13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması

Özet

Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş ¹³C_6-Glikoz etiketleme yöntemi çok yönlüdür ve tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar ve yollar ile bu ikincil metabolitlerin kapsamlı kullanımı hakkında gelecekteki çalışmaların temelini oluşturur.

Özet

Bu makale, ikincil metabolit sentezinde yer alan birincil organları sertifikalandırmak için yeni ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Paris'teki en önemli ikincil metabolit olarakpolyphylla var. yunnanensis (Franch.) El. (PPY), Paris saponin (PS) çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir. Bu çalışma, Paris saponinleri VII (PS VII) sentezinde yer alan birincil organları kesin olarak sertifikalandırmak için yaprak, rizom ve kök-vasküler-demet ¹³C_6-Glikoz besleme ve besleme dışı dört tedavi oluşturmuştur. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) birleştirilerek, farklı tedavilerde yaprak, rizom, gövde ve kökün ¹³C/¹²C oranları hızlı ve doğru bir şekilde hesaplandı ve dört tip PS izotopik iyon tepe noktası (M^-) oranı bulundu: (M+1) ^-/M^-, (M+2) ^-/M^-, (M+3) ^-/M⁻ ve (M+4) ^-/M⁻. Sonuçlar, kök-vasküler-demet ve rizom besleme tedavilerinin rizomlarındaki ¹³C/¹²C oranının, besleme dışı tedaviye göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Yemsiz tedavi ile karşılaştırıldığında, yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M+2) ⁻/M⁻ oranı, yaprak ve gövde-vasküler-demet besleme uygulamaları altında önemli ölçüde artmıştır. Aynı zamanda, beslemesiz tedavi ile karşılaştırıldığında, köksap tedavisi altındaki yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M + 2) ^{- /} M ^- oranı önemli bir fark göstermedi. Ayrıca, gövde, kök ve köksaptaki PS VII moleküllerinin (M+2) ⁻/M⁻ oranı dört tedavi arasında fark göstermedi. Yemsiz muamele ile karşılaştırıldığında, yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda Paris saponin II (PS II) molekülünün (M+2) ⁻/M⁻ oranı önemli bir fark göstermedi ve yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+3) ^-/M^- oranı daha düşüktü. Veriler, PS VII'nin sentezlenmesi için birincil organın yapraklar olduğunu doğruladı. Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organların ve yolların gelecekte tanımlanması için temel oluşturur.

Giriş

Bitkilerdeki ikincil metabolitlerin biyosentetik yolları, oldukça spesifik ve çeşitli birikim organlarını içeren karmaşık ve çeşitlidir¹. Şu anda, birçok tıbbi bitkide ikincil metabolitler için spesifik sentez bölgeleri ve sorumlu organlar iyi tanımlanmamıştır. Bu belirsizlik, tıbbi materyallerin hem verimini hem de kalitesini optimize etmek için tasarlanmış yetiştirme yöntemlerinin stratejik ilerlemesi ve uygulanmasının önünde önemli bir engel teşkil etmektedir.

Moleküler biyoloji, biyokimyasal ve izotop etiketleme teknikleri, tıbbi bitkilerde ^2,3,4,5 ikincil metabolitlerin sentez yollarını ve bölgelerini çözmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu metodolojilerin her biri, verimlilik ve doğruluktaki farklılıklar gibi benzersiz güçlü yönler ve sınırlamalar sergiler. Örneğin moleküler biyoloji yaklaşımları, biyosentetik yollar içindeki bölgeleri tam olarak belirlemede yüksek hassasiyet sunar, ancak özellikle zaman yoğundur. Faydaları, halka açık genomik dizilerden yoksun türler için daha da kısıtlanır ve bu teknikleri bu tür durumlar için daha az uygulanabilir hale getirir⁶. Buna karşılık, ³C / ¹²C, ²H / ¹H ve ¹⁸O / ¹⁶O gibi izotopik oranları kullanan izotop etiketleme teknikleri, ikincil metabolitlerin^sentezi, taşınması ve depolanması mekanizmalarını araştırmak için hızlı ve erişilebilir bir yol sağlar ^7,8. Yapraklardaki organik bileşiklerin ve kararlı izotopların mekansal dağılımını ortaya çıkarabilirler, böylece yaprakların yaşam döngüleri boyunca deneyimledikleri çevresel koşulların yeniden yapılandırılmasına izin verirler⁹. Ayrıca, ¹³C_6-Glikoz ¹⁰ ve ¹³C 6-Fenilalanin¹¹ gibi harici izotopik etiketlerin uygulanması, karbon etiketli ikincil metabolitlerin üretilmesini sağlayarak bunların üretimi ve işlevi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Geleneksel karbon izotop etiketleme teknikleri, biyosentetik yollarının ve taşıma mekanizmalarının son derece türe özgü doğası nedeniyle ikincil metabolitlerin sentezinden sorumlu spesifik organların belirlenmesinde zorluklarla karşılaşmaktadır. Sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS), ilaçların kimyasal sentezinde eksojen izotopların izlenmesi ve absorpsiyon, dağıtım, metabolizma ve atılım gibi in vivo süreçlerin araştırılması için sağlam bir yöntem sunarak bu alanda çok önemli bir analitik araç olarak öne çıkmıştır¹². LC-MS'nin üstün hassasiyeti, basitliği ve güvenilirliği, onu bitkilerde ikincil metabolitlerin üretimini izlemek için ideal bir seçim haline getirir¹³. Son zamanlarda, LC-MS, farklı numuneler arasında etiketleme verimliliğinin değerlendirilmesini sağlayan harici izotop etiketleme tekniklerindeki uygulaması için giderek daha fazla tercih edilmeye başlanmıştır. Bu metodoloji, tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar hakkında kritik bilgiler sağlar ve bu bileşiklerin sentez organlarını tanımlamak için biyolojik yöntemlere paha biçilmez bir tamamlayıcı olarak hizmet eder^14,15. Sonuç olarak, bu yaklaşım sadece çeşitli örnekler arasında etiketleme verimliliklerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda bitki ikincil metabolitlerinin oluşumunda rol oynayan kilit organlara ışık tutar ve böylece biyosentezleri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezlenmesinden sorumlu birincil organları tanımlamak için karbon izotop etiketlemesini LC-MS tespiti ile birleştiren yeni bir yöntem tanıttık. Paris saponin (PS), antikanser, immünomodülasyon ve anti-inflamasyon¹⁶ gibi çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir¹⁷. Bu nedenle, PPY fidelerini araştırma deneği olarak kullandık ve LC-MS yöntemi ile ilişkili ¹³C 6-Glukoz etiketlemesini kullanarak Paris saponin VII (PS VII) (Şekil 1B) sentezlemek için birincil organın yapraklar olduğunu deşifre ettik. Yaklaşımımız, yaprak, rizom ve kök-vasküler demetlere ¹³C_6-Glikoz beslemesinin yanı sıra beslemeyen bir kontrolü içeren dört farklı tedaviyi içeriyordu. ¹³C_6-Glikoz seçimi stratejiktir, çünkü solunum yoluyla hızlı bir şekilde asetil koenzim A'ya metabolize edilir ve bu da daha sonra PS sentezini kolaylaştırır. ¹³° C'nin doğal bolluğunu kullanarak, çeşitli bitki organlarındaki ¹³C / ¹²C oranlarını değerlendirmek ve PS VII ve Paris saponins II (PS II) (Şekil 1B) moleküllerindeki izotopik iyon tepe oranlarını analiz etmek için bir Gaz Kromatografisi Kararlı İzotop Oranı Kütle Spektrometresi (GC-IRMS) sistemi kullandık. ¹³C etiketli bitki ikincil metabolit öncüsünden ve en son kütle spektrometresi tekniklerinden yararlanan metodolojimiz, geleneksel karbon izotop etiketleme yöntemlerine daha basit ve daha doğru bir alternatif sunar. Bu yeni yaklaşım, yalnızca tıbbi bitkilerde ikincil metabolit sentezinde yer alan organlar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda bu bileşiklerin biyosentetik yollarına yönelik gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel oluşturur.

Protokol

1. Deneysel hazırlık

1. Bitki büyümesi sırasında seranın bağıl neminin %75, gündüz/gece sıcaklıklarının 20 °C/10 °C olduğundan, fotoperiyodun 12 saat gündüz ve 12 saat geceden oluştuğundan ve ışık yoğunluğunun 100 μmol·^m-2·^s-1 olduğundan emin olun. LED lamba ile bitki kanopisi arasında 30 cm'lik bir mesafe bırakarak ışık yayan diyot (LED) lambalar aracılığıyla ışınım sağlayın.
   NOT: Fotoperiyot ve ışık yoğunluğu, Yunnan'daki büyüme döneminde güneşlenme saatlerinin sayısına göredir. Işınım rutin olarak bir kuantum sensörü tarafından ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu). Tıbbi bitkinin özelliklerine göre çevresel parametrelerde gerekli değişiklikleri yapar. Bu çevresel koşullar, bitkinin özelliklerine ve bölgesel güneş ışığı profiline göre dikkatli bir şekilde kalibre edildikten sonra, deney süresi boyunca bu ortamlarda tutarlılığı korumak çok önemlidir. İlk kurulduktan sonra çevresel parametrelerde keyfi olarak yapılan değişiklikler, deneyin bütünlüğünü ve sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir.
2. Deneyimizin doğruluğunu ve özgüllüğünü sağlamak için hidroponik bir yaklaşım¹⁸ kullanın. Yıkanmış 2 yaşındaki PPY fidelerinin (Wenshan, Yunnan Eyaletinden (104 ° 11 "E, 23 ° 04" K) hasat edilmiş) uyum sağlamak için 3 gün boyunca ¹/₄ standart Hoagland besin çözeltisine daldırıldığından emin olun.
   1. Hoagland'ın besin ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini talimatlara göre hazırlayın; 4 L arıtılmış suya 1.26 g Hoagland tozu ve 0.945 g Kalsiyum nitrat tozu ekleyin. ¹³C_6-Glikoz ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini standart kılavuzda açıklandığı gibi hazırlayın; 100 mL arıtılmış suya veya Hoagland'ın besin çözeltisine 0.2 g ¹³C_6-Glikoz tozu ekleyin.
   2. Hidroponik tankı ve oksijen pompasını hazırlayın (Şekil 2; Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Hidroponik kurulumda, etiketleme için ¹³C_6-Glikoz çözeltisinin kullanılması, toprak mikroorganizmalarının etkisini ortadan kaldırır, böylece çözeltinin tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin hızlı sentezine doğrudan katkıda bulunmasını sağlar. ¹³C 6-Glikozun bitkiler tarafından emilim koşullarını optimize etmek için, oksijen pompasının akış hızının 4 ila 8 L / dak arasında düzenlenmesi zorunludur. Bu kontrollü akış hızı, fidelerin su yüzeyinin üzerinde yüzmesini önlemek için çok önemlidir, bu da ¹³C 6-Glikozu etkili bir şekilde emme yeteneklerini önemli ölçüde engelleyebilir. Fidelerin doğru derinliğe batırılmış halde tutulması, etiketleme bileşiğinin verimli bir şekilde alınmasına izin verir, böylece hidroponik sistemdeki metabolit sentez işleminin başarısını sağlar.

2. Karbon etiketleme deneyi işlemi

1. Yaprakların PS sentezlemek için birincil organ olduğunu göstermek için dört tedavi oluşturun ve PPY'de PS VII ve PS II'nin sentez organlarını ve yollarını izleyin.
   1. Tedavi 1'de, PPY fidesi beslenmez; Tedavi 2'de, PPY fide yapraklarına% 0.2 ^{13 C}_6-Glikoz püskürtün; Tedavi 3'te, PPY fide rizomlarını %0.2 ^{13 C}_6-Glikoz ile besleyin; Tedavi 3'te, PPY fidesini gövde insizyonunda %0.2 ^{13 C}_6-Glikoz ile besleyin (Şekil 2A).
      NOT: Tedavi 1 kontrol grubu olarak ayarlanmıştır. Tedavi 2, yaprakların PS'yi sentezleyebildiğini göstermek için ayarlanmıştır. Tedavi 3 ve 4, rizomların ¹³C_6-Glikoz alabileceğini göstermek için ayarlanmıştır.
   2. Tedavi 1 ve 2'de, PPY fidelerini normal Hoagland'ın besin çözeltisinde kültürleyin. Tedavi 2'nin yapraklarına sabah, öğleden sonra ve akşam bir kez 5 mL% 0.2 ¹³C_6-Glikoz çözeltisi püskürtün.
   3. Tedavi 3 ve 4'te, PPY fidelerini Hoagland'ın %0.2 ^{13 C}_6-Glikoz içeren besin çözeltisinde kültürleyin. Tedavi 4'te, PPY fidelerinin saplarını ortadan kesmek için bir neşter kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak damar demetlerini bağlı tutun.
   4. Her tedavinin 3 gün boyunca etiketlenmesine izin verin ve besin çözeltisini her 1,5 günde bir değiştirin. Deneyi randomize bir blok tasarımı kullanarak yapın ve her tedaviyi 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Yaprakları püskürtürken, püskürtülen yaprakların arkasına emici bir kağıt yerleştirmek önemlidir. Bu, su damlacıklarının aşağıdaki besin çözeltisine düşmesini önler, aksi takdirde deneyin sonuçlarını etkileyebilir. Saplardaki kesiklerin tümü çıkarılmaz, ancak çıplak gözle görülebilen kanallar takılıdır.

3. Numune alma ve hazırlama yöntemleri

1. 3 günlük ¹³C_6-Glikoz deneyinin sonunda her tedaviden yaprakları, gövdeleri, rizomları ve kökleri ayrı ayrı toplayın. Yüzey kirliliklerini gidermek için toplanan bitki organlarını iyice yıkayın.
   NOT: ¹³°C bolluğunun yokluğu, yıkamanın temiz olduğunu kanıtlayan yıkama solüsyonunun LC-MS analizi ile bulunabilir¹⁹.
2. Yıkanmış bitki organlarını kurutmak için elektrikli sabit sıcaklıkta bir yüksek kurutma fırını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. 30 dakika boyunca 105 ° C'de başlayın ve ardından sabit ağırlığa kadar 60 ° C'ye ayarlayın. Kurutulmuş bitki organlarını tam otomatik bir numune hızlı öğütücü kullanarak toz haline getirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Toz, farklı bitki organlarında PS VII, II ve ¹³C / ¹²C oranlarının kantitatif analizi için kullanılır.
3. Her numune için 30 mg tozu doğru bir şekilde tartmak için bir elektronik analitik terazi kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 2 mL %75 v/v etanol-suya yerleştirin. Bir CNC ultrasonik temizleyici kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 25 ° C'de 20 dakika (60 kHz) ultrasonik ekstraksiyon yapın, 2 kez tekrarlayın; Ekstraksiyon çözeltilerini birleştirin ve üç paralel numune hazırlayın²⁰.
   NOT: Numune ağırlığındaki hatalar en aza indirilmelidir.
4. Ekstraksiyon çözeltisini kurutmak için nitrojen kullanın, ardından kromatografik metanol içinde 1 mL'lik bir hacme kadar çözün. Enjeksiyondan önce, filtrasyon için 0.22 μm'lik bir organik faz filtresi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın (Şekil 2B).
   NOT: Nitrojen gazı ile fön çekerken ekstraktı üflemeyin; Ekstrakt, safsızlıkların minimum düzeyde karışmasını sağlamak için mikro gözenekli bir zardan geçirilmelidir.

4. LC-MS kurulumu ve çalışması

1. MS ayarı
   1. Anahtarını açık konuma çevirerek vakum pompasını etkinleştirin. Argon gazı silindirindeki ana valfi açın, ardından yaklaşık 0,3 MPa'lık bir hedef basınç elde etmek için kısmi basınç valfini ayarlayın. Bunu takiben, nitrojen gazı vanasının da açık olduğundan emin olun.
   2. MS kontrol yazılımını başlatın (Malzeme Tablosuna bakın). Yazılım panelindeki ısıtılmış elektrosprey iyonizasyon kaynağına (HESI Kaynağı) tıklayın ve kılcal voltaj (negatif mod için 3.0 kV), kılcal sıcaklık (350 °C), kılıf gazı (N₂) akış hızı (35 keyfi birim), yardımcı gaz (N₂) akış hızı (15 isteğe bağlı birim) dahil olmak üzere parametreleri girin), PS'nin moleküler kütlesine dayalı tam tarama yoluyla (m/z 100-1.500 arasında çalıştırılır). İyon kaynağını etkinleştirmek için Uygula düğmesine tıklayın.
      NOT: Deney koşulları için yeterli vakum derecesini sağlamak için en az 8 saat bekleyin. Analizden önce argon ve nitrojenin gaz basıncının yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin.
2. LC ön çalıştırma
   1. % 0.1 formik asidi su ile karıştırarak mobil faz A'yı hazırlayın ve mobil faz B için asetonitril kullanın (bkz . Malzeme Tablosu). Çözünmüş gazları ortadan kaldırmak için her iki fazı da bir ultrason banyosu sonikatöründe 15 dakika boyunca gazdan arındırın. Ardından, mobil faz A'yı ilgili sıvı geçişine bağlayın ve aynısını mobil faz B için de yapın. Son olarak, temizleme sıvısı için 1:9 v/v metanol-su solüsyonunu karıştırın ve pompa ve enjektör şişelerini manuel olarak doldurun.
      NOT: Ultrason banyosu sonikatörünün frekansı 40 kHz'dir.
3. LC metodunun kurulması
   1. Metot düzenleme penceresine erişmek için "Instrument Setup" (Enstrüman Kurulumu) düğmesini seçin.
   2. Yeni bir LC-MS cihaz yönteminin oluşturulmasını başlatmak için "Yeni" düğmesine basın.
   3. LC yöntemi için toplam çalışma süresini ayarlayın. Ardından, metot düzenleme penceresine basınç sınırı, toplam akış hızı, akış gradyanı, numune sıcaklığı, kolon sıcaklığı ve hazır sıcaklık deltası için gerekli değerleri girin.
      NOT: LC-MS cihaz yöntemi ayarları, ilgilenilen analite ve kullanılan sıvı kromatografi kolonunun tipine göre uyarlanmıştır. En iyi sonuçlar için, 40 ° C'de tutulan bir BEH C18 sütunu ile 0,3 mL / dak'lık bir akış hızı kullanın (bkz. Gradyan elüsyonu şu şekilde yapılandırılır: %10 B'den başlayın, 8 dakika boyunca doğrusal olarak %30 B'ye, ardından 8 ila 16 dakika arasında %45 B'ye, 16 ila 24 dakika arasında %50 B'ye ve 24 ila 30 dakika arasında %70 B'ye yükselin. Bunun hemen ardından, gradyanı 0,1 dakika içinde başlangıçtaki %10 B durumuna geri döndürün ve 2,9 dakika daha orada tutun. Her analiz için 5 μL'lik bir numune hacmi enjekte edin. LC-MS cihaz yöntemi ayarları, analiz edilecek spesifik maddeye ve kullanılan sıvı kromatografi kolonunun tipine^{bağlıdır 21}.
4. MS satın alma
   1. Ayarlar sekmesinde, MS yöntemi yapılandırması için Genel MS veya MSⁿ deney türünü seçin. Alım süresini, polariteyi (pozitif veya negatif), kütle aralığını yönlendirme valf numarasını ve yön değiştirme valf süresini ayarlamak için gerekli değerleri girin. Bu bilgileri girdikten sonra, bu ayarları bir enstrüman metodu olarak sonlandırmak ve kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
      NOT: Kromatografi sütunu olmayan varsayılan ayarlar aşağıdaki gibidir: edinme süresi, 2 dakika; polarite, pozitif veya negatif; kütle aralığı, 100 ila 1.500.
5. Konvansiyonel yöntemlere göre çok aşamalı kütle spektrometresi gerçekleştirin.
   1. Çok aşamalı kütle spektrometrisinde veri toplama için her zaman veriye bağlı toplama (DDA) modunu kullanın. DDA modunda, kütle spektrometresi, tandem MS'in ilk aşamasında her tarama sırasında en yoğun beş iyonu tanımlar ve bunlar daha sonra parçalanır ve tandem kütle spektrometrisinin ikinci aşamasında incelenir.
      NOT: Toplanan MS ve MS/MS verileri, daha sonraki analizler ve veritabanı aramaları için kullanılabilir.

5. Manuel veri toplama, analiz ve hesaplama

1. Veri toplama ve analizi
   1. MS'den tüm kütle spektrumlarını açmak için ham dosyalara çift tıklayın. İyon ve karşılık gelen parça iyonları arasındaki m/z fark değerlerini manuel olarak hesaplayın.
   2. PS'nin kütlesini ve parçalarını doğru bir şekilde hesaplayarak PS'leri tanımlamak için kontrol ve numune işlemlerinin ve işlenmemiş parçaların ham veri dosyalarını kütle spektrometresi analiz yazılımına aktarın.
      NOT: PS VII ve PS II, orijinal standart çözümlerin saklama süreleri ve koelüsyonu ile karşılaştırılarak tanımlanır. LC-MS, moleküler iyon tepe noktalarının konumlarında bir dizi küçük tepe noktası tespit eder. Her bir izotopik iyon tepe noktası serisinin oranı sabittir. Ekzojen ¹³C izotopları verildiğinde, bitkideki toplam ¹³C bolluğu artar ve bitki ikincil metabolitlerinin izotop iyon pikleri serisinin oranları değişir. Kütle hatasının maksimum toleransı 5 ppm olarak ayarlanmıştır.
   3. Temel tepe noktasını belirlemek için m/z 500-1,500 kütle aralığını tarayın. Hedef molekülün kesin moleküler ağırlığına ve alıkonma süresine göre doğru moleküler ağırlığı 4 ondalık basamağa kadar belirleyin. Seri izotop iyon akışının tepe alanını arayın ve M⁻, (M+1) ⁻, (M+2) ⁻, (M+3) ⁻ ve (M+4) ⁻ için değerler türetin. Mobil faz formik asit içerdiğinde, negatif iyonlar ayrıca şunları içerir: (M+COOH) ^-, (M+COOH+1) ^-, (M+COOH+2) ^-, (M+COOH+3) ^- ve (M+COOH+4) ^-.
      NOT: m/z 500-1,500 kütle aralığındaki piklerin seçilmesi, PS VII ve PS II için moleküler iyon piklerinin tanımlanmasının doğruluğunu artırır. Örneğin, PS VII'nin negatif iyon kütle spektrumu (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) esas olarak formik asit-su karışımındaki COOH^- iyonları ile iyonlaşır. Gözlenen seri izotop iyonları arasında 1029.53⁻, 1030.54⁻, 1031.54⁻, 1032.55⁻, 1033.55⁻ bulunur ve 1079.56−'ye kadar uzanır.
2. Veri hesaplama
   1. ¹³° C'nin doğal bolluğunun etkisini azaltmak için, farklı tedaviler altında her organ için etiketli ve etiketsiz iyon akımlarının oranlarını hesaplayın, özellikle (M + 1) ^{- /} M ^- (M + 2) ^{- /} M ^- (M + 3) ^{- /} M ^- ve (M + 4) ^- / M ^{... 13}C katılımının doğru bir değerlendirmesi için etiketli ve doğal olarak oluşan izotoplar arasında ayrım yapmak için, denklem (1) kullanarak n = 2, 3, 4 için bu oranları hesaplayın.
      Oran = A (M+2) ^-&��/⁻ (1)
      Not: (M+2) ^- (M+2+COOH) ^- ve (M+2) ^-; M⁻ (M+COOH) ^- ve M⁻ içerir.
      NOT: Burada, M^- , (M+COOH) ^- ve M ^- için iyon akımlarının birleşik tepe alanlarını ifade eder, esas olarak formik asit-suda ^COOH- ile iyonize edilir. A , tepe alanını temsil eder. Örneğin, PS VII oranlarını hesaplamak için kullanılan formüller aşağıdaki gibi gösterilmiştir:
      Oran+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Sonuçlar

Rizomlarda ¹³C_6-Glikoz tedarikinin başarılı olduğunu doğrulamak için, rizomlardaki ¹³C / ¹²C izotop oranlarını daha fazla analiz ettik. Tedavi 3 ve 4'ün ¹³C / ¹²C izotop oranları, Tedavi 2'ninkinden çok daha yüksekti (Şekil 1A). Sonuçlar, Tedavi 3 ve 4'ten ¹³C_6-Glikozun yutma yoluyla rizomlara girdiğini gösterdi.

(M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ^...

Tartışmalar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, bitki fizyolojik özellikleri, dokuları, organları ve ikincil metabolitleri ile ilgili kapsamlı araştırmalara bağlıdır. Protokolde özetlenen deneysel tasarım yaklaşımı, bitki ikincil metabolitlerinin biyosentetik yolaklarını araştırmak için sağlam bir temel oluşturmaktadır. Bu deneydeki kritik faktörler (1) çok yıllık fidelerin yaşının belirlenmesi ve (2) doğru izotop etiketleme-tespit zamanlamasının seçilmesidir. Tıbbi bitkiler, her b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2