Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Resumo

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Resumo

As escamas de peixe-zebra oferecem uma variedade de vantagens para uso em laboratórios padrão para fins de ensino e pesquisa. As escamas são facilmente coletadas sem a necessidade de eutanásia, regeneram-se em algumas semanas e são translúcidas e pequenas, permitindo que sejam visualizadas usando um microscópio padrão. As escamas de peixe-zebra são especialmente úteis em ambientes educacionais, pois oferecem uma oportunidade única para os alunos se envolverem em experiências práticas de aprendizado, particularmente na compreensão da dinâmica celular e métodos de cultura in vitro . O principal objetivo deste protocolo é descrever um método de coleta e manutenção de escamas de peixe-zebra em cultura para uso em uma variedade de estudos biológicos usando equipamentos básicos de laboratório. Além disso, o protocolo detalha seu uso na compreensão da homeostase óssea, examinando a atividade das células ósseas envolvidas na reabsorção e deposição óssea. Também inclui protocolos adicionais para técnicas gerais, como a visualização de núcleos e células apoptóticas. O protocolo de cultivo in vitro produz resultados confiáveis com o mínimo de reagentes e equipamentos. Este artigo discute os benefícios do uso de culturas in vitro de escamas de peixe-zebra para promover a investigação científica e descreve os recursos necessários para apoiar sua integração em ambientes educacionais.

Introdução

Nos últimos anos, o peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um organismo modelo valioso em vários campos científicos, incluindo genética, biologia do desenvolvimento e toxicologia ^1,2,3. O peixe-zebra é um pequeno peixe tropical de água doce nativo dos rios do Sudeste Asiático⁴. Eles se tornaram um organismo modelo popular em biologia devido à sua fácil manutenção, tamanho pequeno, ciclo reprodutivo rápido e embriões translúcidos¹. Isso permite uma fácil observação de seu desenvolvimento....

Protocolo

Todos os protocolos descritos aqui seguem as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados anualmente pelo comitê de Cuidados com Animais da Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University sob os números de protocolo 20-14 e 21-12. Antes de realizar este protocolo, os usuários devem garantir que as diretrizes federais e provinciais sobre o uso de animais em pesquisa ou ensino sejam seguidas²³. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes para cu....

Discussão

As escamas de peixe-zebra são um modelo in vitro de fácil acesso para estudar uma variedade de processos biológicos diferentes que podem ser mantidos por até 2 dias usando um método de cultura e uma incubadora para simular seu ambiente natural¹¹. As escalas têm uma distribuição regular e proporcional das células presentes, o que permite aos pesquisadores visualizar, contar e rotular células e realizar experimentos simples de biologia celular usa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer