13Marquage C6-glucose associé à la LC-MS : identification des organes primaires des plantes dans la synthèse des métabolites secondaires

Résumé

La méthode développée de marquage ¹³_C-6-Glucose combinée à la spectrométrie de masse haute résolution par chromatographie liquide est polyvalente et jette les bases d’études futures sur les organes primaires et les voies impliquées dans la synthèse des métabolites secondaires dans les plantes médicinales, ainsi que sur l’utilisation complète de ces métabolites secondaires.

Résumé

Cet article présente une méthode nouvelle et efficace pour certifier les organes primaires impliqués dans la synthèse des métabolites secondaires. En tant que métabolite secondaire le plus important chez Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Main. -Mzt. (PPY), la saponine de Paris (PS) a une variété d’activités pharmacologiques et le PPY est de plus en plus demandé. Cette étude a permis d’établir quatre traitements pour l’alimentation et la non-alimentation des feuilles, des rhizomes et des tiges du faisceau vasculaire ¹³C_6-Glucose afin de certifier précisément les organes primaires impliqués dans la synthèse des saponines de Paris VII (PS VII). En combinant la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS), les rapports ¹³C/¹²C de la feuille, du rhizome, de la tige et de la racine dans différents traitements ont été calculés rapidement et avec précision, et quatre types de rapports de pics d’ions isotopiques PS (M⁻⁾ ont été trouvés : (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ et (M+4) ⁻/M⁻. Les résultats ont montré que le rapport de ¹³C/¹²C dans les rhizomes des traitements d’alimentation par tige-faisceau vasculaire et rhizome était significativement plus élevé que celui des traitements sans alimentation. Par rapport au traitement non alimentaire, le rapport de molécules de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ dans les feuilles a augmenté de manière significative sous les traitements d’alimentation des feuilles et des tiges. Simultanément, par rapport au traitement non alimentaire, le rapport des molécules de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ dans les feuilles sous traitement au rhizome n’a montré aucune différence significative. De plus, le rapport des molécules de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ dans la tige, la racine et le rhizome n’a montré aucune différence entre les quatre traitements. Par rapport au traitement non nourrissant, le rapport de la molécule de saponine II PARIS (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ dans les feuilles sous traitement foliaire n’a montré aucune différence significative, et le rapport (M+3) ⁻/M⁻ des molécules de PS II dans les feuilles sous traitement foliaire était plus faible. Les données ont confirmé que l’organe primaire de synthèse du PS VII est les feuilles. Il jette les bases de l’identification future des organes primaires et des voies impliquées dans la synthèse des métabolites secondaires dans les plantes médicinales.

Introduction

Les voies de biosynthèse des métabolites secondaires chez les plantes sont complexes et diversifiées, impliquant des organes d’accumulation très spécifiques et diversifiés¹. À l’heure actuelle, les sites de synthèse spécifiques et les organes responsables des métabolites secondaires dans de nombreuses plantes médicinales ne sont pas bien définis. Cette ambiguïté constitue un obstacle important à l’avancement stratégique et à la mise en œuvre de méthodes de culture conçues pour optimiser à la fois le rendement et la qualité des matériaux médicinaux.

La biologie moléculaire, la biochimie et les techniques de marquage isotopique sont largement utilisées pour démêler les voies de synthèse et les sites des métabolites secondaires dans les plantes médicinales 2,3,4,5, et chacune de ces méthodologies présente des forces et des limites uniques, telles que des différences d’efficacité et de précision. Les approches de biologie moléculaire, par exemple, offrent une grande précision pour localiser les sites dans les voies de biosynthèse, mais elles sont particulièrement chronophages. Leur utilité est encore limitée pour les espèces dépourvues de séquences génomiques accessibles au public, ce qui rend ces techniques moins viables dans de tels cas⁶. En revanche, les techniques de marquage isotopique, qui utilisent des rapports isotopiques tels que ³C/¹²C, ²H/¹H et ¹⁸O/¹⁶O, constituent un moyen rapide et accessible d’étudier les mécanismes de synthèse, de transport et de stockage des métabolites secondaires ^7,8. Ils peuvent révéler la distribution spatiale des composés organiques et des isotopes stables dans les feuilles, permettant ainsi de reconstituer les conditions environnementales vécues par les feuilles tout au long de leur cycle de vie⁹. De plus, l’application de marqueurs isotopiques externes, tels que le ¹³C_6-Glucose ¹⁰ et le ¹³C 6-Phénylalanine¹¹, permet la génération de métabolites secondaires marqués au carbone, améliorant ainsi notre compréhension de leur production et de leur fonction.

Les techniques traditionnelles de marquage des isotopes du carbone rencontrent des difficultés pour identifier les organes spécifiques responsables de la synthèse des métabolites secondaires en raison de la nature très spécifique à l’espèce de leurs voies de biosynthèse et de leurs mécanismes de transport. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) s’est imposée comme un instrument analytique essentiel dans ce domaine, offrant une méthode robuste pour le suivi des isotopes exogènes dans la synthèse chimique des médicaments et l’étude des processus in vivo tels que l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion¹². La sensibilité, la simplicité et la fiabilité supérieures de la LC-MS en font un choix idéal pour surveiller la production de métabolites secondaires dans les plantes¹³. Ces derniers temps, la LC-MS est devenue de plus en plus privilégiée pour son application dans les techniques de marquage isotopique externe, ce qui permet d’évaluer l’efficacité du marquage sur différents échantillons. Cette méthodologie fournit des informations essentielles sur les organes primaires impliqués dans la synthèse des métabolites secondaires dans les plantes médicinales, servant de complément inestimable aux méthodes biologiques pour identifier les organes de synthèse de ces composés^14,15. Par conséquent, cette approche facilite non seulement la comparaison de l’efficacité du marquage entre divers spécimens, mais met également en lumière les organes clés impliqués dans la génération de métabolites secondaires des plantes, améliorant ainsi notre compréhension de leur biosynthèse.

Nous avons introduit une nouvelle méthode qui combine le marquage isotopique du carbone avec la détection LC-MS pour identifier les organes primaires responsables de la synthèse des métabolites secondaires dans les plantes médicinales. La saponine de Paris (PS) a une variété d’activités pharmacologiques telles que l’anticancéreux, l’immunomodulation et l’anti-inflammation¹⁶, et le PPY est en demande croissante¹⁷. Par conséquent, nous avons utilisé des plantules de PPY comme sujets de recherche et avons décrypté que les feuilles sont le principal organe de synthèse de la saponine de Paris VII (PS VII) (Figure 1B) en utilisant le marquage ¹³C_6-Glucose associé à la méthode LC-MS. Notre approche comprenait quatre traitements différents impliquant l’alimentation en ¹³_C-6-glucose des faisceaux vasculaires des feuilles, des rhizomes et de la tige, ainsi qu’un contrôle non alimentaire. Le choix du ¹³C_6-glucose est stratégique, car il est rapidement métabolisé en acétyl coenzyme A par la respiration, ce qui facilite ensuite la synthèse du PS. En utilisant l’abondance naturelle de ¹³°C, nous avons utilisé un système de spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse et rapport d’isotopes stables (GC-IRMS) pour évaluer les rapports ¹³C/¹²C dans divers organes de la plante et pour analyser les rapports isotopiques des pics d’ions dans les molécules PS VII et Paris saponines II (PS II) (figure 1B). Notre méthodologie, qui s’appuie sur ¹³précurseurs de métabolites secondaires végétaux marqués au carbone et sur des techniques de spectrométrie de masse de pointe, offre une alternative plus simple et plus précise aux méthodes conventionnelles de marquage des isotopes du carbone. Cette nouvelle approche permet non seulement d’approfondir notre compréhension des organes impliqués dans la synthèse des métabolites secondaires chez les plantes médicinales, mais aussi de jeter des bases solides pour de futures explorations des voies de biosynthèse de ces composés.

Protocole

1. Préparation expérimentale

1. Assurez-vous que pendant la croissance des plantes, l’humidité relative de la serre est de 75%, les températures jour/nuit sont de 20 °C/10 °C, la photopériode est composée de 12 h de jour et 12 h de nuit, et l’intensité lumineuse est de 100 μmol·^m-2·^s-1. Fournir une irradiation à l’aide de lampes à diodes électroluminescentes (DEL), en gardant une distance de 30 cm entre la lampe à DEL et le couvert végétal.
   REMARQUE : La photopériode et l’intensité lumineuse sont en fonction du nombre d’heures d’ensoleillement pendant la période de croissance au Yunnan. L’irradiance est mesurée régulièrement par un capteur quantique (voir Tableau des matériaux). Apporter les modifications nécessaires aux paramètres environnementaux en fonction des caractéristiques de la plante médicinale. Une fois que ces conditions environnementales ont été soigneusement calibrées en fonction des caractéristiques de la plante et du profil d’ensoleillement régional, il est essentiel de maintenir la cohérence de ces paramètres pendant toute la durée de l’expérience. Des modifications arbitraires des paramètres environnementaux après leur établissement initial pourraient compromettre l’intégrité de l’expérience et la fiabilité des résultats.
2. Utiliser une approche hydroponique¹⁸ pour assurer la précision et la spécificité de notre expérience. Assurez-vous que les plants de PPY lavés de 2 ans (récoltés à Wenshan, province du Yunnan (104°11′E, 23°04′N) sont immergés dans une concentration standard de ¹/₄ de la solution nutritive de Hoagland pendant 3 jours pour s’adapter.
   1. Préparez la solution nutritive de Hoagland (voir la table des matières) selon les instructions ; ajoutez 1,26 g de poudre de Hoagland et 0,945 g de poudre de nitrate de calcium dans 4 L d’eau purifiée. Préparez la solution de ^{glucose 13-C}₆ (voir le tableau des matériaux) comme décrit dans le manuel standard ; ajouter 0,2 g de poudre de ¹³C_6-glucose dans 100 mL d’eau purifiée ou de solution nutritive de Hoagland.
   2. Préparez le réservoir hydroponique et la pompe à oxygène (Figure 2 ; voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Dans la configuration hydroponique, l’utilisation d’une solution de ¹³C_6-glucose pour l’étiquetage contourne l’influence des micro-organismes du sol, garantissant ainsi que la solution contribue directement à la synthèse rapide des métabolites secondaires dans les plantes médicinales. Pour optimiser les conditions d’absorption du ¹³C_6-Glucose par les plantes, il est impératif de réguler le débit de la pompe à oxygène entre 4 et 8 L/min. Ce débit contrôlé est crucial pour empêcher les plantules de flotter à la surface de l’eau, ce qui pourrait entraver considérablement leur capacité à absorber efficacement le ¹³C_6-glucose. Le maintien des plantules immergées à la bonne profondeur permet une absorption efficace du composé de marquage, assurant ainsi le succès du processus de synthèse des métabolites dans le système hydroponique.

2. Fonctionnement de l’expérimentation d’étiquetage carbone

1. Mettre en place quatre traitements et tracer les organes et les voies de synthèse de la PS VII et de la PS II dans la PPY pour démontrer que les feuilles sont l’organe primaire de synthèse de la PS.
   1. Dans le traitement 1, la plantule de PPY ne se nourrit pas ; dans le traitement 2, pulvériser les feuilles des plantules de PPY avec 0,2 % de ¹³C_6-glucose ; dans le traitement 3, nourrir les rhizomes des plantules de PPY avec 0,2 % de ¹³C_6-glucose ; dans le traitement 3, nourrir le semis de PPY au niveau de l’incision de la tige avec le ¹³_C-6-glucose à 0,2 % (figure 2A).
      REMARQUE : Le traitement 1 est défini comme un groupe témoin. Le traitement 2 est mis en place pour démontrer que les feuilles peuvent synthétiser le PS. Les traitements 3 et 4 sont mis en place pour démontrer que les rhizomes peuvent absorber le ¹³C_6-Glucose.
   2. Dans les traitements 1 et 2, cultivez les plantules de PPY dans la solution nutritive normale de Hoagland. Vaporisez 5 ml de solution de glucose ¹³C₆ à 0,2 % une fois le matin, l’après-midi et le soir sur les feuilles du traitement 2.
   3. Dans les traitements 3 et 4, cultivez les semis de PPY dans la solution nutritive de Hoagland contenant 0,2 % de ¹³C_6-glucose. Dans le traitement 4, utilisez un scalpel (voir le tableau des matériaux) pour couper les tiges des plantules de PPY par le milieu, mais gardez les faisceaux vasculaires attachés.
   4. Laissez chaque traitement être étiqueté pendant 3 jours et changez la solution nutritive tous les 1,5 jours. Réalisez l’expérience en utilisant un plan de blocs randomisés et répétez chaque traitement 3 fois.
      REMARQUE : Lors de la pulvérisation des feuilles, il est important de placer un papier absorbant derrière les feuilles pulvérisées. Cela empêche les gouttelettes d’eau de tomber dans la solution nutritive située en dessous, ce qui pourrait autrement affecter les résultats de l’expérience. Les coupures dans les tiges ne sont pas toutes enlevées, mais sont attachées à des conduits visibles à l’œil nu.

