13C 6-Glukosemarkierung im Zusammenhang mit LC-MS: Identifizierung pflanzlicher Primärorgane bei der Synthese von Sekundärmetaboliten

Zusammenfassung

Die entwickelte Methode der ¹³C 6-Glukose-Markierung in Kombination mit der Flüssigchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie ist vielseitig einsetzbar und legt den Grundstein für zukünftige Studien zu den primären Organen und Signalwegen, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind, sowie für die umfassende Nutzung dieser Sekundärmetaboliten.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine neuartige und effiziente Methode zur Zertifizierung von Primärorganen vorgestellt, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Als wichtigster Sekundärmetabolit in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Pariser Saponin (PS) hat eine Vielzahl von pharmakologischen Aktivitäten und PPY erfreut sich einer zunehmenden Nachfrage. In dieser Studie wurden vier Behandlungen, die Blatt-, Rhizom- und Stamm-Gefäß-Bündel ¹³C_6-Glukose füttern und nicht füttern, etabliert, um die primären Organe, die an der Synthese von Pariser Saponinen VII (PS VII) beteiligt sind, genau zu zertifizieren. Durch die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) wurden die ¹³C/¹²C-Verhältnisse von Blatt, Rhizom, Stamm und Wurzel in verschiedenen Behandlungen schnell und genau berechnet, und es wurden vier Arten von PS-Isotopen-Ionen-Peak(M^-)-Verhältnissen gefunden: (M+1) ⁻/M^-, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ und (M+4) ⁻/M⁻. Die Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis von ¹³C/¹²C in den Rhizomen der Stamm-Gefäßbündel- und Rhizom-Fütterungsbehandlungen signifikant höher war als in der nicht-fütternden Behandlung. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung stieg das Verhältnis von PS VII-Molekülen (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter der Fütterung von Blättern und Stängel-Gefäßbündeln signifikant an. Gleichzeitig zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter Rhizombehandlung im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung keinen signifikanten Unterschied. Darüber hinaus zeigte das Verhältnis der PS VII-Moleküle (M+2) ⁻/M⁻ im Stamm, der Wurzel und dem Rhizom keine Unterschiede zwischen den vier Behandlungen. Im Vergleich zur Behandlung ohne Fütterung zeigte das Verhältnis des Pariser Saponin II (PS II)-Moleküls (M+2) ⁻/M⁻ in den Blättern unter der Blattfütterung keinen signifikanten Unterschied, und das (M+3) ⁻/M−-Verhältnis der ^{PS-II-Moleküle} in den Blättern unter der Blattfütterung war niedriger. Die Daten bestätigten, dass das primäre Organ für die Synthese von PS VII die Blätter sind. Es legt den Grundstein für die zukünftige Identifizierung der primären Organe und Signalwege, die an der Synthese von Sekundärmetaboliten in Heilpflanzen beteiligt sind.

Einleitung

Die Biosynthesewege von Sekundärmetaboliten in Pflanzen sind kompliziert und vielfältig und umfassen hochspezifische und vielfältige Akkumulationsorgane¹. Gegenwärtig sind die spezifischen Synthesestellen und verantwortlichen Organe für Sekundärmetaboliten in vielen Heilpflanzen nicht genau definiert. Diese Unklarheit stellt ein erhebliches Hindernis für die strategische Weiterentwicklung und Umsetzung von Anbaumethoden dar, die sowohl die Ausbeute als auch die Qualität von Arzneimitteln optimieren sollen.

Molekularbiologische, biochemische und Isotopenmarkierungstechniken werden ausgiebig eingesetzt, um die Synthese....

Protokoll

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Achten Sie darauf, dass während des Pflanzenwachstums die relative Luftfeuchtigkeit des Gewächshauses 75 % beträgt, die Tag-/Nachttemperaturen 20 °C/10 °C betragen, die Photoperiode aus 12 Stunden Tag und 12 Stunden Nacht besteht und die Lichtintensität 100 ^μmolμm-2·^s-1 beträgt. Sorgen Sie für Bestrahlungsstärke über Leuchtdioden (LED)-Lampen und halten Sie einen Abstand von 30 cm zwischen der LED-Lampe und dem Pflanzendach ein.
   HINWEIS: Die Photoperiode und die Lichtintensität richten sich nach der Anzahl der Sonnenstunden während der Vegetationsperiode in Yunnan. Die Bestrahlungsstärk....

Diskussion

Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls hängt von einer umfassenden Erforschung der physiologischen Eigenschaften, Gewebe, Organe und Sekundärmetaboliten der Pflanzen ab. Der im Protokoll skizzierte Ansatz des experimentellen Designs bildet eine solide Grundlage für die Untersuchung der Biosynthesewege pflanzlicher Sekundärmetaboliten. Die kritischen Faktoren in diesem Experiment sind (1) die Bestimmung des Alters der mehrjährigen Sämlinge und (2) die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Isotopenmarkierung u.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2