用于研究斑马鱼鳞片细胞动力学的体外培养技术

摘要

该方案提供了一种使用简单的 体外 培养技术研究细胞动力学的方法。它为斑马鱼研究人员和教育工作者提供了一个机会，通过可视化鳞片内的荧光细胞核和凋亡细胞，研究细胞过程，例如与骨稳态和基本细胞生物学相关的细胞过程。

摘要

斑马鱼秤具有多种优势，可用于标准实验室的教学和研究目的。无需安乐死即可轻松收集鳞片，可在几周内再生，并且是半透明的，体积小，可以使用标准显微镜进行观察。斑马鱼鳞片在教育环境中特别有用，因为它们为学生提供了参与实践学习体验的独特机会，尤其是在了解细胞动力学和 体外 培养方法方面。该方案的主要目的是描述一种在培养中收集和维持斑马鱼鳞片的方法，以使用基本实验室设备用于各种生物学研究。此外，该方案通过检查参与骨吸收和沉积的骨细胞的活性，详细介绍了它们在理解骨稳态中的用途。它还包括用于通用技术的附加方案，例如细胞核和凋亡细胞的可视化。 体外 培养方案以最少的试剂和设备产生可靠的结果。本文 讨论了使用斑 马鱼鳞片体外培养促进科学探究的好处，并概述了支持将其整合到教育环境中所需的资源。

引言

近年来，斑马鱼 （Danio rerio） 已成为各种科学领域的宝贵模式生物，包括遗传学、发育生物学和毒理学 ^1,2,3。斑马鱼是原产于东南亚河流的小型热带淡水鱼⁴.由于它们易于维护、体积小、繁殖周期快和胚胎半透明，它们已成为生物学中流行的模式生物¹。这允许轻松观察它们的内部发育，使它们成为研究发育生物学中各种生物过程的理想选择。斑马鱼与人类具有遗传相似性;大约 70% 的人类基因至少有一个斑马鱼对应物，这使它们成为研究人类遗传疾病和疾病的优秀模型 ^5,6。通过操纵斑马鱼中的特定基因，研究人员可以获得有关基因功能和行为的宝贵见解，然后将其应用于人类健康研究⁶、基因编辑和转基因品系的创建^7,8。

斑马鱼鳞片去除后再生 ^9,10，并且可以在用于实验时用碱性（非 CO₂）培养箱培养一到三天¹¹。在基础实验室中使用斑马鱼鳞片是有利的，因为它们可以从麻醉的鱼中取出，而无需安乐死。斑马鱼鳞片是真皮骨骼的一个组成部分，主要由两层组成：内层，内层很厚，由胶原纤维层形成的部分矿化组织组成，外层高度矿化，包含交织的胶原纤维网络^12,13（图 1A-C).该标尺的这些形态和细胞特征在标准复合显微镜下很容易观察到。这些特性使斑马鱼鳞片成为研究细胞和分子的良好模型。例如，斑马鱼鳞片已被用于研究骨稳态，包括骨细胞活性^11,12。它们还被用于了解组织再生 ^9,14,15、基因途径和信号传导^14、16、代谢¹⁷、微生物群研究¹⁸ 等。斑马鱼与其他硬骨鱼类似，对环境因素也高度敏感，例如污染物和毒素 19,20,21,22。因此，鱼鳞被用来研究鱼类种群中对毒素的暴露。这些特征使量表成为教授学生了解环境因素对生物体影响的优秀模型。此外，来自转基因斑马鱼品系的规模，例如 Tg（osterix：mCherry） 和 Tg（runx2a：GFP），可能会给学生实验增加另一个级别的复杂性。

总之，通过使用斑马鱼鳞片，研究人员可以设计和进行实验来研究生物学的各个方面，从细胞机制到环境变化。斑马鱼也是高等教育中的宝贵资源，因为它们可以提供实验设计、数据收集和分析方面的实践经验。斑马鱼还可以用于高级课程和以研究为重点的课程，以探索感兴趣的特定领域。本文介绍了在研究和课堂学习环境中使用斑马鱼秤的协议。

研究方案

此处描述的所有协议均遵循加拿大动物护理委员会的指导方针，并每年由圣玛丽大学/圣文森特山大学动物护理委员会根据协议编号 20-14 和 21-12 批准。在执行此协议之前，用户必须确保遵循联邦和省级关于在研究或教学中使用动物的指导方针²³。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 结垢培养试剂的制备

1. 用 HEPES（10 g DMEM 粉末、5.95 g HEPES，溶于 1 L 蒸馏水或 dH₂O，pH：6.91）等分制备 DMEM 培养基，并储存在 4 °C。
2. 准备培养基 - 工作溶液（含 HEPES、10% 胎牛血清和 2% 青霉素-链霉素的 88% DMEM 培养基 [5000 单位青霉素和 5 mg 链霉素/mL]，调整至实验当天所需的体积。
   注意：工作溶液必须每天新鲜制备，不能储存。培养基必须保持低温（在 4 °C 或冰上）直至使用。
3. 将培养基工作溶液分装到将进行实验的容器中。在本例中，使用 0.2 mL 试管或 96 孔板。将这些等分试样保存在冰上，直到需要为止。
   注意：该溶液应新鲜制备，不能储存超过 1 天。所有试剂参见 表 1 。

2. 去除活鱼的鳞片

1. 为斑马鱼准备一个容器或水箱，水量约为 2 升，可容纳 4-5 条成年鱼。
   注：适合斑马鱼的水的典型参数是 pH 7.5、温度 28.5 °C、电导率 640-781 μS 和 12-12 小时的暗光循环。确保水箱中的温度始终保持。
2. 使用鱼网捕捉 4-5 条成年斑马鱼，并将它们放入上面准备的斑马鱼储水箱中。
3. 准备一个装有至少 60 mL 水的容器，以便对鱼进行麻醉。
   注意：鱼必须能够在容器中移动，并且足够深以防止它们跳出。该容器应包含缓冲的 0.01% 甲烷磺酸三卡因 （MS222），其应由斑马鱼水组成（稀释的 0.1% MS222，用 0.3 g MS222、615 μL 1 M NaOH 在 300 mL 斑马鱼水系统中制备，十倍）。
   注意：进行这些实验的个人必须获得机构动物伦理委员会的批准才能捕捉、麻醉和处理斑马鱼。同样，使用的麻醉剂是低浓度的甲磺酸三卡因 （MS222），这是鱼类生物学中常用的一种化学物质，但需要正确处理，例如适当的个人防护设备，包括一次性丁腈手套、安全眼镜/防溅护目镜和实验室外套（有关更多信息，请参阅 MS222 的安全数据表）。
4. 准备一个与之前第 1 步中使用的规格相同的回收容器（至少 2 升水），去除鳞片后将鱼放在该容器中。如上所述，这个容器应该有足够的空间和正确的水参数。
5. 使用网，小心地将一条成年斑马鱼转移到含有 0.01% MS222 的容器中。等到鱼完全不动并且鳃盖运动最少（通常需要不到 10 分钟）。
   注意：整个步骤一次执行一条鱼。在成功去除正在处理的鱼的鱼鳞并且该鱼被转移到回收容器之前，不要麻醉下一条鱼。
6. 将成年斑马鱼单独放在衬有湿纸巾的倒培养皿上。
7. 在解剖立体显微镜下并使用细镊子，从一条鱼身上去除最多 10-12 个鳞片。从鱼的外侧区域去除鳞片，与身体的其他部位相比，鳞片更大，大小更恒定（图 2）。鱼的两面都可以使用。
   1. 轻轻拉动鳞片的自然方向（即，从前到后的方向），一次去除一个鳞片。这应该尽快完成。
8. 将每个单独的刻度放入单独的 0.2 mL 试管中，该试管中含有刻度培养基工作溶液（在步骤 1.1 中制备），以防止刻度降解。96 孔板可用作替代方案。
   注：将单个刻度隔离在单独的试管或孔中可防止刻度粘在一起，并允许跟踪多个实验可能需要的单个刻度。
9. 如果特定实验需要规模处理，请在此步骤中应用它。有关某些协议的示例，请参阅步骤 4 和 5。
10. 将带有刻度的试管放入 28 °C 的培养箱中。 培养基应每 24 小时更换一次（使用培养基工作溶液）。非 CO₂ 培养箱用于此处概述的实验。
11. 去除鳞片后，小心地将斑马鱼放回回收箱并监测直到恢复运动。使用移液管或曝气石在水箱中提供空气以加快回收速度。
12. 一旦恢复运动，将斑马鱼放回常规的饲养池。请记住将未使用的鱼与任何其他鱼分开保存，以便它们可以单独恢复并跟踪哪些鱼正在积极再生鳞片。
13. 等待 ~2 周，然后再重复去除这些鱼的鳞片。这让他们有时间自然地再生鳞片。

3. 刻度的固定

1. 用 200 μL 由 10x PBS 制备的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗秤 3 次（1 L，加入 80 g NaCl、2 g KCl 和 11.2 g Na₂HPO₄，加入 dH₂O 至 1 L）。
2. 除去 1x PBS 并加入 200 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 在 4 °C 下过夜。 对于 100 ml PFA，加入 4 g 多聚甲醛和 0.1 g NaOH，然后加入 1x PBS 直至 100 mL。在设置为小火的热板上混合并搅拌至溶液澄清，然后让溶液冷却并将 pH 值稳定至 7.4。储存在 -20 °C。 详情请见 补充文件 1 （表 1）。
3. 固定后，用 200 μL 的 1x PBS 洗涤秤 3 次。将秤储存在 4 °C。
   注意：PFA 是有害的。有关更多信息，请参阅安全数据表。所有这些过程都需要妥善处理，例如适当的个人防护设备，包括一次性丁腈手套、安全眼镜/防溅护目镜和实验室外套。

4. 骨稳态

注意：下面描述了两种骨稳态程序。抗酒石酸酸性磷酸酶 （TRAP） 和碱性磷酸盐 （AP） 染色通常用于分别识别活性破骨细胞和成骨细胞。破骨细胞吸收骨基质，而成骨细胞沉积骨基质。AP 是成骨细胞在骨形成过程中释放的主要酶，而 TRAP 由破骨细胞分泌到破骨细胞和骨基质之间的酸性空间中，有助于骨分解和吸收 24,25,26。该协议也可在 The Zebrafish Information Network²⁷上找到，之前已发布²⁸。碱性磷酸酶是一种由多种细胞类型产生的酶，是代谢过程的一部分。这个过程并不完全特定于成骨细胞，但在骨组织中，它被用作成骨细胞功能的标志物。

1. 抗酒石酸酸性磷酸酶 （TRAP） 染色
   1. 将每个固定刻度放入含有 200 μL dH₂O 的 0.2 mL 试管或 96 孔板中。通过添加和去除约 150 μL dH₂O 清洗刻度 15 分钟，洗涤刻度 3 次。有关详细信息，请参见 补充文件 1 （表 2）。
   2. 从 0.2 mL 试管或孔中取出刻度，并将其放入含有 200 μL 50 mM 酒石酸盐缓冲液的新试管中。在室温下孵育 1 小时。
      1. 对于 100 mM 酒石酸盐缓冲液，准备一个玻璃容器，加入 2.3 g 酒石酸，并将其与 0.2 M 乙酸盐缓冲液 （pH 5.5） 混合，直至 100 mL 溶液。充分搅拌并储存在 4 °C。 要制备 50 mM 酒石酸盐缓冲液，请添加等体积的 dH₂O 和 100 mM 酒石酸盐缓冲液。详情请参见 补充文件 1 （表 3 和表 4）。
   3. 从试管中取出酒石酸盐缓冲液，加入 200 μL TRAP 底物溶液。在室温下孵育样品 1 小时。确保样品保持在黑暗中。
      1. 准备一个深色玻璃容器，加入 30 mL 100 mM 酒石酸盐缓冲液、1 mL 六氮化 PRS（盐酸副玫瑰苯胺溶液）和 2 mL 酶底物溶液。搅拌均匀。
         注意：此溶液无法存储;使用时请在室温下避光保存。有关制备 TRAP 底物溶液所需的溶液，请参见 补充文件 1 （表 5-9）。
   4. 去除 TRAP 底物溶液，通过添加和去除约 150 μL dH₂O 15 分钟来清洗刻度，共 3 次。
   5. 从试管中取出刻度，将它们放入装有 200 μL 80% 甘油（对于 100 mL，将 80 mL 甘油与 20 mL dH₂O 混合）的新试管或孔中，用铝箔包裹以避免褪色并储存在 4 °C。
   6. 要在显微镜下观察鳞片，请使用凹陷或凹面载玻片。
2. 碱性磷酸盐 （AP） 染色
   1. 将每个固定刻度放入含有 200 μL dH₂O 的 0.2 mL 试管或 96 孔板中，然后通过添加和去除约 150 μL dH₂O 洗涤 15 分钟，共 3 次。有关详细信息，请参见 补充文件 1 （表 2）。
   2. 从 0.2 mL 试管或孔中取出刻度，将它们放入含有 200 μL tris-马来酸缓冲液的新试管中，并在室温下孵育 1 小时。
      1. 对于该缓冲液，准备一个玻璃容器并加入 0.605 g tris 缓冲液和 0.55 g 马来酸。加入 dH₂O 至 25 mL，并充分搅拌。稳定至 pH 8.3。储存在 4 °C。 有关详细信息，请参见 补充文件 1 （表 10）。
   3. 从试管中取出 tris-maleate 缓冲液，加入 200 μL AP 底物溶液。在室温下孵育 1 小时。确保样品保持在黑暗中。
      1. 对于该溶液，准备一个深色玻璃容器，加入 8 mg 重氮盐，并将其与 0.1 mL napthol-AS-TR-phosphate 的 N，N-二甲基甲酰胺溶液和 10 mL tris-马来酸盐缓冲液 （pH 8.3） 混合，充分搅拌。新鲜制备此溶液。有关详细信息，请参见补充文件 1 （表 11）。
   4. 去除 AP 底物溶液，通过添加和去除 200 μL dH₂O 清洗刻度 15 分钟，共 3 次。
   5. 从试管中取出刻度，将它们放入新的试管或孔中，用 200 μL 80% 甘油包裹在铝箔中，以避免褪色。储存在 4 °C。
   6. 要使用显微镜观察鳞片，请将鳞片放在凹面或凹陷的载玻片上。
      注意：TRAP 和 AP 染色中使用的大多数试剂可能有害。请参阅每种化学品的安全数据表。所有这些程序都需要妥善处理，例如适当的个人防护设备，包括一次性丁腈手套、安全眼镜/防溅护目镜和实验室外套。

5. 斑马鱼鳞片中的细胞动力学可视化

注意：可以使用一系列染色方法来可视化秤之间的差异并标记秤内的细胞（图 3B）。例如，下面概述了对细胞内细胞核和溶酶体进行染色的方法。

1. 用于细胞核可视化的 DAPI 染色
   注意：DAPI 用于通过标记 DNA 来标记所有细胞的细胞核。DAPI 是一种荧光标记物，与 DNA 序列中富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的区域强烈结合。
   1. 在使用 DAPI 之前，确保将秤固定在 4% 多聚甲醛中（步骤 3）。固定后，用 200 μL 1x PBS 清洗刻度 5 分钟。
   2. 按如下方式制备 1：10 稀释度的 DAPI 工作溶液。将 1 μL 的 DAPI 与 9 μL 的 1x PBS 混合，使总体积为 10 μL。
   3. 制备 DAPI 溶液后，使用镊子或塑料移液管将秤放在凹面载玻片上，去除多余的 PBS，并加入约 10 μL 制备的 DAPI 溶液。
      注意：DAPI 将立即对刻度进行染色，因此可以使用激发波长为 352-402 nm、发射波长为 417-477 nm 的荧光显微镜进行可视化。DAPI 会将所有细胞核染成亮蓝色。为了在视场中看到整个比例尺，使用了 4 倍物镜。使用 20 倍物镜可以看到单染色的细胞核。
   4. 计算 DAPI 染色的细胞核的数量，以确定刻度中的细胞数。
2. 用于活体样品中细胞死亡可视化的凋亡染色
   注：荧光染色剂可用于标记凋亡细胞。例如，此处使用的荧光标记物方案适用于酸性环境，可用于标记和示踪溶酶体等酸性细胞器。这些细胞器数量的增加与细胞死亡的增加相关。这种染色剂应应用于新鲜提取或已培养长达 2 天的未固定鳞片。
   1. 根据制造商的说明，使用培养基作为稀释剂，制备用于细胞凋亡追踪的荧光染色剂溶液。
      注：荧光染色剂的浓度可能会发生巨大变化，具体取决于所使用的细胞凋亡方法。有关推荐浓度的具体详细信息，请参阅所选染色剂的商业方案。
   2. 小心地从每根 0.2 mL 试管或 96 孔板的孔中取出培养基（如果之前培养过鳞片）。
   3. 添加足够的荧光染色溶液以覆盖整个刻度（约 50 μL）。
   4. 用铝箔覆盖所有试管以避免褪色并放置 30 分钟。
   5. 从试管或孔中取出荧光染色溶液。
   6. 向试管或孔中加入 200 μL 1x PBS 5 分钟，洗涤样品。
   7. 去除 PBS，向试管或孔中加入 200 μL 4% PFA，以在室温下将样品固定 1 小时。
   8. 向试管或孔中加入 200 μL 1x PBS 5 分钟，洗涤样品。
   9. 将秤转移到新的 0.2 mL 试管或孔中，并加入 200 μL 新鲜的 1x PBS。用铝箔覆盖这些试管/孔，以避免褪色。储存在 4 °C。
   10. 要使用荧光显微镜观察鳞片，请使用凹面或凹陷载玻片和正确的滤光片。此处使用的荧光信号的最大激发和发射波长为 577-590 nm。荧光染色显示含有溶酶体的凋亡细胞为红色。
   11. 计数染色细胞的数量，以确定经历细胞凋亡的细胞数量。
       注意：染色和储存时使用铝箔以避免褪色。样品可以在黑暗中储存数小时甚至数天，具体取决于使用的荧光染色剂。要延长荧光样品的储存时间，请使用与荧光染色剂兼容的固定和封固方案。所有荧光染色均使用至少 20 倍放大倍率的荧光显微镜进行可视化。使用的滤光片如下：对于 DAPI 417-477 nm;用于细胞凋亡追踪 577-590 nm。

结果

最近，这种规模培养方案被用于研究骨稳态¹¹。鳞片可以在培养基中存活至少 2 天。通过计数标记的细胞，在培养的每一天（最多三天）分析凋亡细胞的数量。这些结果表明，凋亡细胞在培养的第 3 天显著增加，表明使用此处描述的方法应将培养时间限制在两天。

比较鳞片形状和细胞分布，结果表明鳞片具有对称的形状和规则的细?...

讨论

斑马鱼鳞片是一种易于获得的 体外 模型，用于研究各种不同的生物过程，使用培养方法和培养箱可以维持长达 2 天，以模拟其自然环境¹¹。秤具有规则且按比例分布的细胞，使研究人员能够查看、计数和标记细胞，并使用基本的实验室设备进行简单的细胞生物学实验。此外，使用 4 倍物镜可以轻松看到整个细胞垢，这使得在实验过程中易于测量?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer