Technique d’élevage in vitro pour l’étude de la dynamique cellulaire dans les écailles de poisson-zèbre

Résumé

Ce protocole propose une méthode pour étudier la dynamique cellulaire à l’aide d’une technique de culture in vitro simple. Il offre aux chercheurs et aux éducateurs du poisson-zèbre l’occasion d’étudier les processus cellulaires, tels que ceux liés à l’homéostasie osseuse et à la biologie cellulaire de base, en visualisant les noyaux fluorescents et les cellules apoptotiques à l’intérieur des échelles.

Résumé

Les écailles de poisson-zèbre offrent une variété d’avantages pour une utilisation dans les laboratoires standard à des fins d’enseignement et de recherche. Les écailles sont facilement collectées sans qu’il soit nécessaire de les euthanasier, se régénèrent en quelques semaines et sont translucides et petites, ce qui permet de les observer à l’aide d’un microscope standard. Les écailles de poisson-zèbre sont particulièrement utiles dans les environnements éducatifs, car elles offrent aux étudiants une occasion unique de s’engager dans des expériences d’apprentissage pratiques, en particulier dans la compréhension de la dynamique cellulaire et des méthodes de culture in vitro . L’objectif principal de ce protocole est de décrire une méthode de collecte et de conservation des écailles de poisson-zèbre en élevage pour une utilisation dans une variété d’études biologiques à l’aide d’équipements de laboratoire de base. De plus, le protocole détaille leur utilisation dans la compréhension de l’homéostasie osseuse en examinant l’activité des cellules osseuses impliquées dans la résorption et le dépôt osseux. Il comprend également des protocoles supplémentaires pour des techniques générales, telles que la visualisation des noyaux et des cellules apoptotiques. Le protocole de culture in vitro produit des résultats fiables avec un minimum de réactifs et d’équipements. Cet article traite des avantages de l’utilisation de cultures in vitro d’écailles de poisson-zèbre pour favoriser la recherche scientifique et décrit les ressources nécessaires pour soutenir leur intégration dans les milieux éducatifs.

Introduction

Ces dernières années, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle précieux dans divers domaines scientifiques, notamment la génétique, la biologie du développement et la toxicologie ^1,2,3. Le poisson-zèbre est un petit poisson tropical d’eau douce originaire des rivières d’Asie du Sud-Est⁴. Ils sont devenus un organisme modèle populaire en biologie en raison de leur entretien facile, de leur petite taille, de leur cycle de reproduction rapide et de leurs embryons translucides

Protocole

Tous les protocoles décrits ici suivent les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvés chaque année par le comité de protection des animaux de l’Université Saint Mary’s et de l’Université Mount Saint Vincent sous les numéros de protocole 20-14 et 21-12. Avant d’appliquer ce protocole, les utilisateurs doivent s’assurer que les lignes directrices fédérales et provinciales sur l’utilisation des animaux en recherche ou en enseignement sont respectées²³. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux<....

Discussion

Les écailles de poisson-zèbre sont un modèle in vitro facilement accessible pour étudier une variété de processus biologiques différents qui peuvent être maintenus jusqu’à 2 jours à l’aide d’une méthode d’élevage et d’un incubateur pour simuler leur environnement naturel¹¹. Les balances ont une distribution régulière et proportionnelle des cellules présentes, ce qui permet aux chercheurs de visualiser, de compter et d’étiqueter.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer