用于研究斑马鱼鳞片细胞动力学的体外培养技术

摘要

该方案提供了一种使用简单的 体外 培养技术研究细胞动力学的方法。它为斑马鱼研究人员和教育工作者提供了一个机会，通过可视化鳞片内的荧光细胞核和凋亡细胞，研究细胞过程，例如与骨稳态和基本细胞生物学相关的细胞过程。

摘要

斑马鱼秤具有多种优势，可用于标准实验室的教学和研究目的。无需安乐死即可轻松收集鳞片，可在几周内再生，并且是半透明的，体积小，可以使用标准显微镜进行观察。斑马鱼鳞片在教育环境中特别有用，因为它们为学生提供了参与实践学习体验的独特机会，尤其是在了解细胞动力学和 体外 培养方法方面。该方案的主要目的是描述一种在培养中收集和维持斑马鱼鳞片的方法，以使用基本实验室设备用于各种生物学研究。此外，该方案通过检查参与骨吸收和沉积的骨细胞的活性，详细介绍了它们在理解骨稳态中的用途。它还包括用于通用技术的附加方案，例如细胞核和凋亡细胞的可视化。 体外 培养方案以最少的试剂和设备产生可靠的结果。本文 讨论了使用斑 马鱼鳞片体外培养促进科学探究的好处，并概述了支持将其整合到教育环境中所需的资源。

引言

近年来，斑马鱼 （Danio rerio） 已成为各种科学领域的宝贵模式生物，包括遗传学、发育生物学和毒理学 ^1,2,3。斑马鱼是原产于东南亚河流的小型热带淡水鱼⁴.由于它们易于维护、体积小、繁殖周期快和胚胎半透明，它们已成为生物学中流行的模式生物¹。这允许轻松观察它们的内部发育，使它们成为研究发育生物学中各种生物过程的理想选择。斑马鱼与人类具有遗传相似性;大约 70% 的人类基因至少有一个斑马鱼对应物，这使它们成为研究人类遗传疾病和疾病的优秀模型 ^5,6。通过操纵斑马鱼中的特定基因，研究人员可以获得有关基因功能和行为的宝贵见解，然后将其应用于人类健康研究⁶、基因编辑和转基因品系的创建^7,8。

斑马鱼鳞片去除后再生

研究方案

此处描述的所有协议均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并每年由圣玛丽大学/圣文森特山大学动物护理委员会根据协议编号 20-14 和 21-12 批准。在执行此协议之前，用户必须确保遵循联邦和省级关于在研究或教学中使用动物的指导方针²³。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 结垢培养试剂的制备

1. 用 HEPES（10 g DMEM 粉末、5.95 g HEPES，溶于 1 L 蒸馏水或 dH₂O，pH：6.91）等分制备 DMEM 培养基，并储存在 4 °C。
2. 准备培养基 - 工作溶液（含 HEPES、10% 胎牛血清和 2% 青霉素-链霉素的 88% DMEM 培养基 [5000 单位青霉素和 5 mg 链霉素/mL]，调整至实验当天所需的体积。
   注意：工作溶液必须每天新鲜制备，不能储存。培养基必须保持低温（在 4 °C 或冰上）直至使用。
3. 将培养基工作溶液分装到将进行实验的容器中。在本例中，使用 0.2 mL 试管或 96 孔板。将这些等分试样保存在冰上，直到需要为止。
   注意：该溶液应新鲜制备，不能储存超过 1 天。所有试剂参见 表 1 。

讨论

斑马鱼鳞片是一种易于获得的 体外 模型，用于研究各种不同的生物过程，使用培养方法和培养箱可以维持长达 2 天，以模拟其自然环境¹¹。秤具有规则且按比例分布的细胞，使研究人员能够查看、计数和标记细胞，并使用基本的实验室设备进行简单的细胞生物学实验。此外，使用 4 倍物镜可以轻松看到整个细胞垢，这使得在实验过程中易于测量?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer