13与LC-MS相关的C6-葡萄糖标记：次生代谢物合成中植物初级器官的鉴定

摘要

所建立的 ¹³C₆-葡萄糖标记结合液相色谱-高分辨质谱联用方法具有通用性，为今后药用植物合成次生代谢产物的主要器官和途径以及这些次生代谢产物的综合利用奠定了基础。

摘要

本文提出了一种新颖有效的方法，用于认证参与次级代谢产物合成的初级器官。作为巴黎最重要的次生代谢产物Polyphylla var. yunnanensis （Franch.）手。-Mzt.（PPY），巴黎皂苷（PS）具有多种药理活性，PPY的需求量越来越大。本研究建立了叶、根茎和茎-维束 ¹³C₆-葡萄糖摄食和非摄食 4 个处理，以精确证明参与巴黎皂苷 VII （PS VII） 合成的主要器官。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）相结合，快速准确地计算了不同处理下叶片、根茎、根的¹³C/¹²C比值，得到（M+1） ⁻/M⁻、（M+2） ⁻/M−、（M+3） ⁻/M⁻和（M+4） −/M−4 ⁻/M⁻4种比值。结果表明：茎-维束-根茎取食处理和根茎取食处理中¹³C/¹²C的比值显著高于非取食处理。与非摄食处理相比，叶片和茎-维管束摄食处理下叶片中PS VII分子比值（M+2） ⁻/M⁻显著增加。同时，与非摄食处理相比，根茎处理下叶片中PS VII分子比值（M+2）⁻/M⁻差异无统计学意义。此外，4个处理间茎、根和根茎中PS VII分子的比例（M+2）⁻/M⁻无差异。与非饲喂处理相比，叶饲处理下叶片中Paris saponin II（PS II）分子比值（M+2） ⁻/M⁻差异无统计学意义，叶饲处理下叶片中PS II分子比值（M+3） ⁻/M⁻较低。数据证实，合成PS VII的主要器官是叶子。为今后鉴定药用植物中参与合成次生代谢物的主要器官和途径奠定了基础。

引言

植物次生代谢产物的生物合成途径错综复杂且多样化，涉及高度特异性和多样化的积累器官¹。目前，许多药用植物中次生代谢产物的具体合成位点和负责器官尚不明确。这种模糊性对旨在优化药材产量和质量的栽培方法的战略推进和实施构成了重大障碍。

分子生物学、生化和同位素标记技术被广泛用于揭示药用植物中次生代谢物的合成途径和位点 2,3,4,5，^这些方法中的每一种都表现出独特的优势和局限性，例如效率和准确性的差异。例如，分子生物学方法在精确定位生物合成途径中的位点方面提供了高精度，但非常耗时。对于缺乏公开基因组序列的物种来说，它们的实用性进一步受到限制，使得这些技术在此类情况下的可行性降低⁶.相比之下，采用同位素比（如 ³C/¹²C、²H/¹H 和 ¹⁸O/¹⁶O）的同位素标记技术为研究次级代谢物的合成、运输和储存机制提供了一种快速且易于获取的方法 ^7,8

研究方案

1. 实验准备

1. 确保在植物生长过程中，温室相对湿度为75%，昼夜温度为20°C/10°C，光周期为白天12 h和夜间12 h，光照强度为100 μmol·^m-2·^s-1。通过发光二极管 （LED） 灯提供辐照度，在 LED 灯和植物树冠之间保持 30 厘米的距离。
   注：光周期和光照强度是根据云南生长期的日照时数计算的。辐照度通常由量子传感器测量（参见 材料表）。根据药用植物的特性对环境参数进行必要的改变。一旦根据植物的特性和区域阳光分布仔细校准了这些环境条件，就必须在整个实验过程中保持这些设置的一致性。在环境参数初次建立后任意更改环境参数可能会损害实验的完整性和结果的可靠性。
2. 使用水培方法¹⁸ 来确保我们实验的准确性和特异性。确保将洗净的2年生PPY幼苗（收获于云南省文山市（东经104°11′，北纬23°04′）浸入 ¹/₄ 标准浓度的Hoagland营养液中3天以适应。
   1. 按照说明准备Hoagland的营养物质（见 材料表）溶液;将 1.26 g Hoagland 粉和 0.945 g 硝酸钙粉加入 4 L 纯净水中。按照标准手册中的描述制备 ¹³°_C6-葡萄糖（见 物料表

讨论

该协议的成功实施取决于对植物生理特性、组织、器官和次生代谢产物的全面研究。方案中概述的实验设计方法为研究植物次生代谢物的生物合成途径奠定了坚实的基础。该实验的关键因素是（1）确定多年生幼苗的年龄和（2）选择正确的同位素标记-检测时间。药用植物分为多年生植物和一年生植物，每种植物都有不同的次生代谢产物合成和积累模式。本实验旨在通过分析药用植物次生代谢产物?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2