청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델

요약

우리는 청소년 C57BL/6 마우스를 위한 가속 사회적 패배 스트레스 모델을 개발했는데, 이는 남성과 여성 모두에게 작용하고 불연속적인 청소년 기간 동안 노출을 허용합니다. 이 모델에 대한 노출은 사회적 회피를 유발하지만, 패배한 수컷과 암컷 쥐의 하위 집합에서만 가능합니다.

초록

청소년기의 사회적 역경은 널리 퍼져 있으며 정신 건강 궤적에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 청소년 남성과 여성 설치류의 사회적 스트레스를 모델링하는 것은 지속적인 뇌 발달 및 행동 결과에 미치는 영향을 이해하는 데 필요합니다. 만성 사회적 패배 스트레스 패러다임(CSDS)은 자신의 영역을 침범하는 침입자에 대해 성인 남성 설치류가 보여주는 공격적인 행동을 활용하여 성인 C57BL/6 수컷 마우스의 사회적 스트레스를 모델링하는 데 널리 사용되었습니다. 이 패러다임의 장점은 패배한 쥐를 마지막 패배 세션 후 24시간 후 사회적 행동의 개인차에 따라 탄력적이고 감수성이 있는 그룹으로 분류할 수 있다는 것입니다. 청소년 C57BL/6 마우스에서 이 모델을 구현하는 것은 성인 또는 청소년 마우스가 일반적으로 초기 청소년 남성 또는 여성 마우스를 공격하지 않고 청소년기는 짧은 수명이며 신중한 시간적 취약성 창을 포함하기 때문에 어려웠습니다. 이러한 한계는 CSDS의 가속 버전을 사춘기 수컷 및 암컷 마우스에 사용하도록 조정함으로써 극복되었습니다. 하루에 2번의 신체적 공격 세션으로 구성된 이 4일 스트레스 패러다임은 C57BL/6 남성 성인을 사용하여 CD-1 마우스의 공격성을 프라이밍하여 남성 또는 여성 청소년 마우스를 쉽게 공격합니다. 이 모델은 청소년 마우스에 대한 가속 사회적 패배 스트레스(AcSD)라고 불렸습니다. AcSD에 대한 청소년 노출은 남성과 여성 모두에서 24시간 후에 사회적 회피를 유발하지만, 패배한 쥐의 하위 집합에서만 유발됩니다. 이 취약성은 복구 가능한 그룹과 취약한 그룹 간의 세션 간에 일관된 공격 수에도 불구하고 발생합니다. AcSD 모델은 청소년기 내의 불연속적인 기간 동안 노출을 허용할 만큼 충분히 짧고, 사회적 회피 행동의 유무에 따라 마우스를 분리할 수 있으며, 청소년 C57BL/6 암컷 마우스의 사회적 패배 스트레스를 연구할 수 있는 최초의 모델입니다.

서문

만성 사회적 패배 스트레스 패러다임은 성인 출생 후 일(PND) >65 남성 설치류의 사회적 스트레스를 모델링하는 데 널리 사용됩니다. 이 패러다임은 침입자가 자신의 영역을 침범했을 때 성인 남성 설치류의 자연스러운 공격적인 행동을 기반으로합니다. 이 모델은 쥐, 햄스터 및 생쥐 1,2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 다양한 설치류 종에 사용되며, 약 10 일 동안 지속되는 신체적 공격성과 심리적 스트레스의 조합으로 구성되며, 그 동안 침입자 설치류는 거주 설치류로부터 몇 분의 신체적 공격성을 실험합니다. 두 마리의 설치류는 거주자의 집 우리에 남아 있으며, 감각은 가능하지만 신체 접촉은 허용하지 않는 칸막이로 분리되어 있습니다⁷. 생쥐 실험에서, 가장 일반적으로 사용되는 거주/침략자 생쥐는 은퇴한 사육자 스위스 CD-1 생쥐로, 침입자 생쥐 ^6,7에 대한 강력한 영토 행동을 보여준다. 침입자 마우스의 경우 가장 특징적인 균주는 근친 교배 C57BL/6 균주 ^2,4,5입니다. 패배한 쥐는 침략자에 대한 습관화를 방지하기 위해 매일 새로운 공격자에게 노출됩니다. 대조군 마우스는 매일 다른 동종과 함께 수용됩니다. 마지막 패배 세션 후 24시간이 지나면 실험용 마우스는 새로운 CD-1 마우스(대상)가 없거나 존재할 때 열린 필드를 탐색할 수 있는 사회적 상호 작용 테스트(SIT)에서 테스트됩니다. 대조군 마우스는 과제의 비표적 부분에 비해 표적과의 상호작용 영역에서 더 많은 시간을 보냅니다. 패배한 쥐는 사회적 상호작용 비율(공격자가 있는 상호작용 영역에서 보낸 시간/공격자가 없는 상호작용 영역에서 보낸 시간)에 따라 감수성(비율<1) 또는 회복력(비율>1)으로 분류됩니다. 이 절차는 스트레스에 대한 반응의 개인차를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

최근 몇 년 전까지, 만성 사회적 패배 스트레스 모델은 주로 성인 수컷 마우스에서 사용되었는데, 이는 강조된 남성 지배 계층이 수컷과의 싸움을 포함하지만 암컷과는 싸우지 않기 때문이다 ^6,7. 또한, 수컷 설치류는 일반적으로 암컷을 공격하지 않습니다. 대신, 그들은 짝짓기 행동에 참여한다¹⁰. 이러한 장애물에도 불구하고, 성인 암컷 쥐에 대한 만성 사회적 패배 스트레스 패러다임을 적응시키기 위해 다양한 전략이 개발되었습니다. 예를 들어, 사회적 패배에 대한 캘리포니아 쥐 모델은 자신의 영토를 방어 할 때이 일부일처제 종의 남녀 모두의 자연스러운 공격성을 기반으로합니다 ^9,11. 다른 접근법은 CD-1 마우스의 복내측 시상하부를 자극하여 일관된 공격적 행동을 갖도록 유도하거나^10,12 또는 실험용 성인 암컷 마우스에 수컷 소변을 적용하여 CD-1 공격자로부터 공격을 받도록 하는 데 초점을 맞춘다¹³. CD-1 마우스의 이러한 고조되고 일관된 공격성은 실험적 침입자 마우스가 상호작용 기간 동안 공격자에 의한 반복적인 공격에 대한 종속의 명확한 행동 징후를 보이는 데 중요하다⁶.

만성 사회적 패배 모델을 청소년 C57BL/6 마우스에 적용하기 위해
청소년기는 상당한 심리 사회적 성숙으로 특징지어지는 기간으로, 뇌의 미시적 및 거시적 구조, 특히 전전두엽 피질의 변화와 병행하여 전개됩니다. 인간과 설치류 모두에서, 사춘기의 구체적인 시작과 끝에 대한 합의는 거의 없다^14,15. 더욱이, 청소년기에는 지속적인 뇌 및 인지 발달의 경험에 의한 혼란에 대한 중요한 취약성의 창이 있다 16,17,18,19. 사춘기와 청소년기는 동시에 발생하지만 이러한 용어는 동의어가 아닙니다. 사춘기는 성적 성숙의 시작을 의미하는 반면, 청소년기는 청소년 상태에서 독립을 달성하는 단계로의 점진적인 변화를 특징으로 하는 더 넓은 단계를 나타냅니다²⁰. 다른 그룹은 쥐의 청소년기가 이유기(PND 21)부터 성체(PND 60)까지라고 제안했습니다(PND 60)²¹. 특히, 초기 청소년기는 이유식 후 첫 번째 및 두 번째 주(PND 21-34)라고 할 수 있으며 청소년기 중반은 PND 35-48 기간이라고 할 수 있습니다. 이 범위는 예를 들어 도파민 시스템의 발달 (22,23,24), 신경 네트워크^(17,25,26,27)에 대한 약물 효과에 대한 취약성 및 뚜렷한 행동 특성 ^{(16,20,28,29,30})과 관련된 불연속적인 발달 기간을 포함합니다 을 클릭합니다.

거주 쥐의 싸움 행동은 사회적 패배 프로토콜에 필요합니다. 그러나 암컷 마우스와 마찬가지로 수컷은 일반적으로 초기 사춘기 마우스와 공격적인 상호 작용에 참여하지 않는데, 이는 아마도 위협으로 인식하지 않기 때문일 수 있습니다. 청소년 C57BL/6 마우스에서 만성적인 사회적 패배의 영향을 조사하는 대부분의 연구는 청소년 중반기에 수행되었다 31,32,33,34,35; 다른 사람들은 청소년기에 노출된 출생 후일을 명시하지 않거나^36,37 패배의 날을 초기 성인기³⁸로 연장하거나 감각 접촉을 허용하지 않는다³⁹. 청소년 쥐에 대한 다른 연구는 다른 균주를 사용합니다^40,41. 청소년 수컷 마우스에서 만성적인 사회적 패배 스트레스를 이용한 이러한 연구의 특징은 표 1에 요약되어 있다.

우리 연구 그룹은 C57BL/6 마우스에서 초기 청소년기를 포함한 특정 청소년 노출 창을 표적으로 삼는 데 관심이 있습니다. 다양한 청소년 시기의 기간이 짧기 때문에, 만성적인 사회적 패배 스트레스 패러다임의 가속화된 버전의 수정된 버전이 고안되었다⁴². 이 모델은 청소년 마우스에 대한 가속 사회적 패배 스트레스(AcSD)라고 불렸습니다. 이전 연구는 쥐 8,26,43,44,45에서 청소년기의 사회적 스트레스에 대한 민감도에 상당한 성별 차이가 있음을 보여주며, 인간의 정신 건강 궤적에 대한 사회적 스트레스의 해로운 영향에도 유의한 성별 차이가 있음을 보여줍니다 46,47,48,49,50,51,52^, 53,54,55,56입니다. AcSD 모델은 사춘기 암컷 쥐에게도 효과적으로 작용하여 잠재적인 성별 특이적 결과를 조사하고 신경생물학적 기초를 탐구할 수 있습니다.

표 1: 청소년 수컷 마우스에서 사회적 패배 스트레스 패러다임을 사용한 연구. 균주 및 종 : 캘리포니아 쥐 : Peromyscus californicus. C57BL / 6 : Mus musculus black 6 근친 마우스 변형. C57BL/6J: Jackson's laboratories에서 제공한 M. musculus black 6 근친 마우스 모델. CD-1 : 스위스 근친 알비노 마우스 계통의 M. musculus . ICR: M. musculus Institute of Cancer Research 근친교배 알비노 마우스 균주. OF1 : M. musculus Oncins France 1 근친 알비노 마우스 변형.
약어: wk = week; PND = 산후일; res = 탄력적; SUS = 민감성; unsus = 민감하지 않음. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

실험 절차는 캐나다 동물 보호 협의회(Canadian Council of Animal Care)의 지침에 따라 수행되었으며 McGill University 및 Douglas Hospital Animal Care Committee(동물 실험 승인 번호: 2005-5084)의 승인을 받았습니다. 모든 마우스는 더글라스 정신 건강 대학 연구소(Douglas Mental Health University Institute)의 신경 표현형 센터(Neurophenotyping Centre)에서 온도 및 습도 조절(21-22 °C; 60%) 콜로니 룸과 12시간 연암주기 (8:00 h에 점등)에 수용되었습니다. 쥐는 실험 내내 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 마우스는 각 실험 조건에 무작위로 할당되었습니다. 실험 동물은 상업적인 출처로부터 얻어졌다( 재료 표 참조). 표 2 는 각 실험 단계에 대한 동물의 특성을 요약한 것이다. 총 489마리의 청소년 C57BL/6J 마우스(남성 259명, 여성 230명)가 20개의 실험 코호트에 걸쳐 사용되었습니다.

