13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

요약

액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 ¹³C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.

초록

이 논문은 2차 대사산물 합성에 관여하는 1차 장기를 인증하기 위한 새롭고 효율적인 방법을 제시합니다. Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.)에서 가장 중요한 2 차 대사 산물로 손. -Mzt. (PPY), 파리 사포닌 (PS)은 다양한 약리 활성을 가지고 있으며 PPY에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 이 연구는 파리 사포닌 VII(PS VII) 합성에 관여하는 주요 장기를 정확하게 인증하기 위해 잎, 뿌리줄기 및 줄기-혈관-번들 ¹³C₆-포도당 공급 및 비공급 4가지 처리를 확립했습니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 결합하여 서로 다른 처리에서 잎, 뿌리줄기, 줄기 및 뿌리의 ^13C/^12C비율을 빠르고 정확하게 계산하고 (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ 및 (M+4) ⁻/M⁻의 4가지 유형의 PS 동위원소 이온 피크(M⁻) 비율을 찾았습니다. 그 결과, 줄기-혈관-다발 및 뿌리줄기 섭식 처리의 뿌리줄기에서 ¹³C/¹²C의 비율이 비수유 처리에서보다 유의하게 높았다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 및 줄기-혈관-다발 수유 처리에서 잎의 PS VII 분자(M+2) ^-/M⁻의 비율이 크게 증가했습니다. 동시에, 비수유 처리와 비교하여, 뿌리줄기 처리 하의 잎에서 PS VII 분자(M+2) ^-/M⁻의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았습니다. 또한, 줄기, 뿌리 및 뿌리 줄기에서 PS VII 분자 (M + 2) ⁻ / M ⁻의 비율은 4 가지 처리간에 차이를 보이지 않았습니다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 수유 처리 하의 잎에서 파리 사포닌 II(PS II) 분자 (M+2) ⁻/M⁻의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았으며, 잎 수유 처리 하의 잎에서 PS II 분자의 (M+3) ⁻/M⁻ 비율은 더 낮았다. 이 데이터는 PS VII의 합성을 위한 주요 기관이 잎이라는 것을 확인했다. 이는 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 기관 및 경로를 향후 식별하기 위한 토대를 마련합니다.

서문

식물에서 2차 대사 산물의 생합성 경로는 매우 특이적이고 다양한 축적 기관을 포함하여 복잡하고 다양합니다¹. 현재 많은 약용 식물에서 2차 대사 산물에 대한 특정 합성 부위와 책임 기관은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이러한 모호성은 의약 재료의 수확량과 품질을 모두 최적화하도록 설계된 재배 방법의 전략적 발전과 구현에 심각한 장애물이 됩니다.

분자 생물학, 생화학 및 동위원소 표지 기술은 약용 식물 ^2,3,4,5에서 2 차 대사 산물의 합성 경로 및 위치를 밝히기 위해 광범위하게 사용되며, 이러한 각 방법론은 효율성 및 정확성의 차이와 같은 고유 한 강점과 한계를 나타냅니다. 예를 들어, 분자 생물학 접근법은 생합성 경로 내의 위치를 정확히 찾아내는 데 높은 정밀도를 제공하지만 특히 시간이 많이 걸립니다. 이들의 유용성은 공개적으로 이용 가능한 게놈 염기서열이 없는 종에 대해 더욱 제한되며, 이러한 경우에는 이러한 기술의 실행 가능성을 떨어뜨린다

프로토콜

1. 실험 준비

1. 식물이 자라는 동안 온실의 상대 습도는 75%, 낮/밤 온도는 20°C/10°C, 광주는 낮 12시간, 밤 12시간으로 구성되며 광도는 100μmol·^m-2·^s-1인지 확인하십시오. 발광 다이오드(LED) 램프를 통해 조도를 제공하고 LED 램프와 식물 캐노피 사이에 30cm의 거리를 유지합니다.
   참고: 광주기와 광도는 윈난성의 성장 기간 동안 일조 시간의 수에 따라 다릅니다. 방사 조도는 일반적으로 양자 센서에 의해 측정됩니다( 재료 표 참조). 약용 식물의 특성에 따라 환경 매개 변수를 필요한 변경하십시오. 이러한 환경 조건이 식물의 특성과 지역별 햇빛 프로파일에 따라 신중하게 조정된 후에는 실험 기간 동안 이러한 환경에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 초기 설정 후 환경 매개변수를 임의로 변경하면 실험의 무결성과 결과의 신뢰성이 손상될 수 있습니다.
2. 실험의 정확성과 특이성을 보장하기 위해 수경재배 접근법¹⁸ 을 사용하십시오. 세척한 2년 된 PPY 묘목(윈난성 원산(104°11′E, 23°04′N)에서 수확)을 Hoagland의 영양 용액의 ¹/₄

토론

이 프로토콜의 성공적인 구현은 식물의 생리학적 특성, 조직, 장기 및 2차 대사 산물에 대한 포괄적인 연구에 달려 있습니다. 프로토콜에 요약된 실험 설계 접근법은 식물 2차 대사 산물의 생합성 경로를 조사하기 위한 강력한 토대를 마련합니다. 이 실험에서 중요한 요소는 (1) 다년생 묘목의 나이를 결정하고 (2) 올바른 동위원소 라벨링 검출 타이밍을 선택하는 것입니다. 약용 식물은 다년생 식물.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2