13Marcatura del C6-glucosio associata a LC-MS: identificazione degli organi primari delle piante nella sintesi di metaboliti secondari

Riepilogo

Il metodo sviluppato della marcatura del ¹³C_6-glucosio combinato con la cromatografia liquida e la spettrometria di massa ad alta risoluzione è versatile e pone le basi per studi futuri sugli organi primari e sui percorsi coinvolti nella sintesi di metaboliti secondari nelle piante medicinali, nonché sull'utilizzo completo di questi metaboliti secondari.

Abstract

Questo articolo presenta un metodo nuovo ed efficiente per certificare gli organi primari coinvolti nella sintesi dei metaboliti secondari. Come il più importante metabolita secondario in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina di Parigi (PS) ha una varietà di attività farmacologiche e la PPY è sempre più richiesta. Questo studio ha stabilito quattro trattamenti per certificare con precisione gli organi primari coinvolti nella sintesi delle saponine di Parigi VII (PS VII). Combinando cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), i rapporti ¹³C/¹²C di foglia, rizoma, fusto e radice in diversi trattamenti sono stati calcolati in modo rapido e accurato e sono stati trovati quattro tipi di rapporti di picco ionico isotopico PS (M⁻): (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ e (M+4) ⁻/M⁻. I risultati hanno mostrato che il rapporto di ¹³C/¹²C nei rizomi dei trattamenti di alimentazione staminale-vascolare e rizoma era significativamente più alto di quello del trattamento non alimentare. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nelle foglie è aumentato significativamente durante i trattamenti di alimentazione fogliare e stelo vascolare. Contemporaneamente, rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nelle foglie sottoposte a trattamento con rizoma non ha mostrato differenze significative. Inoltre, il rapporto tra le molecole di PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nel fusto, nella radice e nel rizoma non ha mostrato differenze tra i quattro trattamenti. Rispetto al trattamento senza alimentazione, il rapporto tra la molecola di saponina Paris II (PS II) (M+2) ^-/M⁻ nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare non ha mostrato differenze significative e il rapporto (M+3) ⁻/M⁻ delle molecole di PS II nelle foglie sottoposte a trattamento di alimentazione fogliare era inferiore. I dati hanno confermato che l'organo primario per la sintesi di PS VII sono le foglie. Getta le basi per la futura identificazione degli organi primari e delle vie coinvolte nella sintesi dei metaboliti secondari nelle piante medicinali.

Introduzione

Le vie biosintetiche dei metaboliti secondari nelle piante sono intricate e diversificate e coinvolgono organi di accumulo altamente specifici e diversificati¹. Attualmente, i siti di sintesi specifici e gli organi responsabili dei metaboliti secondari in molte piante medicinali non sono ben definiti. Questa ambiguità pone un ostacolo significativo all'avanzamento strategico e all'attuazione di metodi di coltivazione progettati per ottimizzare sia la resa che la qualità dei materiali medicinali.

La biologia molecolare, la biochimica e le tecniche di marcatura isotopica sono ampiamente impiegate per svelare le vie di ....

Protocollo

1. Preparazione sperimentale

1. Assicurati che durante la crescita delle piante, l'umidità relativa della serra sia del 75%, le temperature giorno/notte siano di 20 °C/10 °C, il fotoperiodo sia composto da 12 ore di giorno e 12 ore di notte e l'intensità della luce sia di 100 μmol·^m-2·^s-1. Fornire irraggiamento tramite lampade a diodi emettitori di luce (LED), mantenendo una distanza di 30 cm tra la lampada a LED e la chioma della pianta.
   NOTA: Il fotoperiodo e l'intensità della luce sono in base al numero di ore di sole durante il periodo di crescita in Yunnan. L'irraggiamento viene misurato di routine da un sensore qu....

Discussione

Il successo dell'implementazione di questo protocollo si basa su una ricerca completa sulle proprietà fisiologiche delle piante, sui tessuti, sugli organi e sui metaboliti secondari. L'approccio di progettazione sperimentale delineato nel protocollo getta solide basi per lo studio delle vie biosintetiche dei metaboliti secondari delle piante. I fattori critici in questo esperimento sono (1) determinare l'età delle piantine perenni e (2) scegliere il corretto momento di marcatura-rilevamento degli isotopi. Le piante med.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2