표 2: 각 실험 단계에 대한 동물 피험자. ^†이 동물이 심하게 다치지 않았다면 프라이밍에 재사용할 수 있습니다. ^‡이 동물이 심하게 다치지 않은 경우 Douglas Mental Health University Institute의 ^§Neurophenotyping Centre 인 AcSD 중에 프라이밍에 재사용할 수 있습니다. ^¶남성을 대상으로 한 실험의 경우, ^#여성을 대상으로 한 실험의 경우, 패배가 혼합되어 있다면 여성을 프라이밍으로 사용합니다. ^††AcSD에는 사용할 수 없습니다. 약어: AcSD = 가속화된 사회적 패배 스트레스; PND = Postnatal day 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

1. 순응

참고: 이 단계는 최소 1주일 동안 지속되어야 합니다.

1. 생후 4개월 이상이고 청소년 C57BL/6J 마우스의 두 배인 수컷 CD-1 은퇴 사육 마우스( 재료 표 참조)를 구입합니다(즉, 10마리의 마우스가 스트레스에 노출될 경우 20개의 CD-1 마우스를 구입).
   참고: 이 정도의 CD-1 마우스를 구입하는 것이 권장되는데, 그 이유는 CD-1 마우스의 극히 일부만이 청소년 마우스에 대해 공격적인 행동을 보이기 때문입니다.
2. CD-1 수컷 마우스가 스크리닝 및 프라이밍 전 1주일 동안 음식과 물과 함께 가정용 케이지의 새로운 시설에 적응하도록 합니다.
3. 스크리닝 및 프라이밍 세션을 위해 PND >65(성인) 및 PND 25 ± 3(청소년)에서 C57BL/6을 사용합니다(표 2). 프라이밍 일당 각 연령의 C57BL/6 마우스 4마리를 획득하여(즉, 프라이밍 3일 동안 12 PND>65 및 12 PND 25 ± 3) 부상 위험을 줄입니다. 이러한 동물은 스크리닝 및 프라이밍 과정에 반복적으로 고용되기 때문입니다.

2. CD-1 스크리닝 및 프라이밍

참고: 이 단계의 기간은 스크리닝 3일(암컷 마우스의 경우 1일) 및 프라이밍 3-4일입니다(암컷 마우스의 경우 CD-1 마우스의 공격적인 행동에 따라 증가할 수 있음).

1. 공격의 운영 정의를 사용하여 아래 설명된 대로 CD-1의 공격을 등록합니다.
   1. 한 가지 공격은 CD-1 마우스가 C57BL/6J 마우스를 물고 C57BL/6J 마우스가 물린 것에 대한 반응으로 멀어지는 것으로 정의됩니다. 교합은 CD-1 마우스가 C57BL/6J 마우스의 신체 부위에 이빨을 대는 것으로 정의됩니다. 멀어진다는 것은 C57BL/6J 마우스가 CD-1이 맞물리기 전의 위치에서 두 뒷발을 모두 움직이는 것으로 정의됩니다.
   2. 개별 공격 간에 최소 ~2초의 차이가 있는지 확인합니다. <2초 간격을 두고 두 번 이상 물리면 한 번의 공격으로 간주됩니다.
   3. CD-1 쥐가 쉬지 않고 한 번 이상 연속으로 물면 (<~2초 간격으로) 플라스틱 자로 동물을 부드럽게 분리하십시오. CD-1 쥐가 물고 놓지 않으면 동물을 부드럽게 분리하십시오. C57BL/6J 마우스가 구석에 끼이거나 CD-1 마우스에 끼여 물렸을 때 움직일 수 없는 경우 자로 동물을 부드럽게 분리하십시오. 이 모든 것을 하나의 공격으로 계산합니다(최대 분리).
2. 심사
   1. 모든 동물 취급에는 니트릴 검사 장갑을 사용하고 향수나 향료의 사용을 피하십시오.
   2. CD-1 마우스 홈 케이지에서 성인 C57BL/6 수컷 마우스를 침입자(PND >65)로 간주하여 스크리닝 1^일 째만 수행합니다. 새로운 실험을 하기 전에 항상 CD-1 마우스를 스크리닝하십시오.
   3. 성인 남성 C57BL / 6 마우스 PND >65를 CD-1 남성 마우스의 홈 케이지에 3 분 동안 소개합니다. 첫 번째 공격에 대한 대기 시간을 등록하고 얼마나 많은 공격이 수행되는지 확인합니다( 보충 표 1 참조).
   4. 상영 2^일부터 마지막 날까지 성인 남성 C57BL/6 PND>65를 1분 동안 소개하고(CD-1이 매우 공격적인 경우 30초로 제한) 청소년 C57BL/6 PND 25 ± 3으로 5분 동안 교체합니다.
      참고: 성체 C57BL/6 수컷 마우스를 공격하는 모든 마우스가 청소년 C57BL/6을 공격하는 것은 아니기 때문에 청소년 마우스로 스크리닝을 수행하는 것이 중요합니다. 사실, 사춘기 마우스를 공격하는 CD-1 마우스가 항상 성인 C57BL/6 수컷을 공격하는 것은 아니다.
   5. 실험이 암컷 마우스에 대한 공격성을 위한 것이라면 실험용 마우스에 남녀가 모두 포함되어 있더라도 사춘기 암컷 마우스로 스크리닝 및 프라이밍을 수행합니다.
   6. 첫 번째 공격에 대한 대기 시간, 공격 횟수 및 모든 C57BL/6 마우스가 받은 상처를 등록합니다( 보충 표 2 참조).
   7. 모든 종류의 상호 작용을 등록합니다: 쫓기, 장착 동작, 킁킁거리기, 손질 또는 무기. CD-1이 청소년 C57BL/6 마우스에 접근하지 않는 경우 등록하십시오. 이 동작이 2일 동안 반복되면 프라이밍에 CD-1을 포함하지 마십시오.
   8. 프라이밍 단계에서는 청소년 C57BL/6을 쫓기, 장착 행동, 킁킁거리기, 따라다니기, 그루밍 또는 무는 등의 행동을 보이는 모든 CD-1 마우스를 선택합니다.
   9. 선택하지 않은 CD-1 마우스를 보관하고 사회적 상호 작용 테스트(SIT)에 사용합니다.
      참고: 영역 행동은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 따라서, 선택되지 않은 CD-1 마우스는 다음 실험에서 사춘기 마우스에 대해 공격적이 될 수 있다.
3. CD-1의 공격적인 행동 준비
   1. 프라이밍을 위해 선택한 CD-1 마우스를 프라이밍의 마지막 날까지 홈 케이지에 보관합니다.
   2. 성인 남성 C57BL / 6J 마우스 PND >65를 CD-1 홈 케이지에 30 초 동안 도입 한 다음 청소년 C57BL / 6 PND 25 ± 3 마우스로 5 분 동안 교체합니다.
   3. 첫 번째 공격, 공격 횟수 및 모든 상호 작용에 대한 대기 시간을 등록합니다( 보충 표 3 참조).
   4. 패배가 예정된 동시에 3-4 일 동안 하루에 2 번 프라이밍을 수행하십시오 (9 : 00 오전 및 2 : 00 오후).
      참고: 모든 CD-1 마우스가 처음 며칠 동안 사춘기 마우스를 공격하는 것은 아니며, 특히 프라이밍이 암컷 마우스를 대상으로 하는 경우 더욱 그렇습니다. 프라이밍 일수는 CD-1 마우스가 보여주는 공격적인 행동에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다.
   5. 프라이밍 일수를 줄이려면 이전에 수컷 마우스로 사회적 패배 실험을 거친 CD-1 마우스를 재사용하십시오. CD-1 마우스에서 공격성이 증가하지 않으면 기준에 도달할 때까지 프라이밍 기간을 연장합니다.
   6. CD-1 마우스가 극도로 공격적인 행동을 보이는 경우(C57BL/6 마우스가 과도한 상처를 보이는 경우) 사회적 패배 중 심각한 부상을 방지하기 위해 프라이밍 일수를 줄입니다.
   7. 실험의 다음 단계에서는 2일 연속 10배(수컷) 또는 5배(암컷) 이상 청소년 마우스를 공격하는 CD-1 마우스를 선택합니다.

3. AcSD 프로토콜

참고: 이 단계는 3일의 습관화와 4일의 AcSD 노출로 구성됩니다.

1. 습관화
   1. 사회적 패배를 위해 쥐 우리를 설정하십시오 (그림 1A-F). 적절한 아크릴 유리 칸막이를 사용하여 쥐 우리를 2개의 구획으로 나눕니다(그림 1B, D, 재료 표 참조).
   2. 케이지의 양쪽에 단단한 우드칩 침구를 추가하고 침구 재료로 한 면당 면 사각형을 추가합니다(그림 1D). 와이어 상단이 바인더 클립으로 고정되어 있는지 확인합니다(그림 1E). 쥐 케이지가 보호용 면이 없는 덮개 덮개로 덮여 있는지 확인합니다(그림 1F).
   3. 케이지당 CD-1 마우스를 케이지의 한쪽에 놓습니다. 각 마우스를 쉽게 식별할 수 있도록 케이지 외부에 태그를 배치합니다.
   4. AcSD 프로토콜이 시작되기 2-3일 전에 선택된 CD-1 마우스를 사회적 패배 장치(그림 1F)에 넣는다(CD-1 영토 행동을 강화하기 위해).
   5. 실험 1일 전에 프라이밍 세션을 수행합니다. 이것은 공격성을 일관되게 유지하는 데 중요합니다.
2. 패배 세션
   1. 하루 2회(1회: 오전 9시, 2회: 오후 2시) 4일간 총 8회를 진행한다. 공격자가 각 세션마다 다를 수 있도록 일정을 세웁니다( 보충 표 4 및 보충 표 5 참조).
   2. C57BL/6 청소년 마우스를 케이지의 CD-1 면에 도입하기 전에 무게를 잰다. 성인 남성 C57BL/6 마우스>65를 패배 케이지의 CD-1 쪽에 30초 동안 삽입한 다음 청소년 C57BL/6 PND 24-28 마우스로 교체하여 10분 길이의 패배 에피소드 또는 세션당 최대 10번의 공격을 제공합니다.
   3. 각 공격 후에는 플라스틱 자로 동물을 분리하십시오. 패배를 맛볼 때마다 부상 여부를 확인하고 통증 완화 크림으로 치료한다. 부상 횟수를 등록합니다.
   4. 다음 세션까지 청소년 C57BL/6J 마우스를 낯선 공격자 옆의 빈 칸에 놓습니다. 각 세션마다 다른 공격자와 함께 절차를 반복합니다.
   5. 이전 세션에서 쌍을 이루지 않은 실험 마우스와 공격자 마우스로 세션을 시작합니다. 프라이밍에 사용된 성체 C57BL/6J 수컷 마우스의 부상을 모니터링합니다( 보충 표 6 참조).
3. 동물 복지 및 인도적 종점에 대한 아래 권장 사항을 따르십시오.
   1. 사회적 패배에 대한 해당 기관 검토 위원회의 표준 운영 절차를 따르고 지속적인 수의학적 평가를 보장합니다.
   2. 동물의 고통과 죽음을 피하기 위해 연구 전반에 걸쳐 쥐의 건강을 모니터링하십시오.
   3. 마우스가 다른 구획으로 건너가지 않도록 구멍이 뚫린 칸막이가 올바르게 설정되어 있는지 확인하십시오.
   4. 동물에게 상처가 있을 때 적절한 모니터링을 위해 수의사 직원에게 알리고 상처가 완전히 치유될 때까지 매일 통증 완화 크림을 바르십시오.
   5. 부상이 악화되면(상처 크기가 커지면) 회복을 위해 다음 세션에서 공격을 5회로 제한하십시오. 심각한 부상이 있는지 확인하십시오. 중상은 총 > 1cm의 상처로 정의됩니다.
   6. 초기 체중에서 15%-20% 감소한 동물을 즉시 제거하고 안락사시킵니다. 운동 활동 감소/감소 및 그루밍 장애; 1cm> 상처가있는 마우스; 음경이 절단되거나 앞다리가 부풀어 오른 물린 자국이 있습니다.
      참고: 1차 안락사는 이소플루란/CO2 가스실을 통해 진행되며, 이후 자궁경부 탈구에 의한 2차 안락사가 진행됩니다.
4. 대조군 마우스
   1. 하루 2회(1회: 오전 9시, 2회: 오후 2시) 4일간 총 8회를 진행한다. 대조군 마우스가 매 세션마다 다른 C57BL/6J 동종과 케이지를 공유하도록 일정을 세웁니다( 보충 표 7 및 보충 표 8 참조).
      알림: 대조군 마우스는 공격자에게 노출되지 않습니다. 패배 세션마다 새로운 CD-1 마우스에 대한 소개를 모방하기 위해 대조군 마우스는 매 세션마다 새로운 동성 및 동연령 동종(비리터메이트)과 짝을 이룹니다.
   2. 사회적 패배 장치(그림 1)에 있는 대조군 마우스를 AcSD 마우스와 별도의 방에 보관합니다.
   3. 케이지당 두 개의 대조군 마우스를 케이지의 양쪽에 하나씩 배치합니다. 쥐를 케이지의 다른 쪽이나 완전히 다른 케이지에 넣어 냄새를 인식하지 못하도록 합니다. 각 세션마다 컨트롤 마우스를 회전시킵니다.

그림 1: 청소년 쥐의 가속된 사회적 패배 스트레스(AcSD) 장치. (A) 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대 사이가 0.6cm 떨어져 있는 한 쌍의 강철 와이어 상판, 천공 직경 0.6cm의 투명 천공 폴리카보네이트 칸막이, 철사 상단을 고정하기 위한 바인더 클립, 덮개 뚜껑이 있는 투명 쥐 케이지(면 보호층 없음). (B) 위: 성인의 만성적인 사회적 패배에 대한 폴리카보네이트 칸막이(왼쪽)와 청소년의 AcSD(오른쪽) 비교; 아래로: 청소년 마우스를 위한 폴리카보네이트 칸막이에 닫습니다. (C) 위: 성인의 만성적 사회적 패배에 대한 철사 상의(왼쪽)와 청소년의 AcSD(오른쪽) 비교; 아래: 강철 와이어 상단의 클로즈업. (D-F) 사회적 패배 장치의 조립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 사회적 상호작용 테스트

1. 앞에서 설명한 대로 AcSD 57,58,59에 따라 SIT를 수행합니다.
   1. AcSD의 마지막 세션 후 24시간 동안 SIT를 수행합니다. 오전 9시에서 오후 4시 사이의 빨간색 표시등 조건(노란색 표시등 조건이 아님)에서 SIT를 수행합니다.
   2. 메인 광장과 오버헤드 비디오 카메라를 설정합니다( 자료 표 참조). 메인 경기장은 3 개의 영역으로 나뉩니다 : 사회적 상호 작용 구역 (SIZ), 코너 및 중앙; 이 지역은 경기장에서 검은색 선으로 표시해야 합니다(검은색 영구 마커 사용). 각 영역에 대해 다음 차원과 기준을 사용합니다.
      1. SIZ가 인클로저를 둘러싸고 있는 14cm x 9cm의 제곱 영역인지 확인합니다. 모서리는 인클로저 반대쪽 벽 모서리에 있는 작은 정사각형 영역(9cm x 9cm)이며 SIZ에서 가장 먼 지점을 나타냅니다. 중심은 SIZ와 모서리 사이의 영역입니다.
   3. 세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.
   4. 분석을 위해 각 동물에 대한 식별 태그를 바닥에 놓습니다. 오프라인 분석을 위해 모든 동물의 행동을 기록합니다.
2. 기준선 탐색을 결정하기 위한 첫 번째 세션
   1. 경기장의 벽 중 하나에 빈 철망 인클로저를 놓습니다. 실험용(패배 또는 대조군) 청소년기 C57BL/6 마우스를 경기장 중앙에 놓습니다. 2.5분 동안 투기장을 자유롭게 탐험할 수 있게 하세요. 마우스를 검색합니다.
   2. 세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.
3. 사회적 상호작용을 위한 두 번째 세션
   1. 익숙하지 않은 CD-1 마우스를 철망 인클로저 내부에 넣습니다. 이전 세션과 동일한 위치에 격납장치를 배치합니다.
   2. 같은 청소년용 C57BL/6 마우스를 경기장에 다시 도입합니다. 2.5분 동안 투기장을 자유롭게 탐험할 수 있게 하세요. 마우스를 회수합니다.
   3. 세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.
   4. 모든 청소년 C57BL/6 마우스(스트레스 및 대조 마우스)에 대해 균형 잡힌 순서로 이 과정을 반복합니다.
   5. 핸들링 스트레스와 바이어스를 줄이기 위해 SIT에 두 개 이상의 CD-1 마우스를 사용합니다(예: 30개의 C57BL/6개의 마우스로 구성된 코호트의 경우 4개의 CD-1 마우스 사용). 사춘기 쥐들 사이에서 균형을 잡으십시오.
      참고: 이 테스트는 Krishnan⁵ 및 Golden⁷에 의해 처음 설명된 바와 같이 사회적 목표에 대한 실험용 마우스의 접근 및/또는 회피 행동을 측정합니다.
4. 분석
   1. 테스트의 두 세션 동안 상호 작용 영역과 모서리에서 보낸 시간을 기록합니다.
   2. CD-1 공격자가 있는 상호 작용 영역에서 보낸 시간을 CD-1 공격자가 없는 상호 작용 영역에서 보낸 시간으로 나눈 값으로 사회적 상호 작용 비율을 계산합니다.
   3. 스트레스를 받은 마우스를 1.00 < 감수성으로, 1.00 ≥ 비율로 탄력적인 마우스로 분류합니다.
   4. 첫 번째 세션 동안 경기장을 탐험하지 않는 동물(즉, 지정된 지역에서 0초를 보낸 동물)을 모든 분석에서 제외하여 운동 활동의 차이를 제어합니다.
   5. ≥4 사회적 패배 세션에서 0번의 공격을 받은 모든 동물을 모든 분석에서 제외하여 대표성이 없는 회복력 있는 동물을 방지합니다.
   6. 높은 사회적 상호 작용 비율이 사회적 대상에 대한 실제 관심을 반영하도록 상호 작용 영역 내에서 최소 61초를 보내지 않는 마우스(취약하지 않음)를 제외합니다.
   7. 이상치 상호 작용 비율 점수가 있는 마우스를 제외합니다.

결과

청소년 C57BL/6 수컷 마우스(PND 21)에서 만성 사회적 패배 스트레스 모델을 사용하여 총 4가지 다른 실험을 수행했습니다. 그러나, 이 모델은 초기 사춘기 C57BL/6 마우스에서의 사용에 대한 중요한 제한사항을 제시하였다.

청소년 C57BL/6 마우스에 대한 장비 수정이 필요한 경우
첫 번째 한계는 사회적 패배 장치에 사용 된 장비가 성인 쥐 용으로 설계되었다는 것입니?...

토론

CD-1 마우스에서 일관되고 공격적인 행동
스크리닝 단계에서는 CD-1이 나타내는 모든 행동(쫓기, 장착 동작, 킁킁거리기, 손질하기 또는 무는 행동)을 기록하고 AcSD용 CD-1 마우스를 선택할 때 이러한 기록을 면밀히 따르는 것이 매우 중요합니다. CD-1 마우스가 청소년 마우스를 공격하지 않고 상호 작용하면 프라이밍 중에 청소년 마우스에 대한 공격성이 발생할 가능성이 있습니다. 대?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 adolescent mice	In house breeding		Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 027	Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice	Jackson Labs	Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664	Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 022	Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution	Virox Animal Health	DIN 02537222	Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider	Manufactured by Douglas Hospital, custom order		0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages	Allentown		24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding	Inotiv Envigo	T.6060 iso-BLOX	2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding	Inotiv Envigo	Teklad 7090, 7115	Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops	STAPLES	Item #: 132429, Model #: 24178-CA	51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops		Item #: 132367, Model #: 24172-CA	32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream	Polysporin		Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops			24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure	Johnston industrial plastics		11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena	PEXIGLAS		45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas)
Stopwatch			For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights	Swann	SRDVR-44580V	Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software	Topscan		2.0 Clever Systems Inc.