13Marcatura del C6-glucosio associata a LC-MS: identificazione degli organi primari delle piante nella sintesi di metaboliti secondari

Riepilogo

Il metodo sviluppato della marcatura del ¹³C_6-glucosio combinato con la cromatografia liquida e la spettrometria di massa ad alta risoluzione è versatile e pone le basi per studi futuri sugli organi primari e sui percorsi coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, nonché sull'utilizzo completo di questi metaboliti secondari.

Abstract

Questo articolo presenta un metodo nuovo ed efficiente per certificare gli organi primari coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari. Come il più importante metabolita secondario in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche e la PPY è sempre più richiesta. Questo studio ha stabilito quattro trattamenti per certificare con precisione gli organi primari coinvolti nella sintesi delle saponine di Parigi VII (PS VII). Combinando cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), i rapporti ¹³C/¹²C di foglia, rizoma, fusto e radice in diversi trattamenti sono stati calcolati in modo rapido e accurato e sono stati trovati quattro tipi di rapporti di picco ionico isotopico PS (M⁻): (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ e (M+4) ⁻/M⁻. I risultati hanno mostrato che il rapporto di ¹³C/¹²C nei rizomi dei trattamenti di alimentazione staminale-vascolare e rizoma era significativamente più alto di quello del trattamento non alimentare. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nelle foglie è aumentato significativamente durante i trattamenti di alimentazione fogliare e stelo vascolare. Contemporaneamente, rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nelle foglie sottoposte a trattamento con rizoma non ha mostrato differenze significative. Inoltre, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nel fusto, nella radice e nel rizoma non ha mostrato differenze tra i quattro trattamenti. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra la molecola di saponina Paris II (PS II) (M+2) ^-/M⁻ nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare non ha mostrato differenze significative e il rapporto (M+3) ⁻/M⁻ delle molecole di PS II nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare era inferiore. I dati hanno confermato che l'organo primario per la sintesi di PS VII sono le foglie. Getta le basi per la futura identificazione degli organi primari e delle vie coinvolte nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali.

Introduzione

Le vie biosintetiche dei metaboliti secondari nelle piante sono intricate e diversificate e coinvolgono organi di accumulo altamente specifici e diversificati¹. Attualmente, i siti di sintesi specifici e gli organi responsabili dei metaboliti secondari in molte piante medicinali non sono ben definiti. Questa ambiguità pone un ostacolo significativo all'avanzamento strategico e all'attuazione di metodi di coltivazione progettati per ottimizzare sia la resa che la qualità dei materiali medicinali.

La biologia molecolare, la biochimica e le tecniche di marcatura isotopica sono ampiamente impiegate per svelare le vie di sintesi e i siti dei metaboliti secondari nelle piante medicinali 2,3,4,5 e ciascuna di queste metodologie presenta punti di forza e limiti unici, come le differenze di efficienza e precisione. Gli approcci di biologia molecolare, ad esempio, offrono un'elevata precisione nell'individuare i siti all'interno dei percorsi biosintetici, ma richiedono molto tempo. La loro utilità è ulteriormente limitata per le specie prive di sequenze genomiche disponibili pubblicamente, rendendo queste tecniche meno praticabili per tali casi⁶. Al contrario, le tecniche di marcatura isotopica, che impiegano rapporti isotopici come ³C/¹²C, ²H/¹H e ¹⁸O/¹⁶O, forniscono un mezzo rapido e accessibile per studiare la sintesi, il trasporto e i meccanismi di stoccaggio dei metaboliti secondari ^7,8. Possono rivelare la distribuzione spaziale dei composti organici e degli isotopi stabili nelle foglie, consentendo così la ricostruzione delle condizioni ambientali vissute dalle foglie durante il loro ciclo di vita⁹. Inoltre, l'applicazione di marcature isotopiche esterne, come ¹³C_6-Glucosio ¹⁰ e ¹³C 6-Fenilalanina¹¹, consente la generazione di metaboliti secondari marcati con carbonio, migliorando la nostra comprensione della loro produzione e funzione.

Le tecniche tradizionali di marcatura degli isotopi di carbonio incontrano sfide nell'individuare gli organi specifici responsabili della sintesi dei metaboliti secondari a causa della natura altamente specie-specifica delle loro vie biosintetiche e dei meccanismi di trasporto. La cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) è diventata uno strumento analitico fondamentale in questo settore, offrendo un metodo robusto per tracciare gli isotopi esogeni nella sintesi chimica di farmaci e studiare processi in vivo come l'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l'escrezione¹². La sensibilità, la semplicità e l'affidabilità superiori della LC-MS la rendono la scelta ideale per il monitoraggio della produzione di metaboliti secondari nelle piante¹³. Negli ultimi tempi, la LC-MS è diventata sempre più apprezzata per la sua applicazione nelle tecniche di marcatura isotopica esterna, che consente di valutare l'efficienza della marcatura su diversi campioni. Questa metodologia fornisce informazioni critiche sugli organi primari coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, fungendo da prezioso complemento ai metodi biologici per identificare gli organi di sintesi di questi composti^14,15. Di conseguenza, questo approccio non solo facilita il confronto delle efficienze di marcatura tra i vari campioni, ma fa anche luce sugli organi chiave implicati nella generazione di metaboliti secondari delle piante, migliorando così la nostra comprensione della loro biosintesi.

Abbiamo introdotto un nuovo metodo che combina la marcatura degli isotopi di carbonio con il rilevamento LC-MS per identificare gli organi primari responsabili della sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali. La saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche come l'antitumorale, l'immunomodulazione e l'antinfiammatorio¹⁶ e la PPY è sempre più richiesta¹⁷. Pertanto, abbiamo utilizzato piantine di PPY come soggetti di ricerca e abbiamo decifrato che le foglie sono l'organo principale per sintetizzare la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) utilizzando la marcatura ¹³C_6-Glucosio associata al metodo LC-MS. Il nostro approccio includeva quattro diversi trattamenti che prevedevano l'alimentazione di ¹³C_6-glucosio su foglie, rizoma e fasci staminali-vascolari, nonché un controllo di non alimentazione. La scelta del ¹³C_6-glucosio è strategica, in quanto viene rapidamente metabolizzato in acetil coenzima A attraverso la respirazione, che poi facilita la sintesi del PS. Utilizzando l'abbondanza naturale di ¹³C, abbiamo utilizzato un sistema di spettrometro di massa con rapporto isotopico stabile per gascromatografia (GC-IRMS) per valutare i rapporti ¹³C/¹²C in vari organi della pianta e per analizzare i rapporti di picco degli ioni isotopici nelle molecole PS VII e Paris saponine II (PS II) (Figura 1B). La nostra metodologia, che sfrutta ¹³precursori di metaboliti secondari di piante marcati con C e tecniche di spettrometria di massa all'avanguardia, offre un'alternativa più semplice e accurata ai metodi convenzionali di etichettatura degli isotopi di carbonio. Questo nuovo approccio non solo approfondisce la nostra comprensione degli organi coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali, ma getta anche solide basi per future esplorazioni sui percorsi biosintetici di questi composti.