3. Méthodes d’échantillonnage et de préparation

1. Collectez séparément les feuilles, les tiges, les rhizomes et les racines de chaque traitement à la fin de l’expérience de 3 jours sur le 13-C-6-glucose. Lavez soigneusement les organes végétaux collectés pour éliminer les impuretés de surface.
   REMARQUE : L’absence d’abondance de ¹³C peut être constatée par l’analyse LC-MS de la solution de lavage, qui prouve que le lavage est propre¹⁹.
2. Utilisez une étuve de séchage électrique à température constante (voir tableau des matériaux) pour sécher les organes végétaux lavés. Commencer à 105 °C pendant 30 min, puis régler à 60 °C jusqu’à consistance constante. Broyez les organes végétaux séchés en poudre à l’aide d’un broyeur rapide d’échantillons entièrement automatique (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE : La poudre est utilisée pour l’analyse quantitative des rapports PS VII, II et ¹³C/¹²C dans différents organes de la plante.
3. À l’aide d’une balance analytique électronique (voir le tableau des matériaux), peser avec précision 30 mg de poudre pour chaque échantillon et le placer dans 2 mL d’éthanol-eau à 75 % v/v. Utiliser un nettoyeur à ultrasons CNC (voir tableau des matériaux) et effectuer l’extraction par ultrasons à 25 °C pendant 20 min (60 kHz), répéter 2 fois ; Fusionner les solutions d’extraction et préparer trois échantillons parallèles²⁰.
   REMARQUE : Les erreurs de poids de l’échantillon doivent être minimisées.
4. Utilisez de l’azote pour sécher la solution d’extraction, puis dissolvez-la dans du méthanol chromatographique jusqu’à un volume de 1 mL. Avant l’injection, utilisez un filtre en phase organique de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) pour la filtration (figure 2B).
   REMARQUE : Ne soufflez pas l’extrait lors du séchage avec de l’azote gazeux ; L’extrait doit être passé à travers une membrane microporeuse pour s’assurer que les impuretés interfèrent le moins possible.

4. Configuration et fonctionnement du LC-MS

1. Réglage MS
   1. Activez la pompe à vide en basculant son interrupteur sur la position marche. Ouvrez la vanne principale de la bouteille de gaz argon, puis ajustez la soupape de pression partielle pour atteindre une pression cible d’environ 0,3 MPa. Ensuite, assurez-vous que la vanne d’azote gazeux est également ouverte.
   2. Lancez le logiciel de contrôle MS (voir Tableau des matériaux). Cliquez sur la source d’ionisation par électronébulisation chauffée (source HESI) dans le panneau du logiciel et entrez les paramètres, y compris la tension capillaire (3,0 kV pour le mode négatif), la température capillaire (350 °C), le débit de gaz de gaine (N₂) (35 unités arbitraires), le débit de gaz auxiliaire (N₂) (15 unités arbitraires)), par balayage complet basé sur la masse moléculaire du PS (opéré de m/z 100 à 1 500). Cliquez sur le bouton Appliquer pour activer la source d’ions.
      REMARQUE : Attendez au moins 8 h pour assurer un degré de vide suffisant pour les conditions expérimentales. Vérifiez que la pression gazeuse de l’argon et de l’azote est suffisamment élevée avant l’analyse.
2. Pré-exécution LC
   1. Préparez la phase mobile A en mélangeant de l’acide formique à 0,1 % avec de l’eau et utilisez de l’acétonitrile pour la phase mobile B (voir le tableau des matériaux). Dégazez les deux phases dans un sonicateur à bain d’ultrasons pendant 15 minutes pour éliminer les gaz dissous. Ensuite, connectez la phase mobile A à son passage de fluide respectif et faites de même avec la phase mobile B. Enfin, mélangez une solution de méthanol et d’eau 1:9 v/v pour le liquide de nettoyage et remplissez manuellement les flacons de la pompe et de l’injecteur.
      REMARQUE : La fréquence du sonicateur à bain d’ultrasons est de 40 kHz.
3. Etablissement de la méthode LC
   1. Sélectionnez le bouton « Configuration de l’instrument » pour accéder à la fenêtre d’édition de méthode.
   2. Appuyez sur le bouton « Nouveau » pour lancer la création d’une nouvelle méthode d’instrument LC-MS.
   3. Définissez le temps d’exécution total de la méthode LC. Ensuite, entrez les valeurs nécessaires pour la limite de pression, le débit total, le gradient de débit, la température de l’échantillon, la température de la colonne et le delta de température prête dans la fenêtre d’édition de méthode.
      REMARQUE : Les réglages de la méthode de l’instrument LC-MS sont adaptés à l’analyte d’intérêt et au type de colonne de chromatographie liquide utilisée. Pour des résultats optimaux, utilisez un débit de 0,3 mL/min avec une colonne BEH C18 maintenue à 40 °C (voir le tableau des matériaux). L’élution en gradient est configurée comme suit : commencer à 10 % B, augmenter linéairement jusqu’à 30 % B sur 8 min, puis à 45 % B de 8 à 16 min, à 50 % B de 16 à 24 min, et à 70 % B de 24 à 30 min. Immédiatement après, rétablissez la pente à l’état initial de 10 % B en 0,1 min, en la maintenant à ce niveau pendant 2,9 min supplémentaires. Injecter un volume d’échantillon de 5 μL pour chaque analyse. Les réglages de la méthode de l’instrument LC-MS dépendent de la substance spécifique à analyser et du type de colonne de chromatographie liquide utilisée²¹.
4. Acquisition MS
   1. Dans l’onglet Paramètres , choisissez le type d’expérience MS général ou MSⁿ pour la configuration de la méthode MS. Entrez les valeurs nécessaires pour configurer le temps d’acquisition, la polarité (positive ou négative), la plage de masse, le numéro de la vanne de dérivation et la durée de la vanne de déviation. Après avoir entré ces détails, cliquez sur le bouton « Enregistrer » pour finaliser et enregistrer ces paramètres en tant que méthode d’instrument.
      REMARQUE : Les paramètres par défaut sans colonne de chromatographie sont les suivants : temps d’acquisition, 2 min ; polarité, positive ou négative ; gamme de masse, 100 à 1 500.
5. Effectuer la spectrométrie de masse à plusieurs étages selon les méthodes conventionnelles.
   1. Utilisez toujours le mode d’acquisition dépendante des données (DDA) pour la collecte de données en spectrométrie de masse à plusieurs étages. En mode DDA, le spectromètre de masse identifie les cinq ions les plus intenses lors de chaque balayage dans la première étape de la spectrométrie de masse en tandem, qui sont ensuite fragmentés et examinés dans la deuxième étape de la spectrométrie de masse en tandem.
      REMARQUE : Les données MS et MS/MS collectées peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure et une recherche dans la base de données.

5. Acquisition, analyse et calcul manuels des données

1. Acquisition et analyse des données
   1. Double-cliquez sur les fichiers bruts pour ouvrir tous les spectres de masse de MS. Calculez manuellement les valeurs de différence m/z entre l’ion et les ions de fragment correspondants.
   2. Importez les fichiers de données brutes des traitements de contrôle et d’échantillons et des blancs dans le logiciel d’analyse par spectrométrie de masse pour identifier les PS en calculant avec précision la masse et les fragments de PS.
      REMARQUE : PS VII et PS II sont identifiés par comparaison avec les temps de rétention et la coélution de solutions étalons authentiques. La LC-MS détecte une série de petits pics aux positions des pics d’ions moléculaires. Le rapport de chaque série de pics d’ions isotopiques est constant. Lorsque des isotopes exogènes du ¹³C sont administrés, l’abondance totale du ¹³C dans la plante augmente, et les rapports de la série des pics d’ions isotopiques des métabolites secondaires de la plante changent. La tolérance maximale de l’erreur de masse est fixée à 5 ppm.
   3. Balayez la plage de masse m/z 500-1 500 pour identifier le pic de base. Déterminez la masse moléculaire précise à 4 décimales près, en fonction de la masse moléculaire précise et du temps de rétention de la molécule cible. Rechercher l’aire du pic de l’écoulement d’ions isotopiques en série et dériver les valeurs pour M⁻, (M+1) ⁻, (M+2) ⁻, (M+3) ⁻ et (M+4) ⁻. Lorsque la phase mobile contient de l’acide formique, les ions négatifs comprennent également (M+COOH) ⁻, (M+COOH+1) ⁻, (M+COOH+2) ⁻, (M+COOH+3) ⁻ et (M+COOH+4) ⁻.
      REMARQUE : La sélection de pics dans la plage de masse m/z 500-1 500 améliore la précision de l’identification des pics d’ions moléculaires pour PS VII et PS II. Par exemple, le spectre massique d’ions négatifs du PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) s’ionise principalement avec ^{les ions} COOH dans le mélange acide formique-eau. Les ions isotopiques en série observés comprennent 1029.53⁻, 1030.54⁻, 1031.54⁻, 1032.55⁻, 1033.55⁻ et s’étendant jusqu’à 1079.56−.
2. Calcul des données
   1. Pour réduire l’effet de l’abondance naturelle de ¹³°C, calculez les rapports entre les courants ioniques marqués et non marqués pour chaque organe sous différents traitements, en vous concentrant spécifiquement sur les rapports (M+1)⁻/ M−, (M⁺2)⁻/M⁻, (M+3⁾⁻/ M⁻ et (M+4)⁻/ M⁻. Pour différencier les isotopes marqués des isotopes naturels afin d’évaluer avec précision l’incorporation de ¹³C, calculez ces rapports pour n = 1, 2, 3, 4 à l’aide de l’équation (1).
      Rapport = A (M+2) ⁻/ AM⁻ (1)
      PS : (M+2) ⁻ inclure (M+2+COOH) ⁻ et (M+2) ⁻ ; M⁻ comprennent (M+COOH) ^- et M⁻.
      REMARQUE : Ici, M⁻ fait référence aux zones de crête combinées des courants ioniques pour (M+COOH) ⁻ et M ⁻, principalement ionisés avec ^COOH− dans l’acide formique-eau. A représente la surface du pic. Par exemple, les formules de calcul des ratios PS VII sont illustrées comme suit :
      Rapport+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapport+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapport+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Rapport+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Résultats

Pour confirmer que l’apport en_{13-C6-glucose} dans les rhizomes était efficace, nous avons analysé plus en détail les rapports isotopiques ¹³C/¹²C dans les rhizomes. Les rapports isotopiques ¹³C/¹²C des traitements 3 et 4 étaient beaucoup plus élevés que ceux du traitement 2 (figure 1A). Les résultats ont indiqué que le 13-C-6-glucose des traitements 3 et 4 a pénétré dans les rhizomes par ingestion._<...

Discussion

La mise en œuvre réussie de ce protocole dépend de recherches approfondies sur les propriétés physiologiques des plantes, les tissus, les organes et les métabolites secondaires. L’approche de conception expérimentale décrite dans le protocole pose une base solide pour l’étude des voies de biosynthèse des métabolites secondaires des plantes. Les facteurs critiques de cette expérience sont (1) la détermination de l’âge des semis de plantes vivaces et (2) le choix du bon moment pour le marquage et la dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2