Метод культивирования in vitro для изучения клеточной динамики чешуи рыбок данио

Резюме

Этот протокол предлагает метод изучения клеточной динамики с использованием простой техники культивирования in vitro . Это дает возможность исследователям и преподавателям рыбок данио изучать клеточные процессы, такие как те, которые связаны с гомеостазом костей и основами клеточной биологии, визуализируя флуоресцентные ядра и апоптотические клетки в чешуйках.

Аннотация

Чешуя рыбок данио обладает целым рядом преимуществ для использования в стандартных лабораториях в учебных и исследовательских целях. Чешуйки легко собираются без необходимости эвтаназии, регенерируются в течение пары недель, а также полупрозрачные и небольшие, что позволяет рассматривать их с помощью стандартного микроскопа. Чешуя рыбок данио особенно полезна в образовательной среде, поскольку она предоставляет учащимся уникальную возможность участвовать в практическом обучении, особенно в понимании клеточной динамики и методов культивирования in vitro . Основной целью данного протокола является описание метода сбора и поддержания чешуи рыбок данио в культуре для использования в различных биологических исследованиях с использованием базового лабораторного оборудования. Кроме того, в протоколе подробно описывается их использование для понимания костного гомеостаза путем изучения активности костных клеток, участвующих в резорбции и отложении костей. Он также включает в себя дополнительные протоколы для общих методов, таких как визуализация ядер и апоптотических клеток. Протокол культивирования in vitro дает надежные результаты с минимальным количеством реагентов и оборудования. В этой статье обсуждаются преимущества использования in vitro культур чешуи данио рерио для стимулирования научных исследований и описываются ресурсы, необходимые для поддержки их интеграции в образовательные учреждения.

Введение

В последние годы рыбки данио (Danio rerio) стали ценным модельным организмом в различных научных областях, включая генетику, биологию развития и токсикологию ^1,2,3. Данио-рерио – это небольшие тропические пресноводные рыбы, обитающие в реках Юго-Восточной Азии⁴. Они стали популярным модельным организмом в биологии благодаря своей простоте в уходе, небольшому размеру, быстрому репродуктивному^{циклу и} полупрозрачным эмбрионам. Это позволяет легко наблюдать за их внутренним развитием, что д....

протокол

Все описанные здесь протоколы соответствуют рекомендациям Канадского совета по уходу за животными и ежегодно утверждаются комитетом по уходу за животными Университета Святой Марии/Университета Маунт-Сент-Винсент под номерами протоколов 20-14 и 21-12. Прежде чем выполнять этот протокол, пользователи должны убедиться в том, что федеральные и провинциальные рекомендации по использованию животных в научных исследованиях или обучении соблюдаются^. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. П....

Результаты

Недавно этот протокол культивирования шкалы был использован для изучения костного гомеостаза¹¹. Чешуйки могут сохраняться в питательной среде не менее 2 суток. Количество апоптотических клеток анализировалось в каждый день культивирования, максимум в т?.......

Обсуждение

Чешуя рыбок данио является легкодоступной моделью in vitro для изучения множества различных биологических процессов, которые могут поддерживаться до 2 дней с использованием метода культивирования и инкубатора для моделирования их естественной среды^{обит.......}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer