Zebra Balığı Ölçeklerinde Hücresel Dinamikleri İncelemek için İn Vitro Kültür Tekniği

Özet

Bu protokol, basit bir in vitro kültür tekniği kullanarak hücresel dinamikleri incelemek için bir yöntem sunar. Zebra balığı araştırmacıları ve eğitimcileri, ölçeklerdeki floresan çekirdekleri ve apoptotik hücreleri görselleştirerek kemik homeostazı ve temel hücre biyolojisi ile ilgili olanlar gibi hücresel süreçleri inceleme fırsatı sunar.

Özet

Zebra balığı pulları, eğitim ve araştırma amaçlı standart laboratuvarlarda kullanım için çeşitli avantajlar sunar. Pullar ötenaziye ihtiyaç duymadan kolayca toplanır, birkaç hafta içinde yenilenir ve yarı saydam ve küçüktür, bu da standart bir mikroskop kullanılarak görüntülenmelerine olanak tanır. Zebra balığı pulları, öğrencilerin özellikle hücresel dinamikleri ve in vitro kültür yöntemlerini anlama konusunda uygulamalı öğrenme deneyimlerine katılmaları için eşsiz bir fırsat sağladıkları için özellikle eğitim ortamlarında kullanışlıdır. Bu protokolün temel amacı, temel laboratuvar ekipmanı kullanılarak çeşitli biyolojik çalışmalarda kullanılmak üzere zebra balığı pullarının kültürde toplanması ve bakımı için bir yöntemi tanımlamaktır. Ek olarak, protokol, kemik rezorpsiyonu ve birikiminde rol oynayan kemik hücrelerinin aktivitesini inceleyerek kemik homeostazını anlamada kullanımlarını detaylandırır. Ayrıca, çekirdeklerin ve apoptotik hücrelerin görselleştirilmesi gibi genel teknikler için ek protokoller içerir. İn vitro kültür protokolü, minimum reaktif ve ekipmanla güvenilir sonuçlar verir. Bu makale, bilimsel araştırmayı teşvik etmek için zebra balığı pullarının in vitro kültürlerini kullanmanın faydalarını tartışmakta ve bunların eğitim ortamlarına entegrasyonunu desteklemek için gereken kaynakları özetlemektedir.

Giriş

Son yıllarda, zebra balığı (Danio rerio) genetik, gelişim biyolojisi ve toksikoloji dahil olmak üzere çeşitli bilimsel alanlarda değerli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır ^1,2,3. Zebra balığı, Güneydoğu Asya nehirlerine özgü küçük tropikal tatlı su balıklarıdır⁴. Kolay bakımları, küçük boyutları, hızlı üreme döngüleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle biyolojide popüler bir model organizma haline gelmişlerdir¹. Bu, iç gelişimlerinin kolayca gözlemlenmesini sağlar ve bu da onları gelişim biyolojisindeki çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için ideal hale getirir. Zebra balığı insanlarla genetik benzerlikler paylaşır; İnsan genlerinin yaklaşık% 70'inin en az bir zebra balığı muadili vardır, bu da onları insanlarda genetik bozuklukları ve hastalıkları incelemek için mükemmel bir model haline getirir ^5,6. Araştırmacılar, zebra balıklarındaki belirli genleri manipüle ederek, genlerin işlevi ve davranışı hakkında değerli bilgiler edinebilir ve bu daha sonra insan sağlığı araştırmalarına⁶, gen düzenlemeye ve transgenik hatların^{oluşturulmasına 7,8} uygulanabilir.

Zebra balığı pulları^{çıkarıldıktan sonra yeniden} doğar ^9,10 ve deneyler için kullanılırken bazik (CO₂ olmayan) bir inkübatör ile bir ila üç gün boyunca kültürlenebilir¹¹. Zebra balığı pullarının kullanımı, anestezi uygulanmış balıklardan ötenaziye gerek kalmadan çıkarılabildiği için temel laboratuvarlarda avantajlıdır. Zebra balığı pulları, esas olarak iki katmandan oluşan dermal iskeletin bir bileşenidir: kalın ve kollajen fibril katmanları tarafından oluşturulan kısmen mineralize dokudan yapılmış iç katman ve yüksek oranda mineralize olan ve iç içe geçmiş kollajen fibrillerinden oluşan bir ağ içeren dış katman^12,13 (Şekil 1A-C). Ölçeğin bu morfolojik ve hücresel özellikleri, standart bir bileşik mikroskop altında kolayca gözlemlenebilir. Bu özellikler, zebra balığı pullarını hücresel ve moleküler incelemek için iyi bir model haline getirir. Örneğin, zebra balığı pulları, kemik hücresi aktivitesi^11,12 dahil olmak üzere kemik homeostazını incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca doku rejenerasyonunu ^9,14,15, gen yollarını ve sinyalleşmeyi^14,16, metabolizmayı¹⁷, mikrobiyota çalışmalarını¹⁸ vb. anlamak için de kullanılmıştır. Zebra balığı, diğer teleostlara benzer şekilde, kirleticiler ve toksinler gibi çevresel faktörlere karşı da oldukça hassastır 19,20,21,22. Bu nedenle, balık popülasyonlarındaki toksinlere maruz kalmayı incelemek için balık pulları kullanılır. Bu özellikler, ölçekleri öğrencilere çevresel faktörlerin canlı organizmalar üzerindeki etkilerini öğretmek için mükemmel bir model haline getirir. Ek olarak, Tg(osterix:mCherry) ve Tg(runx2a:GFP) gibi transgenik zebra balığı hatlarından elde edilen ölçekler, öğrenci deneylerine başka bir karmaşıklık düzeyi ekleyebilir.

Özetle, araştırmacılar zebra balığı pullarını kullanarak, hücresel mekanizmalardan çevresel değişikliklere kadar biyolojinin çeşitli yönlerini incelemek için deneyler tasarlayabilir ve yürütebilirler. Zebra balığı, deneysel tasarım, veri toplama ve analizde uygulamalı deneyimler sağlayabildikleri için yüksek öğrenimde de değerli bir kaynaktır. Zebra balığı, belirli ilgi alanlarını keşfetmek için ileri düzey kurslarda ve araştırma odaklı programlarda da kullanılabilir. Bu makale, zebra balığı pullarını araştırma ve sınıf öğrenme ortamlarında kullanmak için bir protokol açıklamaktadır.

Protokol

Burada açıklanan tüm protokoller Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerini takip eder ve Saint Mary's Üniversitesi / Mount Saint Vincent Üniversitesi Hayvan Bakımı komitesi tarafından 20-14 ve 21-12 protokol numaraları altında yıllık olarak onaylanmıştır. Bu protokolü gerçekleştirmeden önce, kullanıcılar hayvanların araştırma veya öğretimde kullanılmasına ilişkin federal ve eyalet yönergelerine uyulduğundan emin olmalıdır²³. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ölçek kültürü için reaktiflerin hazırlanması

1. DMEM ortamını HEPES (10 g DMEM tozu, 5.95 g HEPES, 1 L damıtılmış su veya dH₂O, pH: 6.91) ile hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
2. Deneyin yapıldığı gün ihtiyaç duyulan hacme ayarlanmış kültür ortamı çalışma solüsyonunu (HEPES ile% 88 DMEM ortamı,% 10 fetal sığır serumu ve% 2 penisilin-streptomisin [mL başına 5000 ünite penisilin ve 5 mg streptomisin] hazırlayın.
   NOT: Çalışma solüsyonu günlük olarak taze olarak hazırlanmalıdır ve saklanamaz. Kültür ortamı kullanılana kadar soğuk tutulmalıdır (4 °C'de veya buz üzerinde).
3. Kültür ortamı çalışma solüsyonunu, deneyin gerçekleştirileceği kaplara alikot edin. Bu durumda, 0.2 mL'lik tüpler veya 96 oyuklu bir plaka kullanıldı. Bu alikotları gerekene kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu çözelti taze olarak hazırlanmalı ve 1 günden fazla saklanamaz. Tüm reaktifler için Tablo 1'e bakın.

2. Canlı balıklardan pulların çıkarılması

1. Zebra balığı için 4-5 yetişkin balık için yaklaşık 2 L su hacmine sahip bir kap veya tank hazırlayın.
   NOT: Zebra balığı için uygun olan suyun tipik parametreleri pH 7.5, sıcaklık 28.5 °C, iletkenlik 640-781 μS ve 12-12 saatlik karanlık ışık döngüsüdür. Tankta sıcaklığın sürekli olarak korunduğundan emin olun.
2. 4-5 yetişkin zebra balığını yakalamak için bir balık ağı kullanın ve bunları yukarıda hazırlanan zebra balığı tutma tankına yerleştirin.
3. Balığın uyuşturulacağı en az 60 mL su içeren bir kap hazırlayın.
   NOT: Balıklar kabın içinde hareket edebilmeli ve dışarı atlamalarını önleyecek kadar derin olmalıdır. Bu kap, zebra balığı suyundan oluşması gereken tamponlu %0.01 trikain metan-sülfonat (MS222) içermelidir (300 mL zebra balığı su sisteminde 0.3 g MS222, 615 μL 1 M NaOH ile hazırlanan %0.1 MS222'yi on kez seyreltin).
   DİKKAT: Bu deneyleri yapan kişiler, zebra balıklarını yakalamak, uyuşturmak ve işlemek için kurumsal hayvan etik kurulunun onayına sahip olmalıdır. Benzer şekilde, kullanılan anestezik, balık biyolojisinde yaygın olarak kullanılan ancak tek kullanımlık nitril eldivenler, koruyucu gözlükler/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektiren bir kimyasal olan düşük konsantrasyonda trikain metan-sülfonattır (MS222) (Daha fazla bilgi için MS222 güvenlik veri sayfasına bakın).
4. Daha önce 1. adımda kullanılanla aynı özelliklere sahip bir geri kazanım kabı hazırlayın (en az 2 L su), kireç çıkarıldıktan sonra balığın yerleştirileceği yer. Bu kap, yukarıda belirtildiği gibi yeterli alana ve doğru su parametrelerine sahip olmalıdır.
5. Bir ağ kullanarak, tek bir yetişkin zebra balığını dikkatlice %0,01 MS222 içeren kaba aktarın. Balık tamamen hareketsiz olana ve minimum operküler harekete sahip olana kadar bekleyin (bu genellikle 10 dakikadan az sürer).
   NOT: Bu adımın tamamı her seferinde bir balık tarafından gerçekleştirilir. Pullar işlenmekte olan balıktan başarılı bir şekilde çıkarılana ve bu balık kurtarma kabına aktarılana kadar bir sonraki balığı uyuşturmayın.
6. Yetişkin zebra balığını ıslak bir kağıt havluyla kaplı ters çevrilmiş bir Petri kabına ayrı ayrı yerleştirin.
7. Diseksiyon stereomikroskopu altında ve ince forseps kullanarak, tek bir balıktan en fazla 10-12 pul çıkarın. Pullar, pulların vücudun diğer kısımlarına kıyasla daha büyük ve daha sabit bir boyuta sahip olduğu balığın yan bölgesinden çıkarılır (Şekil 2). Balığın her iki tarafı da kullanılabilir.
   1. Ölçeğin doğal yönünde (yani önden arkaya doğru yönde) hafifçe çekerek ölçekleri birer birer çıkarın. Bu mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
8. Ölçeklerin bozulmasını önlemek için her bir ölçeği, ölçek kültürü ortam işleme solüsyonunu (adım 1.1'de hazırlanan) içeren ayrı bir 0,2 mL'lik tüpe yerleştirin. Alternatif olarak 96 oyuklu bir plaka kullanılabilir.
   NOT: Ayrı ölçeklerin ayrı tüplerde veya kuyucuklarda izole edilmesi, ölçeklerin birbirine yapışmasını önler ve birden fazla deney için gerekli olabilecek bireysel ölçeklerin izlenmesine olanak tanır.
9. Spesifik deney bir ölçek tedavisi gerektiriyorsa, bu adımda uygulayın. Bazı protokollerin örnekleri için adım 4 ve 5'e bakın.
10. Tüpleri terazilerle birlikte 28 °C'de bir inkübatörün içine koyun. Kültür ortamı her 24 saatte bir değiştirilmelidir (kültür ortamı çalışma çözümü ile). Burada özetlenen deneyler için CO₂ olmayan bir inkübatör kullanıldı.
11. Kireci çıkardıktan sonra, zebra balığını dikkatlice kurtarma tankına geri koyun ve hareket devam edene kadar izleyin. Geri kazanımı hızlandırmak için tankta hava sağlamak için bir pipet veya havalandırma taşı kullanılır.
12. Hareket yeniden sağlandığında, zebra balığını normal bir yetiştirme tankına geri koyun. Kullanılan balıkları diğer balıklardan ayrı tutmayı unutmayın, böylece ayrı ayrı iyileşebilirler ve hangi balıkların pullarını aktif olarak yenilediğini takip edebilirsiniz.
13. Aynı balıklardan pul çıkarma işlemini tekrarlamadan önce ~ 2 hafta bekleyin. Bu, pullarını doğal olarak yenilemeleri için zaman tanır.

3. Ölçeklerin sabitlenmesi

1. Terazileri 10x PBS'den hazırlanan 200 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın (1 L için 80 g NaCl, 2 g KCl ve 11.2 g Na₂HPO₄ ekleyin, 1 L'ye kadar dH₂O ekleyin).
2. 1x PBS'yi çıkarın ve gece boyunca 4 °C'de 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 100 ml PFA için 4 g paraformaldehit ve 0.1 g NaOH ekleyin, ardından 100 mL'ye kadar 1x PBS ekleyin. Düşük ısıya ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde karıştırın ve çözelti berraklaşana kadar karıştırın, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin ve pH'ı 7.4'e sabitleyin. -20 °C'de saklayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 1) bakın.
3. Fiksasyondan sonra, teraziyi 200 μL 1x PBS ile üç kez yıkayın. Tartıları 4 °C'de saklayın.
   DİKKAT: PFA zararlıdır. Daha fazla bilgi için güvenlik bilgi formuna bakın. Tüm bu işlemler, tek kullanımlık nitril eldivenler, güvenlik gözlükleri/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektirir.

4. Kemik homeostazı

NOT: Aşağıda iki kemik homeostazı prosedürü açıklanmıştır. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) ve alkalin fosfat (AP) boyaması tipik olarak sırasıyla aktif osteoklastları ve osteoblastları tanımlamak için kullanılır. Osteoklastlar kemik matrisini emerken osteoblastlar kemik matrisini biriktirir. AP, kemik oluşumu sırasında osteoblastlar tarafından salınan ana enzimdir, TRAP ise osteoklastlar tarafından osteoklast ve kemik matrisi arasındaki asidik boşluğa salgılanır ve kemik parçalanmasına ve emilimine yardımcı olur 24,25,26. Bu protokol Zebra Balığı Bilgi Ağı^27'dede mevcuttur ve daha önce^{yayınlanmıştır 28}. Alkalin fosfataz, metabolik sürecin bir parçası olarak birden fazla hücre tipi tarafından üretilen bir enzimdir. Bu işlem tamamen osteoblastlara özgü değildir, ancak kemik dokusunda osteoblast fonksiyonu için bir belirteç olarak kullanılır.

1. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyaması
   1. Her sabit teraziyi 0.2 mL'lik bir tüpe veya 200 μL dH₂O içeren 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 2) bakın.
   2. Ölçekleri 0.2 mL'lik tüpten veya kuyucuktan çıkarın ve 200 μL 50 mM tartrat tamponu içeren yeni bir tüpe yerleştirin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      1. 100 mM tartrat tamponu için bir cam kap hazırlayın, 2.3 g tartarik asit ekleyin ve 100 mL çözeltiye kadar 0.2 M asetat tamponu (pH 5.5) ile karıştırın. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın. 50 mM tartrat tamponu hazırlamak için eşit hacimlerde_dH2Ove 100 mM tartrat tamponu ekleyin. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e bakın (Tablo 3 ve Tablo 4).
   3. Tartarat tamponunu tüpten çıkarın ve 200 μL TRAP substrat çözeltisi ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin karanlıkta kaldığından emin olun.
      1. Koyu renkli bir cam kap hazırlayın ve 30 mL 100 mM tartrat tamponu, 1 mL heksazotize PRS (Pararosanilin hidroklorür çözeltisi) ve 2 mL enzim substrat çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın.
         NOT: Bu çözüm saklanamaz; Kullanırken karanlıkta oda sıcaklığında tutun. TRAP substrat çözeltisini hazırlamak için gereken çözümler için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 5-9) bakın.
   4. TRAP substrat solüsyonunu çıkarın ve üç kez 15 dakika boyunca yaklaşık 150 μL dH₂O ekleyip çıkararak pulları yıkayın.
   5. Pulları tüpten çıkarın ve solmayı önlemek için alüminyum folyoya sarılmış 200 μL %80 gliserol (100 mL için, 80 mL gliserol ile 20 mL dH₂O karıştırın) ile yeni bir tüpe veya kuyuya yerleştirin ve 4 °C'de saklayın.
   6. Ölçekleri mikroskop altında görselleştirmek için bir çöküntü veya içbükey slayt kullanın.
2. Alkali fosfat (AP) boyama
   1. Her bir sabit ölçeği 200 μL dH₂O içeren 0.2 mL'lik bir tüpe veya 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve üç kez 15 dakika boyunca yaklaşık 150 μL dH₂O ekleyip çıkararak yıkayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 2) bakın.
   2. Ölçekleri 0.2 mL'lik tüplerden veya kuyulardan çıkarın ve 200 μL tris-maleat tamponu içeren yeni bir tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      1. Bu tampon için bir cam kap hazırlayın ve 0.605 g tris tamponu ve 0.55 g maleik asit ekleyin. 25 mL'ye kadar dH₂O ekleyin ve iyice karıştırın. PH 8.3'e stabilize edin. 4 °C'de saklayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 10) bakın.
   3. Tris-maleat tamponunu tüpten çıkarın ve 200 μL AP substrat çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin karanlıkta kaldığından emin olun.
      1. Bu çözelti için koyu renkli bir cam kap hazırlayın, 8 mg diazonyum tuzu ekleyin ve N, N-dimetilformamid içinde 0.1 mL naftol-AS-TR-fosfat ve 10 mL tris-maleat tamponu (pH 8.3) ile karıştırın, iyice karıştırın. Bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın. Ayrıntılar için lütfen Ek Dosya 1'e (Tablo 11) bakın.
   4. AP substrat solüsyonunu çıkarın ve 200 μL dH_2Oekleyip çıkararak 15 dakika boyunca üç kez pulları yıkayın.
   5. Pulları tüpten çıkarın ve solmayı önlemek için alüminyum folyoya sarılmış 200 μL %80 gliserol ile yeni bir tüpe veya kuyuya yerleştirin. 4 °C'de saklayın.
   6. Ölçekleri bir mikroskop kullanarak görselleştirmek için, ölçekleri içbükey veya çöküntü slaytına yerleştirin.
      DİKKAT: TRAP ve AP boyamada kullanılan reaktiflerin çoğu zararlı olabilir. Her kimyasal için güvenlik bilgi formuna bakın. Tüm bu prosedürler, tek kullanımlık nitril eldivenler, güvenlik gözlükleri/sıçrama gözlükleri ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman gibi uygun kullanım gerektirir.

5. Hücre dinamiğinin zebra balığı pullarında görselleştirilmesi

NOT: Ölçekler arasındaki farkları görselleştirmek ve ölçek içindeki hücreleri etiketlemek için bir dizi boyama yöntemi kullanılabilir (Şekil 3B). Örneğin, ölçeğin hücreleri içindeki çekirdekleri ve lizozomları boyama yöntemleri aşağıda özetlenmiştir.

1. Hücre çekirdeği görselleştirmesi için DAPI boyama
   NOT: DAPI, DNA'yı etiketleyerek tüm hücrelerin çekirdeklerini işaretlemek için kullanılır. DAPI, DNA dizilerinde adenin ve timin açısından zenginleştirilmiş bölgelere güçlü bir şekilde bağlanan bir floresan belirteçtir.
   1. DAPI'yi kullanmadan önce, ölçeklerin %4 paraformaldehit içinde sabitlendiğinden emin olun (adım 3). Sabitledikten sonra tartıları 200 μL 1x PBS ile 5 dakika yıkayın.
   2. Aşağıdaki gibi 1:10 seyreltmede bir DAPI çalışma çözeltisi hazırlayın. Toplam hacmi 10 μL elde etmek için 1 μL DAPI'yi 9 μL 1x PBS ile karıştırın.
   3. DAPI çözeltisini hazırladıktan sonra, teraziyi içbükey bir lam üzerine koymak için forseps veya plastik bir pipet kullanın, fazla PBS'yi çıkarın ve hazırlanan DAPI çözeltisinden yaklaşık 10 μL ekleyin.
      NOT: DAPI, ölçeği hemen lekeleyecektir, böylece 352-402 nm uyarma dalga boyuna ve 417-477 nm emisyon dalga boyuna sahip bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. DAPI, tüm hücre çekirdeklerini parlak mavi renkte boyayacaktır. Görüş alanındaki ölçeğin tamamını görebilmek için 4x objektif kullanılmıştır. Tek lekeli çekirdekler, 20x objektif kullanılarak görülebilir.
   4. Ölçekteki hücre sayısını belirlemek için DAPI ile boyanmış çekirdeklerin sayısını sayın.
2. Canlı örneklerde hücre ölümü görselleştirmesi için apoptotik boyama
   NOT: Floresan lekeler apoptotik hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Örneğin, burada kullanılan floresan işaretleyici protokolü asidik ortamlar içindir ve lizozomlar gibi asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılabilir. Bu organellerin sayısındaki artış, artan hücre ölümü ile ilişkilidir. Bu leke, yeni çekilmiş veya 2 güne kadar kültürlenmiş sabitlenmemiş pullara uygulanmalıdır.
   1. Seyreltici olarak kültür ortamını kullanarak üreticinin talimatlarına göre apoptoz takibi için bir floresan lekesi çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Floresan lekenin konsantrasyonu, kullanılan apoptoz yöntemine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Önerilen konsantrasyonlarla ilgili özel ayrıntılar için tercih edilen leke için ticari protokole bakın.
   2. Ölçekler daha önce kültürlenmişse, kültür ortamını her 0.2 mL'lik tüpten veya 96 oyuklu bir plakadan dikkatlice çıkarın.
   3. Tüm ölçeği kaplayacak kadar floresan boyama solüsyonu ekleyin (yaklaşık 50 μL).
   4. Solmayı önlemek için tüm tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 30 dakika bekletin.
   5. Floresan boyama solüsyonunu tüplerden veya kuyucuklardan çıkarın.
   6. Tüplere veya kuyucuklara 200 μL 1x PBS ekleyerek numuneleri 5 dakika boyunca yıkayın.
   7. PBS'yi çıkarın ve numuneleri oda sıcaklığında 1 saat sabitlemek için tüplere veya kuyucuklara 200 μL %4 PFA ekleyin.
   8. Tüplere veya kuyucuklara 200 μL 1x PBS ekleyerek numuneleri 5 dakika boyunca yıkayın.
   9. Ölçekleri yeni bir 0.2 mL tüpe veya kuyuya aktarın ve 200 μL taze 1x PBS ekleyin. Solmayı önlemek için bu tüpleri/kuyuları alüminyum folyo ile örtün. 4 °C'de saklayın.
   10. Ölçekleri bir floresan mikroskobu ile görselleştirmek için içbükey veya çöküntü lamı ve doğru filtreyi kullanın. Burada kullanılan floresan sinyali, maksimum 577-590 nm'lik bir uyarma ve emisyona sahiptir. Floresan boya, kırmızı renkte lizozom içeren apoptotik hücreleri gösterir.
   11. Apoptoz geçiren hücrelerin sayısını belirlemek için lekeli hücrelerin sayısını sayın.
       NOT: Alüminyum folyo, solmayı önlemek için boyama ve saklama sırasında kullanılır. Numuneler, hangi floresan lekenin kullanıldığına bağlı olarak karanlıkta birkaç saat hatta günlerce saklanabilir. Floresan numuneleri daha uzun süre saklamak için, floresan leke ile uyumlu bir sabitleme ve montaj protokolü kullanın. Tüm floresan boyama, en az 20x büyütmeli bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Kullanılan filtre şu şekildeydi: DAPI 417-477 nm için; apoptoz takibi için 577-590 nm.

Sonuçlar

Son zamanlarda, bu ölçek kültür protokolü kemik homeostazını incelemek için kullanıldı¹¹. Ölçekler kültür ortamında en az 2 gün hayatta kalabilir. Apoptotik hücrelerin sayısı, etiketli hücreler sayılarak, kültürün her gününde, en fazla üç güne kadar analiz edildi. Bu sonuçlar, apoptotik hücrelerin kültürlemenin üçüncü gününde önemli ölçüde arttığını gösterdi, bu da kültür süresinin burada açıklanan yöntem kulla...

Tartışmalar

Zebra balığı pulları, doğal ortamlarını simüle etmek için bir kültür yöntemi ve bir kuluçka makinesi kullanılarak 2 güne kadar sürdürülebilen çeşitli farklı biyolojik süreçleri incelemek için kolayca erişilebilir bir in vitro modeldir¹¹. Ölçekler, araştırmacıların hücreleri görüntülemesine, saymasına ve etiketlemesine ve temel laboratuvar ekipmanını kullanarak basit hücre biyolojisi deneyleri yapmasına olanak tanıy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer