Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Резюме

Этот протокол предлагает метод изучения клеточной динамики с использованием простой техники культивирования in vitro . Это дает возможность исследователям и преподавателям рыбок данио изучать клеточные процессы, такие как те, которые связаны с гомеостазом костей и основами клеточной биологии, визуализируя флуоресцентные ядра и апоптотические клетки в чешуйках.

Аннотация

Чешуя рыбок данио обладает целым рядом преимуществ для использования в стандартных лабораториях в учебных и исследовательских целях. Чешуйки легко собираются без необходимости эвтаназии, регенерируются в течение пары недель, а также полупрозрачные и небольшие, что позволяет рассматривать их с помощью стандартного микроскопа. Чешуя рыбок данио особенно полезна в образовательной среде, поскольку она предоставляет учащимся уникальную возможность участвовать в практическом обучении, особенно в понимании клеточной динамики и методов культивирования in vitro . Основной целью данного протокола является описание метода сбора и поддержания чешуи рыбок данио в культуре для использования в различных биологических исследованиях с использованием базового лабораторного оборудования. Кроме того, в протоколе подробно описывается их использование для понимания костного гомеостаза путем изучения активности костных клеток, участвующих в резорбции и отложении костей. Он также включает в себя дополнительные протоколы для общих методов, таких как визуализация ядер и апоптотических клеток. Протокол культивирования in vitro дает надежные результаты с минимальным количеством реагентов и оборудования. В этой статье обсуждаются преимущества использования in vitro культур чешуи данио рерио для стимулирования научных исследований и описываются ресурсы, необходимые для поддержки их интеграции в образовательные учреждения.

Введение

В последние годы рыбки данио (Danio rerio) стали ценным модельным организмом в различных научных областях, включая генетику, биологию развития и токсикологию 1,2,3. Данио-рерио – это небольшие тропические пресноводные рыбы, обитающие в реках Юго-Восточной Азии4. Они стали популярным модельным организмом в биологии благодаря своей простоте в уходе, небольшому размеру, быстрому репродуктивномуциклу и полупрозрачным эмбрионам. Это позволяет легко наблюдать за их внутренним развитием, что д....

протокол

Все описанные здесь протоколы соответствуют рекомендациям Канадского совета по уходу за животными и ежегодно утверждаются комитетом по уходу за животными Университета Святой Марии/Университета Маунт-Сент-Винсент под номерами протоколов 20-14 и 21-12. Прежде чем выполнять этот протокол, пользователи должны убедиться в том, что федеральные и провинциальные рекомендации по использованию животных в научных исследованиях или обучении соблюдаются. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. П....

Результаты

Недавно этот протокол культивирования шкалы был использован для изучения костного гомеостаза11. Чешуйки могут сохраняться в питательной среде не менее 2 суток. Количество апоптотических клеток анализировалось в каждый день культивирования, максимум в т?.......

Обсуждение

Чешуя рыбок данио является легкодоступной моделью in vitro для изучения множества различных биологических процессов, которые могут поддерживаться до 2 дней с использованием метода культивирования и инкубатора для моделирования их естественной средыобит.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят персонал водного объекта Университета Маунт-Сент-Винсент и всех членов лаборатории развития костей Франца-Одендаля за обеспечение необходимого ухода за рыбами. Выражаем особую благодарность Алише Макнил (Alisha McNeil), Кили А. Маклеллан (Keely A. MacLellan) и Ширин Джеради (Shirine Jeradi) за помощь в оптимизации некоторых протоколов. Это исследование было поддержано Канадским космическим агентством (CSA) [19HLSRM01] и Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubesn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4For pH stabilization and prepration of PRS
Concave sliden/an/a
DAPIVectashieldH-1200For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)SigmaD9805For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder Sigma D5523For scale culture media 
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma E10521For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum Sigma F4135For scale culture media 
Fluorescence microscopen/an/a
Glacial acetic acid Fisher A38 212For acetate buffer
GlycerolVWRBDH1172-4LPFor 80% glycerol - storage scales
HEPES ThermoFisher 15630106For scale culture media 
Hot platen/an/a
KCl SigmaP217-10For preparation of PBS
LysotrackerThermoFisherL7528For lysosomes  visualization
Maleic acidSigmaM0375For Tris-Maleate buffer 
Micropipetten/an/a
N,N-dimethylformamideSigma319937For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide Sigma319937For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4 EMDSX0720-1For preparation of PBS
NaCl Sigma S9888For preparation of PBS
NaNO2SigmaS-2252For 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881For preparation of 4% PFA
NaOH Sigma S5881For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphateSigmaN6125For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate SigmaN6125For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride SigmaP3750For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/mlThermoFisher 15140122For scale culture media 
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.n/an/a
PFA Sigma P6148For scale fixation
Sodium acetate Sigma S2889For acetate buffer
Standard compound microscopen/an/a
Stir platen/an/a
Tartaric acidSigmaT6521For Tartrate buffer
Tris baseRoche03 118 142 001For Tris-Maleate buffer 

Ссылки

  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее