultados comportamentais. O paradigma de estresse de derrota social crônica (CSDS) tem sido amplamente utilizado para modelar o estresse social em camundongos machos C57BL/6 adultos, aproveitando o comportamento agressivo exibido por um roedor macho adulto a um intruso que invade seu território. Uma vantagem desse paradigma é que ele permite categorizar camundongos derrotados em grupos resilientes e suscetíveis com base em suas diferenças individuais de comportamento social 24 horas após a última sessão de derrota. A implementação deste modelo em camundongos C57BL/6 adolescentes tem sido um desafio porque camundongos adultos ou adolescentes normalmente não atacam camundongos machos ou fêmeas adolescentes precoces e porque a adolescência é um curto período de vida, abrangendo discretas janelas temporais de vulnerabilidade. Essa limitação foi superada com a adaptação de uma versão acelerada do CSDS para ser usada em camundongos adolescentes machos e fêmeas. Este paradigma de estresse de 4 dias com 2 sessões de ataque físico por dia usa um adulto masculino C57BL/6 para preparar o camundongo CD-1 para agressividade de tal forma que ele ataque prontamente o camundongo adolescente macho ou fêmea. Este modelo foi denominado estresse de derrota social acelerada (AcSD) para camundongos adolescentes. A exposição de adolescentes à AcSD induz evitação social 24 horas depois em machos e fêmeas, mas apenas em um subconjunto de camundongos derrotados. Essa vulnerabilidade ocorre apesar do número de ataques ser consistente entre sessões entre grupos resilientes e suscetíveis. O modelo AcSD é curto o suficiente para permitir a exposição durante períodos discretos na adolescência, permite a segregação de camundongos de acordo com a presença ou ausência de comportamento de evitação social e é o primeiro modelo disponível para estudar o estresse de derrota social em camundongos fêmeas C57BL / 6 adolescentes.

Introdução

O paradigma do estresse de derrota social crônica é amplamente utilizado para modelar o estresse social em roedores machos adultos pós-natal (PND) >65. Este paradigma é baseado no comportamento agressivo natural de um roedor macho adulto quando um intruso invade seu território. Este modelo é usado em uma variedade de espécies de roedores, incluindo ratos, hamsters e camundongos 1,2,3,4,5,6,7,8,9, e consiste em uma combinação de agressão física e estresse psicológico com duração de cerca de 10 dias, durante os quais um roedor intruso experimenta alguns minutos de agressão física do roedor residente. Os dois roedores permanecem na gaiola da casa do residente, separados por uma divisória que permite o contato sensorial, mas não físico⁷. Em experimentos com camundongos, os camundongos residentes/agressores mais comumente usados são camundongos Swiss CD-1 reprodutores aposentados, que apresentam comportamento territorial robusto contra camundongos intrusos ^6,7. Para os camundongos intrusos, a cepa mais bem caracterizada é a linhagem endogâmica C57BL/6 ^2,4,5. O camundongo derrotado é exposto a um novo agressor todos os dias para evitar a habituação ao agressor. Os camundongos de controle são alojados com um coespecífico diferente a cada dia. Às 24 h após a última sessão de derrota, os camundongos experimentais são testados em um teste de interação social (SIT) no qual podem explorar um campo aberto na ausência (sem alvo) ou na presença de um novo camundongo CD-1 (alvo). Os ratos de controle passam mais tempo na zona de interação com o alvo do que com a parte não alvo da tarefa. Os camundongos derrotados são classificados como suscetíveis (razão<1) ou resilientes (razão>1) de acordo com uma razão de interação social (tempo gasto na zona de interação com o agressor presente/tempo gasto na zona de interação com o agressor ausente). Este procedimento fornece uma ferramenta útil para estudar as diferenças individuais em resposta ao estresse.

Até recentemente, o modelo de estresse de derrota social crônica tem sido usado principalmente em camundongos machos adultos, porque as hierarquias acentuadas de dominância masculina envolvem a luta contra os machos, mas não contra as fêmeas ^6,7. Além disso, os roedores machos normalmente não atacam as fêmeas; em vez disso, eles se envolvem em comportamentos de acasalamento¹⁰. Apesar desses obstáculos, diferentes estratégias foram desenvolvidas para adaptar o paradigma de estresse de derrota social crônica para camundongos fêmeas adultas. Por exemplo, o modelo de derrota social do camundongo da Califórnia baseia-se na agressão natural dessa espécie monogâmica de ambos os sexos ao defender seu território ^9,11. Outras abordagens se concentram em induzir o comportamento agressivo dos camundongos CD-1, estimulando seu hipotálamo ventromedial a ter um comportamento agressivo consistente^10,12, ou aplicando urina masculina nos camundongos fêmeas adultas experimentais para receber ataques de agressores de CD-1¹³. Essa agressão intensificada e consistente dos camundongos CD-1 é fundamental para que o camundongo intruso experimental mostre sinais comportamentais claros de subordinação aos ataques repetidos do agressor durante a duração da interação⁶.

Adaptando o modelo de derrota social crônica para uso em camundongos C57BL/6 adolescentes
A adolescência é um período marcado por um amadurecimento psicossocial substancial, que se desdobra em paralelo com mudanças na micro e macro arquitetura do cérebro, particularmente no córtex pré-frontal. Tanto em humanos quanto em roedores, há pouco consenso sobre o início e o fim específicos do período da adolescência^14,15. Além disso, existem janelas críticas de vulnerabilidade na adolescência para a interrupção induzida pela experiência do desenvolvimento cerebral e cognitivo contínuo 16,17,18,19. A puberdade e a adolescência ocorrem ao mesmo tempo, mas esses termos não são sinônimos. A puberdade significa o início da maturação sexual, enquanto a adolescência representa uma fase mais ampla caracterizada pela mudança gradual de um estado juvenil para a conquista da independência²⁰. Diferentes grupos sugeriram que a adolescência em camundongos se estende desde o desmame (PND 21) até a idade adulta (PND 60)²¹. Particularmente, o início da adolescência pode ser referido como a primeira e a segunda semanas pós-desmame (PND 21-34) e o meio da adolescência como o período do PND 35-48. Essas faixas abrangem períodos discretos de desenvolvimento em relação, por exemplo, ao desenvolvimento do sistema dopaminérgico 22,23,24, vulnerabilidade aos efeitos das drogas no desenvolvimento de redes neuronais 17,25,26,27 e características comportamentais distintas 16,20,28,29,30.

O comportamento de luta do rato residente é necessário para o protocolo de derrota social. No entanto, como acontece com os camundongos fêmeas, os machos normalmente não se envolvem em interações agressivas com camundongos adolescentes, possivelmente porque não os percebem como uma ameaça. A maioria dos estudos que exploram os efeitos da derrota social crônica em camundongos adolescentes C57BL / 6 foi realizada durante o período da adolescência 31,32,33,34,35; outros não especificam o dia pós-natal da exposição na adolescência^36,37, nem estendem os dias para a derrota até o início da idade adulta³⁸ ou não permitem o contato sensorial³⁹; Outros estudos em camundongos adolescentes usam diferentes cepas^40,41. As características desses estudos usando estresse crônico de derrota social em camundongos machos adolescentes estão resumidas na Tabela 1.

Nosso grupo de pesquisa está interessado em direcionar janelas específicas de exposição a adolescentes, incluindo o início da adolescência, em camundongos C57BL / 6. Devido à curta duração dos diferentes períodos da adolescência, foi elaborada uma versão modificada da versão acelerada do paradigma do estresse crônico de derrota social⁴². Este modelo foi denominado estresse de derrota social acelerada (AcSD) para camundongos adolescentes. Trabalhos anteriores mostram que existem diferenças significativas entre os sexos na sensibilidade ao estresse social na adolescência em ratos 8,26,43,44,45, bem como nos efeitos nocivos do estresse social nas trajetórias de saúde mental em humanos 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56. O modelo AcSD também funciona efetivamente para camundongos fêmeas adolescentes, permitindo que eles investiguem possíveis consequências específicas do sexo, bem como explorem a base neurobiológica.

Tabela 1: Estudos usando paradigmas de estresse de derrota social em camundongos machos adolescentes. Linhagem e espécie: Rato da Califórnia: Peromyscus californicus. C57BL / 6: Mus musculus black 6 linhagem de camundongos endogâmicos. C57BL / 6J: Modelo de camundongo endogâmico M . musculus black 6 fornecido pelos laboratórios de Jackson. CD-1: M. musculus de linhagem de camundongo albino suíço. ICR: Linhagem de camundongos albinos consanguíneos do Instituto de Pesquisa do Câncer M. musculus . OF1: M. musculus Oncins France 1 linhagem de camundongo albino consanguíneo.
Abreviaturas: wk = semana; DPP = dia pós-natal; res = resiliente; sus = suscetível; unsus = insuscetível. Clique aqui para baixar esta tabela.

Protocolo

Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e aprovados pela Universidade McGill e pelo Comitê de Cuidados com Animais do Hospital Douglas (número de aprovação do experimento com animais: 2005-5084). Todos os camundongos foram alojados em uma sala de colônias com temperatura e umidade controladas (21-22 ° C; 60%) e em um ciclo claro-escuro de 12 h (luz acesa às 8:00 h) no Centro de Neurofenotipagem do Douglas Mental Health University Institute. Os camundongos tiveram acesso ad libitum a comida e água durante os experimentos. Os camundongos foram designados aleatoriamente para cada condição experimental. Os animais experimentais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). A Tabela 2 resume as características do animal para cada fase experimental. No total, 489 camundongos C57BL / 6J adolescentes (259 machos; 230 fêmeas) foram usados em 20 coortes experimentais.

Tabela 2: Sujeitos animais para cada fase experimental. ^†Se esses animais não estiverem gravemente feridos, eles podem ser reutilizados para preparação. ^‡Se esses animais não estiverem gravemente feridos, eles podem ser reutilizados para escorva durante o AcSD, ^§Centro de Neurofenotipagem do Douglas Mental Health University Institute. ^¶Para experimentos com machos, ^#Para experimentos com fêmeas, se a derrota for mista, use fêmeas para preparação. ^††Não deve ser usado para AcSD. Abreviaturas: AcSD = estresse de derrota social acelerado; PND = Dia pós-natal Clique aqui para baixar esta tabela.

1. Aclimatação

NOTA: Esta fase deve durar no mínimo 1 semana.

1. Compre camundongos reprodutores aposentados CD-1 machos (consulte a Tabela de Materiais) com mais de 4 meses de idade e o dobro da quantidade de camundongos C57BL / 6J adolescentes (ou seja, se 10 camundongos forem expostos ao estresse, compre 20 camundongos CD-1).
   NOTA: Recomenda-se adquirir essa quantidade de camundongos CD-1 porque apenas uma pequena proporção de camundongos CD-1 mostra comportamento agressivo em relação a camundongos adolescentes.
2. Deixe os camundongos machos CD-1 se habituarem à nova instalação em sua gaiola doméstica com comida e água ad libitum por 1 semana antes da triagem e preparação.
3. Utilizar C57BL/6 no PND >65 (adultos) e PND 25 ± 3 (adolescentes) (Tabela 2) para as sessões de triagem e priming. Adquira 4 camundongos C57BL/6 de cada idade por dia de priming (ou seja, por 3 dias de priming, adquira 12 PND >65 e 12 PND 25 ± 3) para diminuir o risco de ferimentos porque esses animais serão empregados repetidamente para o processo de triagem e priming.

2. Triagem e preparação de CD-1

NOTA: A duração desta fase é de 3 dias de triagem (1 dia para camundongos fêmeas) e 3-4 dias de priming (isso pode aumentar para camundongos fêmeas e, dependendo do comportamento agressivo dos camundongos CD-1).

1. Use a definição operacional de ataque para registrar os ataques do CD-1 conforme descrito abaixo.
   1. Um ataque é definido como quando o camundongo CD-1 morde o camundongo C57BL/6J e o camundongo C57BL/6J se afasta em resposta à mordida. Uma mordida é definida como quando o camundongo CD-1 coloca seus dentes em qualquer parte do corpo do camundongo C57BL/6J. Afastar-se é definido como quando o camundongo C57BL / 6J move ambas as patas traseiras da posição em que estavam antes de o CD-1 atacá-lo.
   2. Certifique-se de que haja uma diferença de pelo menos ~ 2 s entre ataques separados. Se ocorrer mais de uma mordida com <2 s de intervalo, conte como um ataque.
   3. Se o camundongo CD-1 morder mais de uma vez sucessivamente sem interrupção (< ~ 2 s de distância), separe suavemente os animais com uma régua de plástico. Se o camundongo CD-1 morder e não soltar, separe os animais com cuidado. Se o camundongo C57BL/6J ficar preso em um canto ou for preso pelo camundongo CD-1 e não puder se afastar em resposta a uma mordida, separe suavemente os animais com uma régua. Conte tudo isso como um ataque (até a separação).
2. Peneiramento
   1. Use luvas de exame de nitrilo para todo o manuseio de animais e evite o uso de perfumes ou fragrâncias.
   2. Realize o^1º dia da triagem apenas com camundongos machos C57BL/6 adultos como intrusos (PND >65) na gaiola doméstica de camundongos CD-1. Sempre rastreie os mouses CD-1 antes de um novo experimento.
   3. Introduza um camundongo macho adulto C57BL / 6 PND >65 na gaiola doméstica de um camundongo macho CD-1 por 3 min. Registre a latência para a primeira agressão e quantas agressões são realizadas (consulte a Tabela Suplementar 1).
   4. Do^2º ao último dia de triagem, introduza um C57BL/6 PND>65 macho adulto por 1 min (limite de 30 s se o CD-1 for muito agressivo) e depois troque-o por um C57BL/6 PND 25 ± 3 adolescente por 5 min.
      NOTA: É importante realizar a triagem com camundongos adolescentes porque nem todos os camundongos que atacam o camundongo macho C57BL/6 adulto atacarão o C57BL/6 adolescente. Na verdade, os camundongos CD-1 que atacam camundongos adolescentes nem sempre atacam machos C57BL / 6 adultos.
   5. Se o experimento for para agressividade em relação a camundongos fêmeas, faça a triagem e o condicionamento com camundongos fêmeas adolescentes, mesmo que os camundongos experimentais incluam ambos os sexos.
   6. Registre a latência da primeira agressão, o número de ataques e os ferimentos recebidos por todos os camundongos C57BL / 6 (consulte a Tabela Suplementar 2).
   7. Registre qualquer tipo de interação: perseguir, montar comportamentos, cheirar, escovar ou morder. Registre-se se o CD-1 não se aproximar dos camundongos C57BL/6 adolescentes; se esse comportamento for repetido por 2 dias, não inclua o CD-1 na preparação.
   8. Para a fase de preparação, selecione todos os mouses CD-1 que exibem comportamentos como perseguir, montar comportamentos, cheirar, seguir, escovar ou morder o adolescente C57BL/6.
   9. Mantenha os mouses CD-1 não selecionados e use-os para o teste de interação social (SIT).
      NOTA: O comportamento territorial aumenta com o tempo; portanto, os camundongos CD-1 não selecionados podem se tornar agressivos com camundongos adolescentes no próximo experimento.
3. Comportamento agressivo do CD-1 de preparação
   1. Alojar os camundongos CD-1 selecionados para escorva em sua gaiola doméstica até o último dia de escorva.
   2. Introduza um camundongo C57BL / 6J macho adulto PND >65 por 30 s na gaiola doméstica CD-1 e, em seguida, troque-o por um camundongo adolescente C57BL / 6 PND 25 ± 3 por 5 min.
   3. Registre a latência para a primeira agressão, o número de ataques e qualquer interação (consulte a Tabela Suplementar 3).
   4. Realize o priming 2x ao dia durante 3-4 dias ao mesmo tempo em que as derrotas estão programadas (9h00 e 2h00).
      NOTA: Nem todos os camundongos CD-1 atacarão os camundongos adolescentes durante os primeiros dias, especialmente se o priming for em camundongos fêmeas. O número de dias para o priming pode aumentar ou diminuir dependendo do comportamento agressivo mostrado pelos camundongos CD-1.
   5. Para diminuir o número de dias de preparação, reutilize camundongos CD-1 que passaram por um experimento anterior de derrota social com camundongos machos. Se os camundongos CD-1 não apresentarem agressividade aumentada, estenda os dias para o priming até atingir os critérios.
   6. Diminua os dias de preparação se os camundongos CD-1 apresentarem comportamento agressivo extremo (camundongos C57BL / 6 apresentarem ferimentos excessivos) para evitar ferimentos graves durante a derrota social.
   7. Para a próxima fase do experimento, selecione os camundongos CD-1 que atacam os camundongos adolescentes pelo menos 10x (machos) ou 5x (fêmeas) por 2 dias consecutivos.

3. Protocolo AcSD

NOTA: Esta fase consiste em 3 dias de habituação e 4 dias de exposição ao AcSD.

1. Habituation
   1. Configure as gaiolas de rato para derrota social (Figura 1A-F). Divida as gaiolas de rato em 2 compartimentos usando divisórias de vidro acrílico apropriadas (Figura 1B, D; consulte a Tabela de Materiais).
   2. Adicione cama de lascas de madeira dura em ambos os lados da gaiola, adicione um quadrado de algodão de cada lado como material de cama (Figura 1D). Certifique-se de que a parte superior do fio esteja presa com clipes de fichário (Figura 1E). Certifique-se de que a gaiola de rato esteja coberta com a tampa da tampa sem o algodão protetor (Figura 1F).
   3. Coloque um mouse CD-1 por gaiola em um lado da gaiola. Coloque uma etiqueta do lado de fora da gaiola para facilitar a identificação de cada mouse.
   4. Alojar os camundongos CD-1 selecionados no aparelho de derrota social (Figura 1F) 2 ou 3 dias antes do início do protocolo AcSD (para melhorar o comportamento territorial do CD-1).
   5. Realizar uma sessão de priming 1 dia antes do experimento; Isso é importante para manter a agressão consistente.
2. Sessões de derrota
   1. Realize 2 sessões por dia (primeira sessão: 9h, segunda sessão: 14h) durante 4 dias, 8 sessões no total. Faça um cronograma para garantir que o agressor seja diferente para cada sessão (consulte a Tabela Suplementar 4 e a Tabela Suplementar 5).
   2. Pese o camundongo adolescente C57BL/6 antes de introduzi-lo no lado CD-1 da gaiola. Introduza um camundongo C57BL/6 macho adulto >65 por 30 s no lado CD-1 da gaiola de derrota e, em seguida, troque-o por um camundongo adolescente C57BL/6 PND 24-28 para um episódio de derrota de 10 minutos ou 10 ataques no máximo por sessão.
   3. Separe os animais após cada ataque com uma régua de plástico. Após cada sessão de derrota, verifique se há lesões e trate-as com creme para alívio da dor. Registre o número de lesões.
   4. Coloque o mouse adolescente C57BL/6J no compartimento livre ao lado de um agressor desconhecido até a próxima sessão. Repita o procedimento com um agressor diferente a cada sessão.
   5. Inicie a sessão com os camundongos experimentais e agressores que não foram pareados na sessão anterior. Monitore as lesões dos camundongos machos C57BL / 6J adultos usados para escorva (consulte a Tabela Suplementar 6).
3. Siga as recomendações abaixo para o bem-estar animal e parâmetros humanitários.
   1. Siga o procedimento operacional padrão do conselho de revisão institucional correspondente para derrotas sociais e garanta uma avaliação veterinária constante.
   2. Monitore a saúde dos camundongos durante todo o estudo para evitar sofrimento e morte de animais.
   3. Verifique se o divisor perfurado está ajustado corretamente para evitar que os ratos cruzem para o outro compartimento.
   4. Notifique a equipe de atendimento veterinário quando um animal tiver uma ferida para monitoramento adequado e aplique creme para alívio da dor diariamente até que a ferida esteja completamente curada.
   5. Se uma lesão piorar (as feridas aumentam de tamanho), limite os ataques a 5 na próxima sessão, permitindo a recuperação. Verifique se há ferimentos graves. Lesões graves são definidas como feridas totalizando > 1 cm.
   6. Remover e sacrificar imediatamente os animais que apresentem uma redução de 15% a 20% do seu peso em relação ao peso corporal inicial; atividade locomotora reduzida/diminuída e higiene prejudicada; camundongos com feridas > 1 cm; pênis decepado ou marcas de mordida com inchaço dos membros anteriores.
      NOTA: A eutanásia primária é conduzida por meio de câmaras de gás isoflurano / CO2, seguida de eutanásia secundária feita por luxação cervical.
4. Ratos de controle
   1. Realize 2 sessões por dia (primeira sessão: 9h, segunda sessão: 14h) durante 4 dias, 8 sessões no total. Faça um cronograma para garantir que os camundongos de controle compartilhem a gaiola com um C57BL / 6J coespecífico diferente a cada sessão (consulte a Tabela Suplementar 7 e a Tabela Suplementar 8).
      NOTA: Os ratos de controle não são expostos a um agressor. Para imitar a introdução de um novo camundongo CD-1 a cada sessão de derrota, os camundongos de controle são emparelhados com um novo coespecífico do mesmo sexo e da mesma idade (não irmão de ninhada) a cada sessão.
   2. Alojar os camundongos de controle no aparelho de derrota social (Figura 1) em uma sala separada daquela dos camundongos AcSD.
   3. Coloque dois ratos de controle por gaiola, um de cada lado da gaiola. Aloje os ratos em um lado diferente da gaiola ou em uma gaiola completamente diferente, para que eles não reconheçam o odor. Gire os mouses de controle a cada sessão.

Figura 1: Aparelho para o estresse de derrota social acelerada (AcSD) para camundongos adolescentes. (A) Da esquerda para a direita, topos de arame de aço pareados com 0,6 cm de separação entre barras, divisor de policarbonato perfurado transparente com diâmetro de perfuração de 0,6 cm, clipes de aglutinante para fixação dos topos de arame, gaiola de rato transparente com tampa de cobertura (sem camada protetora de algodão). (B) Para cima: comparação entre os divisores de policarbonato para derrota social crônica em adultos (esquerda) e ACD em adolescentes (direita); Para baixo: Feche o divisor de policarbonato para camundongos adolescentes. (C) Para cima: comparação entre os topos de arame de aço para derrota social crônica em adultos (esquerda) e AcSD em adolescentes (direita); para baixo: close-up dos topos de arame de aço. (D-F) Montagem do aparato de derrota social. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Teste de interação social

1. Realize o SIT seguindo o AcSD conforme descrito anteriormente 57,58,59.
   1. Realize o SIT 24 h após a última sessão do AcSD. Realize o SIT em condições de luz vermelha (não em condições de luz amarela) entre 9h e 4h.
   2. Configure a arena quadrada principal e a câmera de vídeo suspensa (consulte a Tabela de Materiais). A arena principal é dividida em 3 áreas: a zona de interação social (SIZ), os cantos e o centro; Essas áreas devem ser marcadas na arena com uma linha preta (use um marcador permanente preto). Use as seguintes dimensões e critérios para cada área.
      1. Certifique-se de que o SIZ seja a área quadrada de 14 cm x 9 cm, que circunda o gabinete. Os cantos são pequenas áreas quadradas (9 cm x 9 cm) nos cantos da parede oposta ao recinto e representam o ponto mais distante do SIZ. O centro é a área entre o SIZ e os cantos.
   3. Limpe a arena e os gabinetes com uma solução de hidrogênio peroxidase de limpeza.
   4. Coloque etiquetas de identificação para cada animal no chão para análise. Registre todo o comportamento animal para análise offline.
2. Primeira sessão para determinar a exploração da linha de base
   1. Coloque um invólucro de malha de arame vazio contra uma das paredes da arena. Coloque o camundongo adolescente experimental (derrotado ou controle) C57BL/6 no meio da arena. Deixe-o explorar a arena livremente por 2,5 min. Recupere o mouse.
   2. Limpe a arena e os gabinetes com uma solução de hidrogênio peroxidase de limpeza.
3. Segunda sessão para interação social
   1. Coloque um mouse CD-1 desconhecido dentro do gabinete de malha de arame. Coloque o gabinete no mesmo local da sessão anterior.
   2. Reintroduza o mesmo mouse adolescente C57BL/6 na arena. Deixe-o explorar a arena livremente por 2,5 min. Recupere os ratos.
   3. Limpe a arena e os gabinetes com uma solução de hidrogênio peroxidase de limpeza.
   4. Repita o processo para todos os camundongos C57BL/6 adolescentes (camundongos estressados e controle) em uma ordem contrabalançada.
   5. Use mais de um mouse CD-1 para o SIT para diminuir o estresse e o viés de manuseio (por exemplo, para uma coorte de 30 camundongos C57BL/6, use 4 camundongos CD-1). Contrabalance-os entre os camundongos adolescentes.
      NOTA: Este teste mede o comportamento de aproximação e / ou evitação dos camundongos experimentais em relação a um alvo social, conforme descrito pela primeira vez por Krishnan⁵ e Golden⁷.
4. Análise
   1. Registre o(s) tempo(s) gasto(s) na zona de interação e nos cantos durante as duas sessões do teste.
   2. Calcule a taxa de interação social como o tempo gasto na zona de interação com o agressor CD-1 presente dividido pelo tempo gasto na zona de interação com o agressor CD-1 ausente.
   3. Classifique os camundongos estressados com uma proporção < 1,00 como suscetíveis e uma proporção ≥ 1,00 como resilientes.
   4. Exclua animais que não exploram a arena durante a primeira sessão (ou seja, passaram 0 s em qualquer uma das áreas designadas) de todas as análises para controlar as diferenças na atividade locomotora.
   5. Exclua todos os animais que recebem 0 ataques em ≥4 sessões de derrota social de todas as análises para evitar animais resilientes não representativos.
   6. Exclua camundongos (não suscetíveis) que não passam pelo menos 61 s dentro da zona de interação para garantir que as altas taxas de interação social reflitam o interesse real no alvo social.
   7. Exclua camundongos com pontuações de taxa de interação discrepantes.

Resultados

Um total de quatro experimentos diferentes foram realizados usando o modelo de estresse de derrota social crônica em camundongos adolescentes C57BL/6 machos (PND 21). No entanto, este modelo apresentou limitações importantes para seu uso em camundongos C57BL/6 adolescentes precoces.

Modificações necessárias no equipamento para camundongos C57BL/6 adolescentes
A primeira limitação foi que o equipamento usado para o aparelho de derrota social foi projetado para camund...

Discussão

Comportamento consistente e agressivo em camundongos CD-1
Durante a fase de triagem, é muito importante observar todos os comportamentos exibidos pelo CD-1 (perseguir, montar comportamentos, cheirar, escovar ou morder) e seguir de perto esses registros ao selecionar os camundongos CD-1 para o AcSD. É provável que um camundongo CD-1 que interaja com o camundongo adolescente sem atacá-lo desenvolva agressividade em relação a camundongos adolescentes durante o priming. Em contraste, um camundongo C...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.