Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Riepilogo

Questo protocollo offre un metodo per studiare la dinamica cellulare utilizzando una semplice tecnica di coltura in vitro . Offre ai ricercatori e agli educatori del pesce zebra l'opportunità di studiare i processi cellulari, come quelli legati all'omeostasi ossea e alla biologia cellulare di base, visualizzando nuclei fluorescenti e cellule apoptotiche all'interno delle squame.

Abstract

Le squame di zebrafish offrono una serie di vantaggi per l'uso in laboratori standard per scopi didattici e di ricerca. Le squame possono essere facilmente raccolte senza la necessità di eutanasia, si rigenerano entro un paio di settimane e sono traslucide e piccole, consentendo di visualizzarle utilizzando un microscopio standard. Le squame di pesce zebra sono particolarmente utili negli ambienti educativi, in quanto offrono agli studenti un'opportunità unica di impegnarsi in esperienze di apprendimento pratico, in particolare nella comprensione delle dinamiche cellulari e dei metodi di coltura in vitro . L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per la raccolta e il mantenimento delle squame di zebrafish in coltura da utilizzare in una varietà di studi biologici utilizzando attrezzature di laboratorio di base. Inoltre, il protocollo descrive in dettaglio il loro utilizzo nella comprensione dell'omeostasi ossea esaminando l'attività delle cellule ossee coinvolte nel riassorbimento e nella deposizione ossea. Include anche protocolli aggiuntivi per tecniche generali, come la visualizzazione di nuclei e cellule apoptotiche. Il protocollo di coltura in vitro produce risultati affidabili con reagenti e attrezzature minimi. Questo articolo discute i vantaggi dell'utilizzo di colture in vitro di squame di pesce zebra per promuovere la ricerca scientifica e delinea le risorse necessarie per sostenere la loro integrazione nei contesti educativi.

Introduzione

Negli ultimi anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un prezioso organismo modello in vari campi scientifici, tra cui la genetica, la biologia dello sviluppo e la tossicologia ^1,2,3. I pesci zebra sono piccoli pesci tropicali d'acqua dolce originari dei fiumi del sud-est asiatico⁴. Sono diventati un popolare organismo modello in biologia grazie alla loro facile manutenzione, alle piccole dimensioni, al rapido ciclo riproduttivo e agli embrioni traslucidi¹. Ciò consente una faci....

Protocollo

Tutti i protocolli qui descritti seguono le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono stati approvati annualmente dal comitato per la cura degli animali della Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University con i numeri di protocollo 20-14 e 21-12. Prima di attuare questo protocollo, gli utenti devono assicurarsi che vengano seguite le linee guida federali e provinciali sull'uso degli animali nella ricerca o nell'insegnamento²³. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

Discussione

Le squame di zebrafish sono un modello in vitro facilmente accessibile per studiare una varietà di processi biologici diversi che possono essere mantenuti per un massimo di 2 giorni utilizzando un metodo di coltura e un'incubatrice per simulare il loro ambiente naturale¹¹. Le bilance hanno una distribuzione regolare e proporzionale delle cellule presenti, che consente ai ricercatori di visualizzare, contare ed etichettare le cellule e di condurre semplic.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer