13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması

Özet

Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş ¹³C_6-Glikoz etiketleme yöntemi çok yönlüdür ve tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar ve yollar ile bu ikincil metabolitlerin kapsamlı kullanımı hakkında gelecekteki çalışmaların temelini oluşturur.

Özet

Bu makale, ikincil metabolit sentezinde yer alan birincil organları sertifikalandırmak için yeni ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Paris'teki en önemli ikincil metabolit olarakpolyphylla var. yunnanensis (Franch.) El. (PPY), Paris saponin (PS) çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir. Bu çalışma, Paris saponinleri VII (PS VII) sentezinde yer alan birincil organları kesin olarak sertifikalandırmak için yaprak, rizom ve kök-vasküler-demet ¹³C_6-Glikoz besleme ve besleme dışı dört tedavi oluşturmuştur. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) birleştirilerek, farklı tedavilerde yaprak, rizom, gövde ve kökün ¹³C/¹²C oranları hızlı ve doğru bir şekilde hesaplandı ve dört tip PS izotopik iyon tepe noktası (M^-) oranı bulundu: (M+1) ^-/M^-, (M+2) ^-/M^-, (M+3) ^-/M⁻ ve (M+4) ^-/M⁻. Sonuçlar, kök-vasküler-demet ve rizom besleme tedavilerinin rizomlarındaki ¹³C/¹²C oranının, besleme dışı tedaviye göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Yemsiz tedavi ile karşılaştırıldığında, yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M+2) ⁻/M⁻ oranı, yaprak ve gövde-vasküler-demet besleme uygulamaları altında önemli ölçüde artmıştır. Aynı zamanda, beslemesiz tedavi ile karşılaştırıldığında, köksap tedavisi altındaki yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M + 2) ^{- /} M ^- oranı önemli bir fark göstermedi. Ayrıca, gövde, kök ve köksaptaki PS VII moleküllerinin (M+2) ⁻/M⁻ oranı dört tedavi arasında fark göstermedi. Yemsiz muamele ile karşılaştırıldığında, yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda Paris saponin II (PS II) molekülünün (M+2) ⁻/M⁻ oranı önemli bir fark göstermedi ve yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+3) ^-/M^- oranı daha düşüktü. Veriler, PS VII'nin sentezlenmesi için birincil organın yapraklar olduğunu doğruladı. Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organların ve yolların gelecekte tanımlanması için temel oluşturur.

Giriş

Bitkilerdeki ikincil metabolitlerin biyosentetik yolları, oldukça spesifik ve çeşitli birikim organlarını içeren karmaşık ve çeşitlidir¹. Şu anda, birçok tıbbi bitkide ikincil metabolitler için spesifik sentez bölgeleri ve sorumlu organlar iyi tanımlanmamıştır. Bu belirsizlik, tıbbi materyallerin hem verimini hem de kalitesini optimize etmek için tasarlanmış yetiştirme yöntemlerinin stratejik ilerlemesi ve uygulanmasının önünde önemli bir engel teşkil etmektedir.

Moleküler biyoloji, biyokimyasal ve izotop etiketleme teknikleri, tıbbi bitkilerde ^2,3,4,5

Protokol

1. Deneysel hazırlık

1. Bitki büyümesi sırasında seranın bağıl neminin %75, gündüz/gece sıcaklıklarının 20 °C/10 °C olduğundan, fotoperiyodun 12 saat gündüz ve 12 saat geceden oluştuğundan ve ışık yoğunluğunun 100 μmol·^m-2·^s-1 olduğundan emin olun. LED lamba ile bitki kanopisi arasında 30 cm'lik bir mesafe bırakarak ışık yayan diyot (LED) lambalar aracılığıyla ışınım sağlayın.
   NOT: Fotoperiyot ve ışık yoğunluğu, Yunnan'daki büyüme döneminde güneşlenme saatlerinin sayısına göredir. Işınım rutin olarak bir kuantum sensörü tarafından ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu). Tıbbi bitkinin özelliklerine göre çevrese....

Tartışmalar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, bitki fizyolojik özellikleri, dokuları, organları ve ikincil metabolitleri ile ilgili kapsamlı araştırmalara bağlıdır. Protokolde özetlenen deneysel tasarım yaklaşımı, bitki ikincil metabolitlerinin biyosentetik yolaklarını araştırmak için sağlam bir temel oluşturmaktadır. Bu deneydeki kritik faktörler (1) çok yıllık fidelerin yaşının belirlenmesi ve (2) doğru izotop etiketleme-tespit zamanlamasının seçilmesidir. Tıbbi bitkiler, her b.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2