Protocollo

1. Preparazione sperimentale

1. Assicurati che durante la crescita delle piante, l'umidità relativa della serra sia del 75%, le temperature giorno/notte siano di 20 °C/10 °C, il fotoperiodo sia composto da 12 ore di giorno e 12 ore di notte e l'intensità della luce sia di 100 μmol·^m-2·^s-1. Fornire irraggiamento tramite lampade a diodi emettitori di luce (LED), mantenendo una distanza di 30 cm tra la lampada a LED e la chioma della pianta.
   NOTA: Il fotoperiodo e l'intensità della luce sono in base al numero di ore di sole durante il periodo di crescita in Yunnan. L'irraggiamento viene misurato di routine da un sensore quantistico (vedi Tabella dei materiali). Apportare le modifiche necessarie ai parametri ambientali in base alle caratteristiche della pianta medicinale. Una volta che queste condizioni ambientali sono state attentamente calibrate in base alle caratteristiche della pianta e al profilo solare regionale, è fondamentale mantenere la coerenza in questi ambienti per tutta la durata dell'esperimento. Modifiche arbitrarie dei parametri ambientali dopo la loro istituzione iniziale potrebbero compromettere l'integrità dell'esperimento e l'affidabilità dei risultati.
2. Utilizzare un approccio idroponico¹⁸ per garantire l'accuratezza e la specificità del nostro esperimento. Assicurati che le piantine PPY lavate di 2 anni (raccolte a Wenshan, nella provincia dello Yunnan (104°11′E, 23°04′N) siano immerse in una concentrazione standard di ¹/₄ della soluzione nutritiva di Hoagland per 3 giorni per l'adattamento.
   1. Preparare la soluzione nutritiva di Hoagland (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni; aggiungere 1,26 g di polvere di Hoagland e 0,945 g di polvere di nitrato di calcio in 4 L di acqua purificata. Preparare la soluzione ^{di 13}C_6-glucosio (vedi Tabella dei materiali) come descritto nel manuale standard; aggiungere 0,2 g di ^{polvere di 13}C_6-Glucosio in 100 ml di acqua purificata o soluzione nutritiva di Hoagland.
   2. Preparare la bombola idroponica e la pompa di ossigeno (Figura 2; vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Nella configurazione idroponica, l'utilizzo di una soluzione di ¹³C_6-Glucosio per l'etichettatura elude l'influenza dei microrganismi del suolo, garantendo così che la soluzione contribuisca direttamente alla rapida sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali. Per ottimizzare le condizioni per l'assorbimento di ¹³C_6-Glucosio da parte delle piante, è indispensabile regolare la portata della pompa di ossigeno tra 4 e 8 L/min. Questa portata controllata è fondamentale per evitare che le piantine galleggino sulla superficie dell'acqua, il che potrebbe ostacolare in modo significativo la loro capacità di assorbire efficacemente il ¹³C_6-glucosio. Il mantenimento delle piantine immerse alla profondità corretta consente un assorbimento efficiente del composto di marcatura, garantendo così il successo del processo di sintesi dei metaboliti nel sistema idroponico.

2. Operazione dell'esperimento di etichettatura del carbonio

1. Impostare quattro trattamenti e tracciare gli organi e le vie di sintesi di PS VII e PS II in PPY per dimostrare che le foglie sono l'organo principale per la sintesi di PS.
   1. Nel Trattamento 1, la piantina PPY non si nutre; nel Trattamento 2, spruzzare le foglie della piantina PPY con 0,2% ¹³C_6-Glucosio; nel Trattamento 3, nutrire i rizomi della piantina PPY con lo 0,2% ^{di 13}C_6-glucosio; nel Trattamento 3, nutrire la piantina PPY all'incisione dello stelo con il glucosio ^{0,2% 13}C₆ (Figura 2A).
      NOTA: Il trattamento 1 è impostato come gruppo di controllo. Il trattamento 2 è impostato per dimostrare che le foglie possono sintetizzare il PS. I trattamenti 3 e 4 sono impostati per dimostrare che i rizomi possono assorbire ¹³C_6-glucosio.
   2. Nei trattamenti 1 e 2, coltivare le piantine PPY nella normale soluzione nutritiva di Hoagland. Spruzzare 5 ml di soluzione di ^{glucosio 0,2% 13}C₆ una volta al mattino, pomeriggio e sera sulle foglie del Trattamento 2.
   3. Nei trattamenti 3 e 4, coltivare le piantine PPY nella soluzione nutritiva di Hoagland contenente lo 0,2% ^{di 13}C_6-glucosio. Nel Trattamento 4, utilizzare un bisturi (vedi Tabella dei materiali) per tagliare gli steli delle piantine PPY dal centro, ma mantenere attaccati i fasci vascolari.
   4. Lasciare che ogni trattamento sia etichettato per 3 giorni e cambiare la soluzione nutritiva ogni 1,5 giorni. Condurre l'esperimento utilizzando un design a blocchi randomizzato e ripetere ogni trattamento 3 volte.
      NOTA: Quando si spruzzano le foglie, è importante posizionare una carta assorbente dietro le foglie spruzzate. Ciò impedisce alle goccioline d'acqua di cadere nella soluzione nutritiva sottostante, che altrimenti potrebbe influenzare i risultati dell'esperimento. I tagli negli steli non vengono tutti rimossi, ma sono attaccati dei condotti visibili ad occhio nudo.

3. Metodi di campionamento e preparazione

1. Raccogli foglie, steli, rizomi e radici da ogni trattamento separatamente alla fine dell'esperimento di 3 giorni con ¹³C_6-glucosio. Lavare accuratamente gli organi vegetali raccolti per rimuovere le impurità superficiali.
   NOTA: L'assenza di ^{abbondanza di 13}C può essere rilevata dall'analisi LC-MS della soluzione di lavaggio, che dimostra che il lavaggio è pulito¹⁹.
2. Utilizzare un forno elettrico di essiccazione a temperatura costante (vedi Tabella dei materiali) per asciugare gli organi vegetali lavati. Iniziare a 105 °C per 30 minuti e poi impostare a 60 °C fino a peso costante. Ridurre in polvere gli organi vegetali essiccati utilizzando un trituratore rapido per campioni completamente automatico (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: La polvere viene utilizzata per l'analisi quantitativa dei rapporti PS VII, II e ¹³C/¹²C in diversi organi vegetali.
3. Utilizzare una bilancia analitica elettronica (vedere la Tabella dei materiali) per pesare con precisione 30 mg di polvere per ciascun campione e immergerlo in 2 mL di etanolo e acqua al 75% v/v. Utilizzare un pulitore a ultrasuoni CNC (vedi Tabella dei materiali) ed eseguire l'estrazione a ultrasuoni a 25 °C per 20 min (60 kHz), ripetere 2 volte; Unire le soluzioni di estrazione e preparare tre campioni paralleli²⁰.
   NOTA: Gli errori nel peso del campione devono essere ridotti al minimo.
4. Utilizzare l'azoto per asciugare la soluzione di estrazione, quindi scioglierla in metanolo cromatografico fino a un volume di 1 ml. Prima dell'iniezione, utilizzare un filtro in fase organica da 0,22 μm (vedere la Tabella dei materiali) per la filtrazione (Figura 2B).
   NOTA: Non soffiare l'estratto durante l'asciugatura con azoto gassoso; L'estratto deve essere fatto passare attraverso una membrana microporosa per garantire che le impurità interferiscano minimamente.

4. Configurazione e funzionamento LC-MS

1. Impostazione MS
   1. Attivare la pompa del vuoto portando il suo interruttore in posizione on. Aprire la valvola principale sulla bombola del gas argon, quindi regolare la valvola di pressione parziale per ottenere una pressione target di circa 0,3 MPa. Successivamente, assicurarsi che anche la valvola del gas azoto sia aperta.
   2. Avviare il software di controllo MS (vedere la tabella dei materiali). Fare clic sulla sorgente di ionizzazione elettrospray riscaldata (HESI Source) nel pannello del software e inserire i parametri, tra cui la tensione capillare (3,0 kV per la modalità negativa), la temperatura capillare (350 °C), la portata del gas di guaina (N₂) (35 unità arbitrarie), la portata del gas ausiliario (N₂) (15 unità arbitrarie), attraverso la scansione completa basata sulla massa molecolare del PS (operata da m/z 100-1.500). Fare clic sul pulsante Applica per attivare la sorgente ionica.
      NOTA: Attendere almeno 8 ore per garantire un grado di vuoto sufficiente per le condizioni sperimentali. Verificare che la pressione del gas di argon e azoto sia sufficientemente alta prima dell'analisi.
2. LC pre-corsa
   1. Preparare la fase mobile A mescolando acido formico allo 0,1% con acqua e utilizzare acetonitrile per la fase mobile B (vedi Tabella dei materiali). Degassare entrambe le fasi in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni per 15 minuti per eliminare i gas disciolti. Quindi, collegare la fase mobile A al rispettivo passaggio del fluido e fare lo stesso con la fase mobile B. Infine, miscelare una soluzione 1:9 v/v di metanolo e acqua per il fluido di pulizia e riempire manualmente la pompa e i flaconi dell'iniettore.
      NOTA: La frequenza del sonicatore a ultrasuoni è di 40 kHz.
3. Istituzione del metodo LC
   1. Selezionare il pulsante "Impostazione strumento" per accedere alla finestra di modifica del metodo.
   2. Premere il pulsante "Nuovo" per avviare la creazione di un nuovo metodo di strumento LC-MS.
   3. Impostare il tempo di esecuzione totale per il metodo LC. Quindi, inserire i valori necessari per il limite di pressione, la portata totale, il gradiente di flusso, la temperatura del campione, la temperatura della colonna e il delta di temperatura pronto all'interno della finestra di modifica del metodo.
      NOTA: Le impostazioni del metodo dello strumento LC-MS sono personalizzate in base all'analita di interesse e al tipo di colonna per cromatografia liquida utilizzata. Per risultati ottimali, utilizzare una portata di 0,3 mL/min con una colonna BEH C18 mantenuta a 40 °C (vedere la tabella dei materiali). L'eluizione del gradiente è configurata come segue: iniziare dal 10% B, aumentare linearmente al 30% B in 8 minuti, quindi al 45% B da 8 a 16 minuti, al 50% B da 16 a 24 minuti e al 70% B da 24 a 30 minuti. Subito dopo, riportare la pendenza alla condizione iniziale del 10% B entro 0,1 minuti, mantenendola lì per altri 2,9 minuti. Iniettare un volume di campione di 5 μl per ogni analisi. Le impostazioni del metodo dello strumento LC-MS dipendono dalla sostanza specifica da analizzare e dal tipo di colonna per cromatografia liquida utilizzata²¹.
4. Acquisizione MS
   1. Nella scheda Impostazioni scegliere il tipo di esperimento General MS o MSⁿ per la configurazione del metodo MS. Immettere i valori necessari per impostare il tempo di acquisizione, la polarità (positiva o negativa), l'intervallo di massa, il numero della valvola di deviazione e la durata della valvola di deviazione. Dopo aver inserito questi dettagli, fare clic sul pulsante "Salva" per finalizzare e salvare queste impostazioni come metodo dello strumento.
      NOTA: Le impostazioni predefinite senza colonna cromatografica sono le seguenti: tempo di acquisizione, 2 min; polarità, positiva o negativa; intervallo di massa, da 100 a 1.500.
5. Eseguire la spettrometria di massa a più stadi secondo i metodi convenzionali.
   1. Utilizzare sempre la modalità di acquisizione dipendente dai dati (DDA) per la raccolta dei dati nella spettrometria di massa multistadio. In modalità DDA, lo spettrometro di massa identifica i cinque ioni più intensi durante ogni scansione nel primo stadio della MS tandem, che vengono successivamente frammentati ed esaminati nel secondo stadio della spettrometria di massa tandem.
      NOTA: I dati MS e MS/MS raccolti possono essere utilizzati per successive analisi e ricerche nel database.

5. Acquisizione, analisi e calcolo manuale dei dati

1. Acquisizione e analisi dei dati
   1. Fare doppio clic sui file grezzi per aprire tutti gli spettri di massa da MS. Calcolare manualmente i valori di differenza m/z tra lo ione e gli ioni frammento corrispondenti.
   2. Importare i file di dati grezzi del controllo e dei trattamenti dei campioni e i bianchi nel software di analisi della spettrometria di massa per identificare i PS calcolando con precisione la massa e i frammenti di PS.
      NOTA: PS VII e PS II sono identificati in base al confronto con i tempi di ritenzione e la coeluizione di soluzioni standard autentiche. LC-MS rileva una serie di piccoli picchi nelle posizioni dei picchi degli ioni molecolari. Il rapporto di ogni serie di picchi di ioni isotopici è costante. Quando vengono somministrati isotopi esogeni del ¹³C, l'abbondanza totale di ¹³C nella pianta aumenta e i rapporti della serie di picchi di ioni isotopici dei metaboliti secondari della pianta cambiano. La tolleranza massima dell'errore di massa è fissata a 5 ppm.
   3. Scansiona l'intervallo di massa m/z 500-1.500 per identificare il picco di base. Determinare il peso molecolare accurato con 4 cifre decimali, in base al peso molecolare preciso e al tempo di ritenzione della molecola target. Cerca l'area del picco del flusso di ioni isotopici seriali e ricava i valori per M⁻, (M+1) ⁻, (M+2) ⁻, (M+3) ⁻ e (M+4) ⁻. Quando la fase mobile contiene acido formico, gli ioni negativi includono anche (M+COOH) ⁻, (M+COOH+1) ⁻, (M+COOH+2) ⁻, (M+COOH+3) ⁻ e (M+COOH+4) ⁻.
      NOTA: La selezione di picchi all'interno dell'intervallo di massa m/z 500-1.500 migliora l'accuratezza dell'identificazione dei picchi di ioni molecolari per PS VII e PS II. Ad esempio, lo spettro di massa degli ioni negativi di PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) ionizza principalmente con ioni COOH⁻ in una miscela di acido formico-acqua. Gli ioni isotopi seriali osservati includono 1029.53⁻, 1030.54⁻, 1031.54⁻, 1032.55⁻, 1033.55⁻, e si estendono fino a 1079.56−.
2. Calcolo dei dati
   1. Per ridurre l'effetto dell'abbondanza naturale di ¹³C, calcolare i rapporti tra correnti ioniche marcate e non marcate per ciascun organo sottoposto a diversi trattamenti, concentrandosi in particolare sui rapporti (M+1)^-/ M^-, (M+2)^-/M^-, (M+3)^{-/ M-e} (M+4)^/M^-. Per differenziare tra isotopi marcati e naturali per una valutazione accurata dell'incorporazione di ¹³C, calcolare questi rapporti per n = 1, 2, 3, 4 utilizzando l'equazione (1).
      Rapporto = A (M+2) ⁻/ ^AM− (1)
      PS: (M+2) ⁻ include (M+2+COOH) ⁻ e (M+2) ⁻; M⁻ include (M+COOH) ^- e M⁻.
      NOTA: Qui, M⁻ si riferisce alle aree di picco combinate delle correnti ioniche per (M+COOH) ⁻ e M ⁻, principalmente ionizzate con ^COOH− in acido formico-acqua. A rappresenta l'area di picco. Ad esempio, le formule per calcolare i rapporti PS VII sono illustrate come segue:
      Rapporto+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapporto+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapporto+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapporto+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Risultati

Per confermare che l'apporto di ¹³C_6-glucosio nei rizomi ha avuto successo, abbiamo ulteriormente analizzato i rapporti isotopici ¹³C/¹²C nei rizomi. I rapporti isotopici ¹³C/¹²C dei trattamenti 3 e 4 erano molto più alti di quelli del trattamento 2 (Figura 1A). I risultati hanno indicato che ¹³C_6-glucosio dei trattamenti 3 e 4 sono entrati nei rizomi attraverso l'ingestione.

...

Discussione

Il successo dell'implementazione di questo protocollo si basa su una ricerca completa sulle proprietà fisiologiche delle piante, sui tessuti, sugli organi e sui metaboliti secondari. L'approccio di progettazione sperimentale delineato nel protocollo getta solide basi per lo studio delle vie biosintetiche dei metaboliti secondari delle piante. I fattori critici in questo esperimento sono (1) determinare l'età delle piantine perenni e (2) scegliere il corretto momento di marcatura-rilevamento degli isotopi. Le piante med...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2