Modello di stress di sconfitta sociale per topi maschi e femmine adolescenti C57BL / 6

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un modello di stress da sconfitta sociale accelerata per topi adolescenti C57BL/6, che funziona sia nei maschi che nelle femmine e consente l'esposizione durante periodi discreti dell'adolescenza. L'esposizione a questo modello induce l'evitamento sociale, ma solo in un sottogruppo di topi maschi e femmine sconfitti.

Abstract

Le avversità sociali nell'adolescenza sono prevalenti e possono avere un impatto negativo sulle traiettorie della salute mentale. La modellazione dello stress sociale nei roditori adolescenti maschi e femmine è necessaria per comprenderne gli effetti sullo sviluppo cerebrale in corso e sui risultati comportamentali. Il paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica (CSDS) è stato ampiamente utilizzato per modellare lo stress sociale in topi maschi adulti C57BL/6 facendo leva sul comportamento aggressivo mostrato da un roditore maschio adulto nei confronti di un intruso che invade il suo territorio. Un vantaggio di questo paradigma è che permette di classificare i topi sconfitti in gruppi resilienti e suscettibili in base alle loro differenze individuali nel comportamento sociale 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta. L'implementazione di questo modello nei topi C57BL/6 adolescenti è stata impegnativa perché i topi adulti o adolescenti non attaccano tipicamente i topi maschi o femmine adolescenti e perché l'adolescenza è un breve periodo di vita, che comprende discrete finestre temporali di vulnerabilità. Questa limitazione è stata superata adattando una versione accelerata del CSDS da utilizzare per topi maschi e femmine adolescenti. Questo paradigma di stress di 4 giorni con 2 sessioni di attacco fisico al giorno utilizza un maschio adulto C57BL/6 per innescare l'aggressività del topo CD-1 in modo tale da attaccare prontamente il topo adolescente maschio o femmina. Questo modello è stato definito stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per i topi adolescenti. L'esposizione adolescenziale all'AcSD induce l'evitamento sociale 24 ore dopo sia nei maschi che nelle femmine, ma solo in un sottogruppo di topi sconfitti. Questa vulnerabilità si verifica nonostante il numero di attacchi sia coerente tra le sessioni tra gruppi resilienti e suscettibili. Il modello AcSD è abbastanza breve da consentire l'esposizione durante periodi discreti all'interno dell'adolescenza, consente la segregazione dei topi in base alla presenza o all'assenza di comportamenti di evitamento sociale ed è il primo modello disponibile per studiare lo stress da sconfitta sociale in topi femmine adolescenti C57BL/6.

Introduzione

Il paradigma dello stress cronico da sconfitta sociale è ampiamente utilizzato per modellare lo stress sociale nei roditori maschi adulti del giorno postnatale (PND) >65. Questo paradigma si basa sul comportamento aggressivo naturale di un roditore maschio adulto quando un intruso invade il suo territorio. Questo modello viene utilizzato in una varietà di specie di roditori, tra cui ratti, criceti e topi 1,2,3,4,5,6,7,8,9, e consiste in una combinazione di aggressione fisica e stress psicologico della durata di circa 10 giorni, durante i quali un roditore intruso sperimenta alcuni minuti di aggressione fisica da parte del roditore residente. I due roditori rimangono nella gabbia domestica del residente, separati da un divisorio che permette il contatto sensoriale ma non fisico⁷. Negli esperimenti sui topi, i topi residenti/aggressori più comunemente usati sono i topi CD-1 svizzeri da riproduzione in pensione, che mostrano un robusto comportamento territoriale contro i topi intrusi ^6,7. Per i topi intrusi, il ceppo meglio caratterizzato è il ceppo consanguineo C57BL/6 ^2,4,5. Il topo sconfitto è esposto a un nuovo aggressore ogni giorno per prevenire l'assuefazione all'aggressore. I topi di controllo sono alloggiati con un conspecifico diverso ogni giorno. A 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta, i topi sperimentali vengono testati in un test di interazione sociale (SIT) in cui possono esplorare un campo aperto in assenza (nessun bersaglio) o in presenza di un nuovo topo CD-1 (bersaglio). I topi di controllo trascorrono più tempo nella zona di interazione con il bersaglio rispetto alla parte non bersaglio del compito. I topi sconfitti sono classificati come suscettibili (rapporto<1) o resilienti (rapporto>1) in base a un rapporto di interazione sociale (tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore presente/tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore assente). Questa procedura fornisce uno strumento utile per studiare le differenze individuali in risposta allo stress.

Fino a pochi anni fa, il modello di stress da sconfitta sociale cronica è stato utilizzato principalmente nei topi maschi adulti perché le accentuate gerarchie di dominanza maschile implicano la lotta contro i maschi ma non contro le femmine ^6,7. Inoltre, i roditori maschi in genere non attaccano le femmine; invece, si impegnano in comportamenti di accoppiamento¹⁰. Nonostante questi ostacoli, sono state sviluppate diverse strategie per adattare il paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica per i topi femmine adulte. Ad esempio, il modello murino californiano di sconfitta sociale si basa sull'aggressività naturale di questa specie monogama di entrambi i sessi quando difendono il^{loro territorio.} Altri approcci si concentrano sull'induzione del comportamento aggressivo dei topi CD-1 stimolando il loro ipotalamo ventromediale ad avere un comportamento aggressivo costante^10,12, o applicando urina maschile nei topi femmine adulte sperimentali per ricevere attacchi dagli aggressori CD-1¹³. Questa accresciuta e costante aggressività dei topi CD-1 è fondamentale per il topo intruso sperimentale per mostrare chiari segni comportamentali di subordinazione nei confronti degli attacchi ripetuti da parte dell'aggressore durante la durata dell'interazione⁶.

Adattamento del modello di sconfitta sociale cronica da utilizzare nei topi C57BL/6 adolescenti
L'adolescenza è un periodo caratterizzato da una sostanziale maturazione psicosociale, che si svolge in parallelo con cambiamenti nella micro e macro architettura del cervello, in particolare nella corteccia prefrontale. Sia nell'uomo che nei roditori, c'è poco consenso riguardo all'inizio e alla fine specifici del periodo adolescenziale^14,15. Inoltre, ci sono finestre critiche di vulnerabilità all'interno dell'adolescenza per l'interruzione indotta dall'esperienza dello sviluppo cerebrale e cognitivo in corso 16,17,18,19. La pubertà e l'adolescenza si verificano contemporaneamente, ma questi termini non sono sinonimi. La pubertà indica l'inizio della maturazione sessuale, mentre l'adolescenza rappresenta una fase più ampia caratterizzata dal graduale passaggio da uno stato giovanile al raggiungimento dell'indipendenza²⁰. Diversi gruppi hanno suggerito che l'adolescenza nei topi si estende dallo svezzamento (PND 21) fino all'età adulta (PND 60)²¹. In particolare, la prima adolescenza può essere indicata come la prima e la seconda settimana dopo lo svezzamento (PND 21-34) e la metà dell'adolescenza come il periodo PND 35-48. Questi intervalli comprendono periodi di sviluppo distinti riguardanti ad esempio lo sviluppo del sistema della dopamina ^22,23,24, la vulnerabilità agli effetti dei farmaci sullo sviluppo delle reti neuronali 17,25,26,27 e caratteristiche comportamentali distinte 16,20,28,29,30.

Il comportamento di combattimento del topo residente è richiesto per il protocollo di sconfitta sociale. Tuttavia, come con i topi femmine, i maschi in genere non si impegnano in interazioni aggressive con i topi della prima adolescenza, forse perché non li percepiscono come una minaccia. La maggior parte degli studi che esplorano gli effetti della sconfitta sociale cronica nei topi adolescenti C57BL/6 sono stati condotti durante il periodo medio-adolescenziale 31,32,33,34,35; altri non specificano il giorno postnatale dell'esposizione adolescenziale^36,37, o estendono i giorni per la sconfitta alla prima età adulta³⁸ o non consentono il contatto sensoriale³⁹; Altri studi su topi adolescenti utilizzano ceppi diversi^40,41. Le caratteristiche di questi studi che utilizzano lo stress cronico da sconfitta sociale nei topi maschi adolescenti sono riassunte nella Tabella 1.

Il nostro gruppo di ricerca è interessato a individuare specifiche finestre di esposizione adolescenziali, inclusa la prima adolescenza, in topi C57BL/6. A causa della breve durata dei diversi periodi dell'adolescenza, è stata progettata una versione modificata della versione accelerata del paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica⁴². Questo modello è stato definito stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per i topi adolescenti. Lavori precedenti mostrano che ci sono significative differenze di sesso nella sensibilità allo stress sociale nell'adolescenza nei ratti ^{8,26,43,44,45}, così come negli effetti dannosi dello stress sociale sulle traiettorie di salute mentale negli esseri umani 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56. Il modello AcSD funziona efficacemente anche per i topi femmine adolescenti, consentendo loro di studiare le potenziali conseguenze specifiche del sesso e di esplorare le basi neurobiologiche.

Tabella 1: Studi che utilizzano paradigmi di stress da sconfitta sociale in topi maschi adolescenti. Ceppo e specie: California Topo: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 ceppo di topo consanguineo. C57BL/6J: Modello murino consanguineo nero 6 di M. musculus fornito dai laboratori di Jackson. CD-1: M. musculus da un ceppo di topo albino svizzero di razza. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research ha superato il ceppo di topo albino. OF1: M. musculus Oncins France 1 ceppo di topo albino di razza.
Abbreviazioni: wk = settimana; PND = Giorno postnatale; res = resiliente; sus = suscettibile; unsus = insensibile. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocollo

Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida del Canadian Council of Animal Care e approvate dalla McGill University e dal Douglas Hospital Animal Care Committee (numero di approvazione per esperimenti sugli animali: 2005-5084). Tutti i topi sono stati alloggiati in una stanza di colonia a temperatura e umidità controllate (21-22 °C; 60%) e su un ciclo luce-buio di 12 ore (luce accesa alle 8:00) presso il Neurophenotyping Centre del Douglas Mental Health University Institute. I topi hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua durante gli esperimenti. I topi sono stati assegnati in modo casuale a ciascuna condizione sperimentale. Gli animali da esperimento sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). La tabella 2 riassume le caratteristiche dell'animale per ogni fase sperimentale. In totale, 489 topi adolescenti C57BL/6J (259 maschi; 230 femmine) sono stati utilizzati in 20 coorti sperimentali.

Tabella 2: Soggetti animali per ogni fase sperimentale. ^†Se questi animali non sono gravemente feriti, possono essere riutilizzati per l'adescamento. ^‡Se questi animali non sono gravemente feriti, possono essere riutilizzati per l'adescamento durante l'AcSD, ^§Centro di neurofenotipizzazione del Douglas Mental Health University Institute. ^¶Per gli esperimenti con i maschi, ^#Per gli esperimenti con le femmine, se la sconfitta è mista, usa le femmine per l'adescamento. ^††Da non utilizzare per AcSD. Abbreviazioni: AcSD = stress da sconfitta sociale accelerata; PND = Giorno postnatale Clicca qui per scaricare questa tabella.

1. Acclimatazione

NOTA: Questa fase dovrebbe durare almeno 1 settimana.

1. Acquista topi riproduttori maschi CD-1 in pensione (vedi Tabella dei materiali) di età superiore a 4 mesi e il doppio della quantità dei topi adolescenti C57BL/6J (cioè, se 10 topi saranno esposti allo stress, acquista 20 topi CD-1).
   NOTA: Si raccomanda l'acquisizione di questa quantità di topi CD-1 perché solo una piccola percentuale di topi CD-1 mostra un comportamento aggressivo nei confronti dei topi adolescenti.
2. Lascia che i topi maschi CD-1 si abituino alla nuova struttura nella loro gabbia domestica con cibo e acqua ad libitum per 1 settimana prima dello screening e dell'adescamento.
3. Utilizzare C57BL/6 a PND >65 (adulti) e PND 25 ± 3 (adolescenti) (Tabella 2) per le sessioni di screening e priming. Acquisire 4 topi C57BL/6 di ogni età al giorno di adescamento (cioè, per 3 giorni di adescamento, acquisire 12 PND >65 e 12 PND 25 ± 3) per ridurre il rischio di lesioni perché questi animali verranno impiegati ripetutamente per il processo di screening e adescamento.

2. Screening e primering CD-1

NOTA: La durata di questa fase è di 3 giorni di screening (1 giorno per i topi femmine) e 3-4 giorni di priming (questo può aumentare per i topi femmine e, a seconda del comportamento aggressivo dei topi CD-1).

1. Utilizzare la definizione operativa di attacco per registrare gli attacchi del CD-1 come descritto di seguito.
   1. Un attacco è definito come quando il topo CD-1 morde il topo C57BL/6J e il topo C57BL/6J si allontana in risposta al morso. Un morso è definito come quando il topo CD-1 posiziona i denti su qualsiasi parte del corpo del topo C57BL/6J. L'allontanamento è definito come quando il mouse C57BL/6J sposta entrambe le zampe posteriori dalla posizione in cui si trovavano prima che il CD-1 lo attivasse.
   2. Assicurarsi che ci sia una differenza di almeno ~2 s tra attacchi separati. Se si verifica più di un morso a <2 s di distanza, conta come un attacco.
   3. Se il topo CD-1 morde più di una volta di seguito senza interruzione (<~2 s di distanza), separare delicatamente gli animali con un righello di plastica. Se il topo CD-1 morde e non lo lascia andare, separare delicatamente gli animali. Se il mouse C57BL/6J rimane intrappolato in un angolo o viene bloccato dal mouse CD-1 e non può allontanarsi in risposta a un morso, separare delicatamente gli animali con un righello. Conta tutti questi come un unico attacco (fino alla separazione).
2. Vagliatura
   1. Utilizzare guanti da esplorazione in nitrile per tutte le manipolazioni degli animali ed evitare l'uso di profumi o fragranze.
   2. Eseguire il 1^° giorno dello screening solo con topi maschi adulti C57BL/6 come intrusi (PND >65) nella gabbia domestica dei topi CD-1. Esamina sempre i topi CD-1 prima di un nuovo esperimento.
   3. Introdurre un topo maschio adulto C57BL/6 PND >65 nella gabbia domestica di un topo maschio CD-1 per 3 minuti. Registrare la latenza alla prima aggressione e il numero di aggressioni eseguite (vedere la Tabella supplementare 1).
   4. Dal 2^{° all'ultimo} giorno di screening, introdurre un maschio adulto di C57BL/6 PND>65 per 1 minuto (limite a 30 secondi se il CD-1 è molto aggressivo) e poi sostituirlo con un adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 per 5 minuti.
      NOTA: È importante eseguire lo screening con topi adolescenti perché non tutti i topi che attaccano il topo maschio adulto C57BL/6 attaccheranno l'adolescente C57BL/6. Infatti, i topi CD-1 che attaccano i topi adolescenti non sempre attaccano i maschi adulti C57BL/6.
   5. Se l'esperimento è per l'aggressività nei confronti di topi femmine, eseguire lo screening e il priming con topi femmine adolescenti, anche se i topi sperimentali includono entrambi i sessi.
   6. Registrare la latenza alla prima aggressione, il numero di attacchi e le ferite ricevute da tutti i topi C57BL/6 (vedi Tabella supplementare 2).
   7. Registra qualsiasi tipo di interazione: inseguimento, comportamenti di montaggio, annusare, pettinare o mordere. Registrare se il CD-1 non si avvicina ai topi C57BL/6 adolescenti; se questo comportamento si ripete per 2 giorni, non includere il CD-1 nel priming.
   8. Per la fase di adescamento, selezionare tutti i mouse CD-1 che mostrano comportamenti come inseguire, montare comportamenti, annusare, seguire, adescare o mordere l'adolescente C57BL/6.
   9. Conserva i topi CD-1 non selezionati e usali per il test di interazione sociale (SIT).
      NOTA: Il comportamento territoriale aumenta con il tempo; pertanto, i topi CD-1 non selezionati possono diventare aggressivi nei confronti dei topi adolescenti nell'esperimento successivo.
3. Comportamento aggressivo del CD-1 di adescamento
   1. Ospita i topi CD-1 selezionati per l'adescamento nella loro gabbia domestica fino all'ultimo giorno di adescamento.
   2. Introdurre un topo maschio adulto C57BL/6J PND >65 per 30 s nella gabbia domestica CD-1 e poi sostituirlo con un topo adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 per 5 minuti.
   3. Registra la latenza alla prima aggressione, il numero di attacchi e qualsiasi interazione (vedi Tabella supplementare 3).
   4. Eseguire l'adescamento 2 volte al giorno per 3-4 giorni nello stesso momento in cui sono programmate le sconfitte (9:00 e 14:00).
      NOTA: Non tutti i topi CD-1 attaccheranno i topi adolescenti durante i primi giorni, specialmente se l'innesco è verso topi femmine. Il numero di giorni per l'adescamento può aumentare o diminuire a seconda del comportamento aggressivo mostrato dai topi CD-1.
   5. Per ridurre il numero di giorni di adescamento, riutilizzare i topi CD-1 che hanno subito un precedente esperimento di sconfitta sociale con topi maschi. Se i topi CD-1 non mostrano una maggiore aggressività, prolungare i giorni per l'adescamento fino a raggiungere i criteri.
   6. Diminuire i giorni per l'adescamento se i topi CD-1 mostrano un comportamento estremamente aggressivo (i topi C57BL/6 mostrano ferite eccessive) per prevenire gravi lesioni durante la sconfitta sociale.
   7. Per la fase successiva dell'esperimento, selezionare i topi CD-1 che attaccano i topi adolescenti almeno 10 volte (maschi) o 5 volte (femmine) per 2 giorni consecutivi.

