13C 6-Glukosemarkierung im Zusammenhang mit LC-MS: Identifizierung pflanzlicher Primärorgane bei der Synthese von Sekundärmetaboliten

Zusammenfassung

Die entwickelte Methode der ¹³C 6-Glukose-Markierung in Kombination mit der Flüssigchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie ist vielseitig einsetzbar und legt den Grundstein für zukünftige Studien zu den primären Organen und Signalwegen, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, sowie für die umfassende Nutzung dieser Sekundärmetaboliten.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine neuartige und effiziente Methode zur Zertifizierung von Primärorganen vorgestellt, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Als wichtigster Sekundärmetabolit in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten und PPY erfreut sich einer zunehmenden Nachfrage. In dieser Studie wurden vier Behandlungen, die Blatt-, Rhizom- und Stamm-Gefäß-Bündel ¹³C_6-Glukose füttern und nicht füttern, etabliert, um die primären Organe, die an der Synthese von Pariser Saponinen VII (PS VII) beteiligt sind, genau zu zertifizieren. Durch die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) wurden die ¹³C/¹²C-Verhältnisse von Blatt, Rhizom, Stamm und Wurzel in verschiedenen Behandlungen schnell und genau berechnet, und es wurden vier Arten von PS-Isotopen-Ionen-Peak(M^-)-Verhältnissen gefunden: (M+1) ⁻/M^-, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ und (M+4) ⁻/M⁻. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis von ¹³C/¹²C in den Rhizomen der Stamm-Gefäßbündel- und Rhizom-Fütterungsbehandlungen signifikant höher war als in der nicht-fütternden Behandlung. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung stieg das Verhältnis von PS VII-Molekülen (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter der Fütterung von Blättern und Stängel-Gefäßbündeln signifikant an. Gleichzeitig zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter Rhizombehandlung im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung keinen signifikanten Unterschied. Darüber hinaus zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) ⁻/M⁻ im Stamm, der Wurzel und dem Rhizom keine Unterschiede zwischen den vier Behandlungen. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung zeigte das Verhältnis des Pariser Saponin II (PS II)-Moleküls (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter der Blattfütterung keinen signifikanten Unterschied, und das (M+3) ⁻/M−-Verhältnis der ^{PS-II-Moleküle} in den Blättern unter der Blattfütterung war niedriger. Die Daten bestätigten, dass das primäre Organ für die Synthese von PS VII die Blätter sind. Es legt den Grundstein für die zukünftige Identifizierung der primären Organe und Signalwege, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind.

Einleitung

Die Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten in Pflanzen sind kompliziert und vielfältig und umfassen hochspezifische und vielfältige Akkumulationsorgane¹. Gegenwärtig sind die spezifischen Synthesestellen und verantwortlichen Organe für Sekundärmetaboliten in vielen Heilpflanzen nicht genau definiert. Diese Unklarheit stellt ein erhebliches Hindernis für die strategische Weiterentwicklung und Umsetzung von Anbaumethoden dar, die sowohl die Ausbeute als auch die Qualität von Arzneimitteln optimieren sollen.

Molekularbiologische, biochemische und Isotopenmarkierungstechniken werden ausgiebig eingesetzt, um die Synthesewege und -stellen von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen^zu entschlüsseln 2,3,4,5, und jede dieser Methoden weist einzigartige Stärken und Grenzen auf, wie z. B. Unterschiede in der Effizienz und Genauigkeit. Molekularbiologische Ansätze bieten beispielsweise eine hohe Präzision bei der Lokalisierung der Stellen innerhalb der Biosynthesewege, sind aber besonders zeitintensiv. Ihr Nutzen ist für Arten ohne öffentlich zugängliche Genomsequenzen weiter eingeschränkt, so dass diese Techniken in solchen Fällen weniger brauchbar sind⁶. Im Gegensatz dazu bieten Isotopenmarkierungstechniken unter Verwendung von Isotopenverhältnissen wie ³C/¹²C, ²H/¹H und ¹⁸O/¹⁶O ein schnelles und zugängliches Mittel zur Untersuchung der Synthese-, Transport- und Speichermechanismen von Sekundärmetaboliten ^7,8. Sie können die räumliche Verteilung von organischen Verbindungen und stabilen Isotopen in den Blättern aufdecken und ermöglichen so die Rekonstruktion der Umweltbedingungen, denen die Blätter während ihres gesamten Lebenszyklus ausgesetzt sind⁹. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung externer Isotopenmarkierungen wie ¹³_C6-Glucose ¹⁰ und ¹³C 6-Phenylalanin¹¹ die Erzeugung von kohlenstoffmarkierten Sekundärmetaboliten, wodurch unser Verständnis ihrer Produktion und Funktion verbessert wird.

Herkömmliche Techniken zur Markierung von Kohlenstoffisotopen stoßen aufgrund der hohen Speziesspezifität ihrer Biosynthesewege und Transportmechanismen auf Herausforderungen bei der Bestimmung der spezifischen Organe, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) hat sich in diesem Bereich zu einem wichtigen analytischen Instrument entwickelt, das eine robuste Methode zur Verfolgung exogener Isotope in der chemischen Synthese von Arzneimitteln und zur Untersuchung von In-vivo-Prozessen wie Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung bietet¹². Die überlegene Sensitivität, Einfachheit und Zuverlässigkeit der LC-MS machen sie zur idealen Wahl für die Überwachung der Produktion von Sekundärmetaboliten in Pflanzen¹³. In jüngster Zeit ist LC-MS zunehmend für ihre Anwendung in externen Isotopenmarkierungstechniken beliebt geworden, die die Bewertung der Markierungseffizienz über verschiedene Proben hinweg ermöglichen. Diese Methodik bietet wichtige Einblicke in die Primärorgane, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, und stellt eine unschätzbare Ergänzung zu biologischen Methoden zur Identifizierung der Syntheseorgane dieser Verbindungen dar^14,15. Folglich erleichtert dieser Ansatz nicht nur den Vergleich der Markierungseffizienz zwischen verschiedenen Proben, sondern gibt auch Aufschluss über die Schlüsselorgane, die an der Bildung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten beteiligt sind, und verbessert so unser Verständnis ihrer Biosynthese.

Wir haben eine neuartige Methode eingeführt, die die Kohlenstoffisotopenmarkierung mit der LC-MS-Detektion kombiniert, um die primären Organe zu identifizieren, die für die Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen verantwortlich sind. Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten wie Krebsbekämpfung, Immunmodulation und entzündungshemmende^{Wirkung 16}, und PPY ist zunehmend gefragt¹⁷. Daher haben wir PPY-Sämlinge als Forschungsobjekte verwendet und entschlüsselt, dass Blätter das primäre Organ für die Synthese des Pariser Saponins VII (PS VII) sind (Abbildung 1B), indem wir die ¹³C 6-Glukose-Markierung verwenden, die mit der LC-MS-Methode assoziiert ist. Unser Ansatz umfasste vier verschiedene Behandlungen, bei denen ¹³C_6-Glukose an Blatt-, Rhizom- und Stammgefäßbündel gefüttert wurde, sowie eine Kontrolle ohne Fütterung. Die Wahl von ¹³C_6-Glucose ist strategisch, da es über die Atmung schnell zu Acetyl-Coenzym A metabolisiert wird, das dann die PS-Synthese erleichtert. Unter Ausnutzung der natürlichen Häufigkeit von ¹³C verwendeten wir ein Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-IRMS), um die ¹³C/¹²C-Verhältnisse in verschiedenen Pflanzenorganen zu bewerten und die Isotopen-Ionen-Peak-Verhältnisse in PS VII- und Pariser Saponinen II (PS II) (Abbildung 1B) Molekülen zu analysieren. Unsere Methodik, die ¹³C-markierte pflanzliche Sekundärmetaboliten-Vorläufer und modernste Massenspektrometrietechniken nutzt, bietet eine einfachere und genauere Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Markierung von Kohlenstoffisotopen. Dieser neuartige Ansatz vertieft nicht nur unser Verständnis der Organe, die an der Sekundärmetabolitensynthese in Heilpflanzen beteiligt sind, sondern legt auch eine solide Grundlage für zukünftige Erkundungen der Biosynthesewege dieser Verbindungen.

Protokoll

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Achten Sie darauf, dass während des Pflanzenwachstums die relative Luftfeuchtigkeit des Gewächshauses 75 % beträgt, die Tag-/Nachttemperaturen 20 °C/10 °C betragen, die Photoperiode aus 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht besteht und die Lichtintensität 100 ^μmolμm-2·^s-1 beträgt. Sorgen Sie für Bestrahlungsstärke über Leuchtdioden (LED)-Lampen und halten Sie einen Abstand von 30 cm zwischen der LED-Lampe und dem Pflanzendach ein.
   HINWEIS: Die Photoperiode und die Lichtintensität richten sich nach der Anzahl der Sonnenstunden während der Vegetationsperiode in Yunnan. Die Bestrahlungsstärke wird routinemäßig mit einem Quantensensor gemessen (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie die notwendigen Änderungen der Umweltparameter entsprechend den Eigenschaften der Heilpflanze vor. Sobald diese Umweltbedingungen auf der Grundlage der Eigenschaften der Pflanze und des regionalen Sonnenlichtprofils sorgfältig kalibriert wurden, ist es entscheidend, diese Einstellungen während der gesamten Dauer des Experiments konstant zu halten. Willkürliche Änderungen der Umgebungsparameter nach ihrer ersten Etablierung könnten die Integrität des Experiments und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen.
2. Verwenden Sie einen hydroponischen Ansatz¹⁸ , um die Genauigkeit und Spezifität unseres Experiments sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die gewaschenen 2-jährigen PPY-Setzlinge (geerntet aus Wenshan, Provinz Yunnan (104°11′E, 23°04′N) 3 Tage lang ^{in eine 1}/_{4-Standardkonzentration} der Hoagland-Nährlösung getaucht werden, um sich anzupassen.
   1. Bereiten Sie die Nährlösung von Hoagland (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen vor; 1,26 g Hoagland-Pulver und 0,945 g Calciumnitrat-Pulver in 4 l gereinigtes Wasser geben. Bereiten Sie die ¹³C 6-Glucose-Lösung (siehe Materialtabelle) wie im Standardhandbuch beschrieben vor; 0,2 g ¹³C_6-Glucose Pulver in 100 ml gereinigtes Wasser oder Hoaglands Nährlösung geben.
   2. Bereiten Sie den Hydrokulturtank und die Sauerstoffpumpe vor (Abbildung 2; siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Bei der Hydrokultur wird durch die Verwendung einer ¹³C_{6-Glukoselösung} zur Markierung der Einfluss von Bodenmikroorganismen umgangen, wodurch sichergestellt wird, dass die Lösung direkt zur schnellen Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beiträgt. Um die Bedingungen für die Aufnahme von ¹³C_6-Glucose durch die Pflanzen zu optimieren, ist es zwingend erforderlich, die Durchflussmenge der Sauerstoffpumpe zwischen 4 und 8 L/min zu regulieren. Diese kontrollierte Durchflussrate ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Sämlinge auf der Wasseroberfläche schwimmen, was ihre Fähigkeit, das ¹³C_6-Glucose effektiv aufzunehmen, erheblich beeinträchtigen könnte. Die Aufrechterhaltung des Eintauchens der Sämlinge in der richtigen Tiefe ermöglicht eine effiziente Aufnahme der Markierungsverbindung und stellt so den Erfolg des Metabolitensyntheseprozesses im hydroponischen System sicher.

2. Durchführung des Versuchs zur Kohlenstoffkennzeichnung

1. Richten Sie vier Behandlungen ein und verfolgen Sie die Syntheseorgane und -wege von PS VII und PS II in PPY, um zu zeigen, dass Blätter das primäre Organ für die Synthese von PS sind.
   1. In Behandlung 1 frisst der PPY-Sämling nicht; in Behandlung 2 besprühen Sie die Blätter des PPY-Sämlings mit 0,2 % ¹³C_6-Glucose; In Behandlung 3 füttern Sie die Rhizome des PPPY-Sämlings mit 0,2 % ¹³C_6-Glukose; In Behandlung 3 füttern Sie den PPY-Sämling am Stängelschnitt mit der 0,2%igen ¹³C_6-Glukose (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Behandlung 1 ist als Kontrollgruppe eingestellt. Behandlung 2 dient dazu, zu zeigen, dass Blätter das PS synthetisieren können. Behandlung 3 und 4 sind darauf ausgerichtet, zu zeigen, dass Rhizome ¹³C_6-Glukose aufnehmen können.
   2. In den Behandlungen 1 und 2 kultivieren Sie die PPY-Sämlinge in normaler Hoagland-Nährlösung. Sprühen Sie 5 ml 0,2% ^{ige 13}C_{6-Glukoselösung} einmal morgens, nachmittags und abends auf die Blätter von Behandlung 2.
   3. In den Behandlungen 3 und 4 kultivieren Sie die PPY-Sämlinge in der Nährlösung von Hoagland, die 0,2 % ¹³C_6-Glucose enthält. In Behandlung 4 schneiden Sie mit einem Skalpell (siehe Materialtabelle) die Stängel der PPY-Sämlinge von der Mitte ab, aber lassen Sie die Gefäßbündel befestigt.
   4. Lassen Sie jede Behandlung 3 Tage lang etikettieren und wechseln Sie die Nährlösung alle 1,5 Tage. Führen Sie das Experiment mit einem randomisierten Blockdesign durch und wiederholen Sie jede Behandlung 3x.
      HINWEIS: Beim Besprühen der Blätter ist es wichtig, ein saugfähiges Papier hinter die besprühten Blätter zu legen. Dadurch wird verhindert, dass Wassertröpfchen in die darunter liegende Nährlösung fallen, die sonst die Ergebnisse des Versuchs beeinträchtigen könnten. Die Schnitte in den Stielen werden nicht alle entfernt, sondern mit Schläuchen versehen, die mit bloßem Auge sichtbar sind.

3. Probenahme- und Aufbereitungsmethoden

1. Sammeln Sie Blätter, Stängel, Rhizome und Wurzeln aus jeder Behandlung separat am Ende des 3-tägigen ¹³C 6-Glukose-Experiments. Waschen Sie die gesammelten Pflanzenorgane gründlich, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen.
   HINWEIS: Das Fehlen einer Häufigkeit von ¹³°C kann durch LC-MS-Analyse der Waschlösung festgestellt werden, die beweist, dass die Wäsche sauber^{ist 19}.
2. Verwenden Sie einen elektrischen Hochwasserschrank mit konstanter Temperatur (siehe Materialtabelle), um die gewaschenen Pflanzenorgane zu trocknen. Beginnen Sie 30 Minuten lang bei 105 °C und stellen Sie dann bei 60 °C ein, bis das Gewicht konstant ist. Zerkleinern Sie die getrockneten Pflanzenorgane mit einer vollautomatischen Probenschnellmühle zu Pulver (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Das Pulver wird für die quantitative Analyse von PS VII, II und ¹³C/¹²C-Verhältnissen in verschiedenen Pflanzenorganen verwendet.
3. Verwenden Sie eine elektronische Analysenwaage (siehe Materialtabelle), um 30 mg Pulver für jede Probe genau zu wiegen und legen Sie es in 2 ml 75 % v/v Ethanol-Wasser. Verwenden Sie einen CNC-Ultraschallreiniger (siehe Materialtabelle) und führen Sie die Ultraschallextraktion bei 25 °C für 20 min (60 kHz) durch, wiederholen Sie 2x; Die Extraktionslösungen werden zusammengeführt und drei parallele Proben²⁰ vorbereitet.
   HINWEIS: Fehler beim Probengewicht sollten minimiert werden.
4. Verwenden Sie Stickstoff, um die Extraktionslösung zu föhnen, und lösen Sie sie dann in chromatographischem Methanol auf ein Volumen von 1 ml auf. Verwenden Sie vor der Injektion einen 0,22-μm-Filter für die organische Phase (siehe Materialtabelle) zur Filtration (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Blasen Sie den Extrakt beim Föhnen mit Stickstoffgas nicht aus; Der Extrakt muss durch eine mikroporöse Membran geleitet werden, um sicherzustellen, dass Verunreinigungen nur minimal stören.

4. LC-MS Einrichtung und Betrieb

1. MS-Einstellung
   1. Aktivieren Sie die Vakuumpumpe, indem Sie den Schalter in die Ein-Position stellen. Öffnen Sie das Hauptventil an der Argongasflasche und stellen Sie dann das Partialdruckventil ein, um einen Zieldruck von etwa 0,3 MPa zu erreichen. Stellen Sie anschließend sicher, dass auch das Stickstoffgasventil geöffnet ist.
   2. Starten Sie die MS-Steuerungssoftware (siehe Materialtabelle). Klicken Sie im Software-Panel auf die beheizte Elektrospray-Ionisationsquelle (HESI-Quelle) und geben Sie die Parameter ein, darunter die Kapillarspannung (3,0 kV im negativen Modus), die Kapillartemperatur (350 °C), den Durchfluss des Mantelgases (N₂) (35 beliebige Einheiten), den Durchfluss des Hilfsgases (N₂) (15 beliebige Einheiten)), durch vollständiges Scannen auf der Grundlage der Molekülmasse von PS (betrieben von m/z 100-1.500). Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen, um die Ionenquelle zu aktivieren.
      HINWEIS: Warten Sie mindestens 8 Stunden, um einen ausreichenden Vakuumgrad für die Versuchsbedingungen sicherzustellen. Vor der Analyse prüfen, ob der Gasdruck von Argon und Stickstoff hoch genug ist.
2. LC-Vorlauf
   1. Bereiten Sie die mobile Phase A vor, indem Sie 0,1 % Ameisensäure mit Wasser mischen, und verwenden Sie Acetonitril für die mobile Phase B (siehe Materialtabelle). Entgasen Sie beide Phasen 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad-Beschallungsgerät, um gelöste Gase zu entfernen. Verbinden Sie dann die mobile Phase A mit ihrem jeweiligen Flüssigkeitskanal und machen Sie dasselbe mit der mobilen Phase B. Zum Schluss wird eine 1:9 v/v Methanol-Wasser-Lösung für die Reinigungsflüssigkeit angemischt und die Pumpen- und Injektorflaschen manuell befüllt.
      HINWEIS: Die Frequenz des Ultraschallbad-Ultraschallgeräts beträgt 40 kHz.
3. Etablierung der LC-Methode
   1. Wählen Sie die Schaltfläche "Instrument Setup", um das Fenster zur Methodenbearbeitung aufzurufen.
   2. Drücken Sie die Schaltfläche "Neu", um die Erstellung einer neuen LC-MS-Instrumentenmethode zu starten.
   3. Legen Sie die Gesamtlaufzeit für die LC-Methode fest. Geben Sie dann die erforderlichen Werte für die Druckgrenze, die Gesamtdurchflussrate, den Durchflussgradienten, die Probentemperatur, die Säulentemperatur und das Bereitschaftstemperaturdelta im Methodenbearbeitungsfenster ein.
      HINWEIS: Die Einstellungen für die Methode des LC-MS-Geräts sind auf den interessierenden Analyten und die Art der verwendeten Flüssigkeitschromatographiesäule zugeschnitten. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie eine Flussrate von 0,3 ml/min mit einer BEH C18-Säule, die bei 40 °C gehalten wird (siehe Materialtabelle). Die Gradientenelution ist wie folgt konfiguriert: Beginnen Sie bei 10 % B und steigen Sie linear auf 30 % B über 8 min, dann auf 45 % B von 8 bis 16 min, auf 50 % B von 16 bis 24 min und auf 70 % B von 24 bis 30 min. Setzen Sie unmittelbar danach den Gradienten innerhalb von 0,1 min auf die ursprüngliche Bedingung von 10 % B zurück und halten Sie ihn dort für weitere 2,9 min. Für jede Analyse ist ein Probenvolumen von 5 μl zu injizieren. Die Einstellungen für die Methode des LC-MS-Geräts hängen von der zu analysierenden Substanz und der Art der verwendeten Flüssigkeitschromatographiesäule ab²¹.
4. MS-Akquisition
   1. Wählen Sie auf der Registerkarte Einstellungen entweder den Experimenttyp Allgemein MS oder MSⁿ für die MS-Methodenkonfiguration aus. Geben Sie die erforderlichen Werte ein, um die Erfassungszeit, die Polarität (positiv oder negativ), den Massenbereich, die Anzahl des Umlenkventils und die Dauer des Umlenkungsventils einzustellen. Nachdem Sie diese Details eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern", um diese Einstellungen abzuschließen und als Instrumentenmethode zu speichern.
      HINWEIS: Die Standardeinstellungen ohne Chromatographiesäule lauten wie folgt: Aufnahmezeit, 2 min; Polarität, positiv oder negativ; Massenbereich von 100 bis 1.500.
5. Führen Sie eine mehrstufige Massenspektrometrie nach herkömmlichen Methoden durch.
   1. Verwenden Sie für die Datenerfassung in der mehrstufigen Massenspektrometrie immer den datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA). Im DDA-Modus identifiziert das Massenspektrometer während jeder Untersuchung in der ersten Stufe der Tandem-MS die fünf intensivsten Ionen, die anschließend in der zweiten Stufe der Tandem-Massenspektrometrie fragmentiert und untersucht werden.
      HINWEIS: Die gesammelten MS- und MS/MS-Daten können für die anschließende Analyse und Datenbanksuche verwendet werden.

5. Manuelle Datenerfassung, -analyse und -berechnung

1. Datenerfassung und -analyse
   1. Doppelklicken Sie auf die Rohdateien, um alle Massenspektren von MS zu öffnen. Berechnen Sie manuell die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion und den entsprechenden Fragmentionen.
   2. Importieren Sie die Rohdatendateien der Kontroll- und Probenbehandlungen sowie der Leerproben in die Massenspektrometrie-Analysesoftware, um PSs durch genaue Berechnung der Masse und der PS-Fragmente zu identifizieren.
      HINWEIS: PS VII und PS II werden durch den Vergleich mit Retentionszeiten und Koelution authentischer Standardlösungen identifiziert. LC-MS detektiert eine Reihe von kleinen Peaks an den Positionen der molekularen Ionenpeaks. Das Verhältnis jeder Reihe von Isotopen-Ionen-Peaks ist konstant. Wenn exogene ¹³C-Isotope verabreicht werden, nimmt die Gesamthäufigkeit von ¹³C in der Pflanze zu, und die Verhältnisse der Reihen der Isotopenionenpeaks der pflanzlichen Sekundärmetaboliten ändern sich. Die maximale Toleranz des Massenfehlers ist auf 5 ppm festgelegt.
   3. Scannen Sie den Massenbereich m/z 500-1.500, um den grundlegenden Peak zu identifizieren. Bestimmen Sie das genaue Molekulargewicht mit 4 Dezimalstellen, entsprechend dem genauen Molekulargewicht und der Retentionszeit des Zielmoleküls. Suchen Sie nach dem Peakbereich des Ionenflusses mit seriellen Isotopen und leiten Sie Werte für M⁻, (M+1) ⁻, (M+2) ⁻, (M+3) ⁻ und (M+4) ⁻ ab. Wenn die mobile Phase Ameisensäure enthält, umfassen die negativen Ionen auch (M+COOH) ⁻, (M+COOH+1) ⁻, (M+COOH+2) ⁻, (M+COOH+3) ⁻ und (M+COOH+4) ⁻.
      HINWEIS: Die Auswahl von Peaks innerhalb des Massenbereichs m/z 500-1.500 verbessert die Genauigkeit bei der Identifizierung von molekularen Ionenpeaks für PS VII und PS II. So ionisiert das negative Ionenmassenspektrum von PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) hauptsächlich mit COOH⁻ -Ionen in einem Ameisensäure-Wasser-Gemisch. Zu den beobachteten seriellen Isotopenionen gehören 1029,53⁻, 1030,54⁻, 1031,54⁻, 1032,55⁻, 1033,55⁻ und erstrecken sich bis 1079,56−.
2. Datenberechnung
   1. Um den Effekt der natürlichen Häufigkeit von ¹³°C zu verringern, berechnen Sie das Verhältnis von markierten zu unmarkierten Ionenströmen für jedes Organ unter verschiedenen Behandlungen, wobei Sie sich speziell auf die Verhältnisse (M+1)⁻/ M⁻, (M+2)⁻/M⁻, (M+3⁾⁻/ M⁻ und (M+4)⁻/ M⁻ konzentrieren. Um zwischen markierten und natürlich vorkommenden Isotopen für eine genaue Beurteilung des ^13C-Einbauszu unterscheiden, berechnen Sie diese Verhältnisse für n = 1, 2, 3, 4 mit Hilfe von Gleichung (1).
      Verhältnis = A (M+2) ⁻/ AM⁻ (1)
      PS: (M+2) ⁻ einschließen (M+2+COOH) ⁻ und (M+2) ⁻; M⁻ include (M+COOH) ^- und M⁻.
      HINWEIS: Hier bezieht sich M⁻ auf die kombinierten Peakbereiche der Ionenströme für (M+COOH) ⁻ und M ⁻, die hauptsächlich mit ^COOH− in Ameisensäure-Wasser ionisiert sind. A steht für die Peakfläche. Die Formeln zur Berechnung der PS VII-Verhältnisse werden z. B. wie folgt dargestellt:
      Verhältnis+1= (A1030,54+A1076,55)/(A1029,53+A1075,55)
      Verhältnis+2= (A1031,54+A1077,55)/(A1029,53+A1075,55)
      Verhältnis+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Verhältnis+4= (A1033,55+A1079,56)/(A1029,53+A1075,55)

Ergebnisse

Um zu bestätigen, dass die Versorgung mit ¹³C_6-Glukose in Rhizomen erfolgreich war, analysierten wir weiterhin die ¹³C/¹²C Isotopenverhältnisse in Rhizomen. Die ¹³C /¹²C Isotopenverhältnisse der Behandlungen 3 und 4 waren viel höher als die der Behandlung 2 (Abbildung 1A). Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass ¹³C_6-Glukose aus den Behandlungen 3 und 4 durch Verschlucken in die Rhizome gelangte.

...

Diskussion

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls hängt von einer umfassenden Erforschung der physiologischen Eigenschaften, Gewebe, Organe und Sekundärmetaboliten der Pflanzen ab. Der im Protokoll skizzierte Ansatz des experimentellen Designs bildet eine solide Grundlage für die Untersuchung der Biosynthesewege pflanzlicher Sekundärmetaboliten. Die kritischen Faktoren in diesem Experiment sind (1) die Bestimmung des Alters der mehrjährigen Sämlinge und (2) die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Isotopenmarkierung u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2