3. Protocollo AcSD

NOTA: Questa fase consiste in 3 giorni di assuefazione e 4 giorni di esposizione all'AcSD.

1. Assuefazione
   1. Impostare le gabbie per topi per la sconfitta sociale (Figura 1A-F). Dividere le gabbie per ratti in 2 scomparti utilizzando appositi divisori in vetro acrilico (Figura 1B, D; vedi Tabella dei materiali).
   2. Aggiungere una lettiera di trucioli di legno duro su entrambi i lati della gabbia, aggiungere un quadrato di cotone per lato come materiale di lettiera (Figura 1D). Assicurarsi che la parte superiore del filo sia fissata con clip per legante (Figura 1E). Assicurarsi che la gabbia per topi sia coperta con il coperchio senza il cotone protettivo (Figura 1F).
   3. Posiziona un topo CD-1 per gabbia su un lato della gabbia. Posiziona un'etichetta all'esterno della gabbia per una facile identificazione di ogni topo.
   4. Ospitare i topi CD-1 selezionati nell'apparato di sconfitta sociale (Figura 1F) 2 o 3 giorni prima dell'inizio del protocollo AcSD (per migliorare il comportamento territoriale del CD-1).
   5. Eseguire una sessione di priming 1 giorno prima dell'esperimento; Questo è importante per mantenere l'aggressività coerente.
2. Sconfiggi le sessioni
   1. Esegui 2 sessioni al giorno (prima sessione: 9 del mattino, seconda sessione: 2 PM) per 4 giorni, 8 sessioni in totale. Fai un programma per assicurarti che l'aggressore sia diverso per ogni sessione (vedi Tabella supplementare 4 e Tabella supplementare 5).
   2. Pesare il mouse adolescente C57BL/6 prima di introdurlo sul lato CD-1 della gabbia. Introduci un topo maschio adulto C57BL/6 >65 per 30 s nel lato CD-1 della gabbia di sconfitta e poi sostituiscilo con un topo adolescente C57BL/6 PND 24-28 per un episodio di sconfitta lungo 10 minuti o un massimo di 10 attacchi per sessione.
   3. Separa gli animali dopo ogni attacco con un righello di plastica. Dopo ogni sessione di sconfitta, controlla la presenza di lesioni e trattale con una crema antidolorifica. Registra il numero di infortuni.
   4. Posiziona il mouse adolescente C57BL/6J nello scomparto libero accanto a un aggressore sconosciuto fino alla sessione successiva. Ripetere la procedura con un aggressore diverso ogni sessione.
   5. Inizia la sessione con i topi sperimentali e aggressori che non sono stati accoppiati nella sessione precedente. Monitorare le lesioni dei topi maschi adulti C57BL/6J utilizzati per l'adescamento (vedere la Tabella supplementare 6).
3. Seguire le raccomandazioni riportate di seguito per il benessere degli animali e gli endpoint umani.
   1. Seguire la procedura operativa standard del comitato di revisione istituzionale corrispondente per le sconfitte sociali e garantire una valutazione veterinaria costante.
   2. Monitora la salute dei topi durante lo studio per evitare la sofferenza e la morte degli animali.
   3. Verificare che il divisorio perforato sia impostato correttamente per evitare che i topi attraversino l'altro scomparto.
   4. Avvisare il personale veterinario quando un animale ha una ferita per un monitoraggio appropriato e applicare quotidianamente una crema antidolorifica fino a quando la ferita non è completamente guarita.
   5. Se un infortunio peggiora (le ferite aumentano di dimensioni), limitare gli attacchi a 5 nella sessione successiva consentendo il recupero. Verificare la presenza di lesioni gravi. Le lesioni gravi sono definite come ferite per un totale > 1 cm.
   6. Rimuovere immediatamente e sopprimere gli animali che presentano una riduzione del 15%-20% del loro peso rispetto al peso corporeo iniziale; ridotta/diminuita attività locomotoria e alterata toelettatura; topi con ferite > 1 cm; pene reciso o segni di morsi con gonfiore degli arti anteriori.
      NOTA: L'eutanasia primaria viene condotta tramite camere a gas isoflurano/CO2, seguita dall'eutanasia secondaria eseguita mediante lussazione cervicale.
4. Controllare i mouse
   1. Esegui 2 sessioni al giorno (prima sessione: 9 del mattino, seconda sessione: 2 PM) per 4 giorni, 8 sessioni in totale. Stabilire un programma per assicurarsi che i topi di controllo condividano la gabbia con un diverso conspecifico C57BL/6J ad ogni sessione (vedere la Tabella supplementare 7 e la Tabella supplementare 8).
      NOTA: I topi di controllo non sono esposti ad un aggressore. Per imitare l'introduzione di un nuovo topo CD-1 ad ogni sessione di sconfitta, i topi di controllo vengono accoppiati con un nuovo conspecifico dello stesso sesso e della stessa età (non cucciolata) ad ogni sessione.
   2. Alloggiare i topi di controllo nell'apparato di sconfitta sociale (Figura 1) in una stanza separata da quella dei topi AcSD.
   3. Posiziona due topi di controllo per gabbia, uno su ciascun lato della gabbia. Ospita i topi in un lato diverso della gabbia o in una gabbia completamente diversa, in modo che non riconoscano l'odore. Ruota i mouse di controllo a ogni sessione.

Figura 1: Apparecchio per lo stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per topi adolescenti. (A) Da sinistra a destra, sommità accoppiate in filo d'acciaio con 0,6 cm di separazione tra le barre, divisorio in policarbonato perforato trasparente con diametro di perforazione di 0,6 cm, clip per legare per fissare le parti superiori in filo, gabbia per topi trasparente con coperchio di copertura (senza strato protettivo in cotone). (B) Up: confronto tra i divisori in policarbonato per la sconfitta sociale cronica negli adulti (a sinistra) e l'AcSD negli adolescenti (a destra); Giù: vicino al divisorio in policarbonato per topi adolescenti. (C) In alto: confronto tra le cime di filo d'acciaio per la sconfitta sociale cronica negli adulti (a sinistra) e l'AcSD negli adolescenti (a destra); Giù: primo piano delle cime in filo d'acciaio. (D-F) Assemblaggio dell'apparato di sconfitta sociale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Test di interazione sociale

1. Eseguire il SIT seguendo l'AcSD come descritto in precedenza 57,58,59.
   1. Eseguire il SIT 24 ore dopo l'ultima sessione di AcSD. Eseguire il SIT in condizioni di luce rossa (non in condizioni di luce gialla) tra le 9 e le 16.
   2. Allestisci l'arena quadrata principale e la videocamera dall'alto (vedi Tabella dei materiali). L'arena principale è divisa in 3 aree: la zona di interazione sociale (SIZ), gli angoli e il centro; Queste aree dovrebbero essere contrassegnate nell'arena con una linea nera (usa un pennarello indelebile nero). Per ogni area, utilizzate le dimensioni e i criteri riportati di seguito.
      1. Assicurarsi che il SIZ sia l'area quadrata di 14 cm x 9 cm che circonda l'involucro. Gli angoli sono piccole aree quadrate (9 cm x 9 cm) negli angoli del muro opposto al recinto e rappresentano il punto più lontano dalla SIZ. Il centro è l'area tra la SIZ e gli angoli.
   3. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
   4. Posizionare le targhette di identificazione per ogni animale sul pavimento per l'analisi. Registra tutto il comportamento degli animali per l'analisi offline.
2. Prima sessione per determinare l'esplorazione di base
   1. Posiziona una recinzione di rete metallica vuota contro una delle pareti dell'arena. Posiziona il mouse sperimentale (sconfitto o di controllo) adolescente C57BL/6 al centro dell'arena. Lasciargli esplorare liberamente l'arena per 2,5 minuti. Recupera il mouse.
   2. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
3. Seconda sessione per l'interazione sociale
   1. Posizionare un mouse CD-1 sconosciuto all'interno dell'involucro della rete metallica. Posizionare l'involucro nella stessa posizione della sessione precedente.
   2. Reintroduci lo stesso mouse C57BL/6 adolescente nell'arena. Lasciargli esplorare liberamente l'arena per 2,5 minuti. Recupera i topi.
   3. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
   4. Ripetere il processo per tutti i topi C57BL/6 adolescenti (topi stressati e di controllo) in un ordine controbilanciato.
   5. Utilizzare più di un mouse CD-1 per il SIT per ridurre lo stress da manipolazione e i bias (ad esempio, per una coorte di 30 topi C57BL/6, utilizzare 4 topi CD-1). Controbilanciali tra i topi adolescenti.
      NOTA: Questo test misura l'approccio e/o il comportamento di evitamento dei topi sperimentali verso un bersaglio sociale, come descritto per la prima volta da Krishnan⁵ e Golden⁷.
4. Analisi
   1. Registra il tempo o i tempi trascorsi nella zona di interazione e negli angoli durante entrambe le sessioni del test.
   2. Calcola il rapporto di interazione sociale come il tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore CD-1 presente diviso per il tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore CD-1 assente.
   3. Classificare i topi stressati con un rapporto < 1,00 come suscettibili e un rapporto ≥ 1,00 come resilienti.
   4. Escludere gli animali che non esplorano l'arena durante la prima sessione (cioè che hanno trascorso 0 s in una qualsiasi delle aree designate) da tutte le analisi per controllare le differenze nell'attività locomotoria.
   5. Escludere da tutte le analisi tutti gli animali che ricevono 0 attacchi in sessioni di sconfitta sociale ≥4 per prevenire animali resilienti non rappresentativi.
   6. Escludere i topi (non sensibili) che non trascorrono almeno 61 s all'interno della zona di interazione per garantire che alti rapporti di interazione sociale riflettano l'effettivo interesse per il target sociale.
   7. Escludere i topi con punteggi del rapporto di interazione anomali.

Risultati

Un totale di quattro diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il modello di stress da sconfitta sociale cronica in topi maschi adolescenti C57BL/6 (PND 21). Tuttavia, questo modello presentava importanti limitazioni per il suo utilizzo nei topi C57BL/6 della prima adolescenza.

Modifiche all'attrezzatura necessarie per i topi C57BL/6 adolescenti
La prima limitazione era che l'attrezzatura utilizzata per l'apparato di lotta sociale era stata progettata per topi adu...

Discussione

Comportamento coerente e aggressivo nei topi CD-1
Durante la fase di screening, è molto importante prendere nota di tutti i comportamenti mostrati dal CD-1 (inseguimento, comportamenti di montaggio, annusare, toelettare o mordere) e seguire attentamente questi record quando si selezionano i topi CD-1 per l'AcSD. È probabile che un topo CD-1 che interagisce con il topo adolescente senza attaccarlo svilupperà aggressività nei confronti dei topi adolescenti durante l'adescamento. Al contrario, un top...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.