Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Resumo

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Resumo

As escamas de peixe-zebra oferecem uma variedade de vantagens para uso em laboratórios padrão para fins de ensino e pesquisa. As escamas são facilmente coletadas sem a necessidade de eutanásia, regeneram-se em algumas semanas e são translúcidas e pequenas, permitindo que sejam visualizadas usando um microscópio padrão. As escamas de peixe-zebra são especialmente úteis em ambientes educacionais, pois oferecem uma oportunidade única para os alunos se envolverem em experiências práticas de aprendizado, particularmente na compreensão da dinâmica celular e métodos de cultura in vitro . O principal objetivo deste protocolo é descrever um método de coleta e manutenção de escamas de peixe-zebra em cultura para uso em uma variedade de estudos biológicos usando equipamentos básicos de laboratório. Além disso, o protocolo detalha seu uso na compreensão da homeostase óssea, examinando a atividade das células ósseas envolvidas na reabsorção e deposição óssea. Também inclui protocolos adicionais para técnicas gerais, como a visualização de núcleos e células apoptóticas. O protocolo de cultivo in vitro produz resultados confiáveis com o mínimo de reagentes e equipamentos. Este artigo discute os benefícios do uso de culturas in vitro de escamas de peixe-zebra para promover a investigação científica e descreve os recursos necessários para apoiar sua integração em ambientes educacionais.

Introdução

Nos últimos anos, o peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um organismo modelo valioso em vários campos científicos, incluindo genética, biologia do desenvolvimento e toxicologia ^1,2,3. O peixe-zebra é um pequeno peixe tropical de água doce nativo dos rios do Sudeste Asiático⁴. Eles se tornaram um organismo modelo popular em biologia devido à sua fácil manutenção, tamanho pequeno, ciclo reprodutivo rápido e embriões translúcidos¹. Isso permite uma fácil observação de seu desenvolvimento interno, tornando-os ideais para estudar vários processos biológicos na biologia do desenvolvimento. O peixe-zebra compartilha semelhanças genéticas com os humanos; Aproximadamente 70% dos genes humanos têm pelo menos uma contraparte do peixe-zebra, tornando-os um excelente modelo para estudar distúrbios e doenças genéticas em humanos ^5,6. Ao manipular genes específicos no peixe-zebra, os pesquisadores podem obter informações valiosas sobre a função e o comportamento dos genes, que podem ser aplicados à pesquisa em saúde humana⁶, edição de genes e criação de linhas transgênicas ^7,8.

As escamas de peixe-zebra se regeneram após a remoção ^9,10 e podem ser cultivadas por um a três dias com uma incubadora básica (não-CO₂) enquanto são usadas para experimentos¹¹. O uso de escamas de peixe-zebra é vantajoso em laboratórios básicos, pois podem ser removidas de peixes anestesiados sem a necessidade de eutanásia. As escamas de peixe-zebra são um componente do esqueleto dérmico, consistindo principalmente de duas camadas: a camada interna, que é espessa e feita de tecido parcialmente mineralizado formado por camadas de fibrilas de colágeno, e a camada externa, que é altamente mineralizada e contém uma rede de fibrilas de colágeno entrelaçadas^12,13 (Figura 1A-C). Essas características morfológicas e celulares da escala são facilmente observadas em um microscópio composto padrão. Essas características tornam as escamas de peixe-zebra um bom modelo para o estudo celular e molecular. Por exemplo, escamas de peixe-zebra têm sido usadas para estudar a homeostase óssea, incluindo a atividade das células ósseas^11,12. Eles também têm sido usados para entender a regeneração tecidual ^9,14,15, vias gênicas e sinalização^14,16, metabolismo¹⁷, estudos de microbiota¹⁸, etc. O peixe-zebra, semelhante a outros teleósteos, também é altamente sensível a fatores ambientais, como poluentes e toxinas 19,20,21,22. Como tal, as escamas de peixe são usadas para estudar a exposição a toxinas em populações de peixes. Essas características tornam as escalas um excelente modelo para ensinar os alunos sobre os impactos dos fatores ambientais nos organismos vivos. Além disso, escamas de linhagens transgênicas de peixe-zebra, como Tg (osterix: mCherry) e Tg (runx2a: GFP), podem adicionar outro nível de complexidade aos experimentos dos alunos.

Em resumo, usando escamas de peixe-zebra, os pesquisadores podem projetar e conduzir experimentos para estudar vários aspectos da biologia, desde mecanismos celulares até mudanças ambientais. O peixe-zebra também é um recurso valioso no ensino superior, pois pode fornecer experiências práticas em design experimental, coleta de dados e análise. O peixe-zebra também pode ser utilizado em cursos avançados e programas focados em pesquisa para explorar áreas específicas de interesse. Este artigo descreve um protocolo para o uso de escamas de peixe-zebra em ambientes de pesquisa e aprendizagem em sala de aula.

Protocolo

Todos os protocolos descritos aqui seguem as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados anualmente pelo comitê de Cuidados com Animais da Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University sob os números de protocolo 20-14 e 21-12. Antes de realizar este protocolo, os usuários devem garantir que as diretrizes federais e provinciais sobre o uso de animais em pesquisa ou ensino sejam seguidas²³. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes para cultura de escala

1. Preparar o meio DMEM com HEPES (10 g de DMEM em pó, 5,95 g de HEPES, em 1 l de água destilada ou dH₂O, pH: 6,91), alíquota e conservar a 4 °C.
2. Prepare a solução de trabalho do meio de cultura (88% de meio DMEM com HEPES, 10% de soro fetal bovino e 2% de penicilina-estreptomicina [5000 unidades de penicilina e 5 mg de estreptomicina por mL] ajustada ao volume necessário no dia da realização do experimento.
   NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada fresca diariamente e não pode ser armazenada. O meio de cultura deve ser mantido frio (a 4 °C ou sobre gelo) até ser utilizado.
3. Alíquota da solução de trabalho do meio de cultura nos recipientes em que o experimento será realizado. Neste caso, foram utilizados tubos de 0,2 mL ou uma placa de 96 poços. Mantenha essas alíquotas no gelo até que seja necessário.
   NOTA: Esta solução deve ser preparada fresca e não pode ser armazenada por mais de 1 dia. Consulte a Tabela 1 para todos os reagentes.

2. Remoção de escamas de peixes vivos

1. Prepare um recipiente ou tanque para o peixe-zebra com um volume de água de aproximadamente 2 L para 4-5 peixes adultos.
   NOTA: Os parâmetros típicos da água que são apropriados para o peixe-zebra são pH 7,5, temperatura 28,5 °C, condutividade 640-781 μS e um ciclo de luz escura de 12-12 horas. Certifique-se de que a temperatura seja mantida constantemente no tanque.
2. Use uma rede de pesca para capturar 4-5 peixes-zebra adultos e coloque-os no tanque de retenção de peixe-zebra preparado acima.
3. Prepare um recipiente com pelo menos 60 mL de água onde os peixes serão anestesiados.
   NOTA: Os peixes devem ser capazes de se mover no recipiente e ser profundos o suficiente para evitar que saltem. Este recipiente deve conter metano-sulfonato de tricaína a 0,01% tamponado (MS222), que deve ser composto de água de peixe-zebra (diluir 0,1% MS222, que é preparado com 0,3 g de MS222, 615 μL de NaOH 1 M em 300 mL de sistema de água de peixe-zebra, dez vezes).
   CUIDADO: Os indivíduos que conduzem esses experimentos devem ter a aprovação do conselho institucional de ética animal para capturar, anestesiar e manusear o peixe-zebra. Da mesma forma, o anestésico utilizado é uma baixa concentração de metano-sulfonato de tricaína (MS222), que é um produto químico comumente usado na biologia dos peixes, mas que requer manuseio adequado, como equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas descartáveis de nitrilo, óculos de segurança/óculos de proteção e jaleco (consulte a ficha de dados de segurança do MS222 para obter mais informações).
4. Prepare um recipiente de recuperação com as mesmas especificações usadas anteriormente na etapa 1 (pelo menos 2 L de água) onde o peixe será colocado após a remoção da escama. Este recipiente deve ter espaço suficiente e os parâmetros corretos da água, conforme observado acima.
5. Usando uma rede, transfira cuidadosamente um único peixe-zebra adulto para o recipiente com 0,01% de MS222. Espere até que o peixe esteja completamente imóvel e tenha um movimento opercular mínimo (isso geralmente leva menos de 10 minutos).
   NOTA: Toda esta etapa é realizada um peixe de cada vez. Não anestesiar o próximo peixe até que as escamas tenham sido removidas com sucesso do peixe que está sendo manuseado e até que o peixe tenha sido transferido para o recipiente de recuperação.
6. Coloque individualmente o peixe-zebra adulto em uma placa de Petri invertida forrada com uma toalha de papel molhada.
7. Sob um estereomicroscópio de dissecação e usando uma pinça fina, remova no máximo 10-12 escamas de um peixe individual. As escamas são retiradas da região lateral do peixe, onde as escamas são maiores e têm um tamanho mais constante em comparação com as outras partes do corpo (Figura 2). Ambos os lados do peixe podem ser usados.
   1. Remova as escamas uma de cada vez, puxando suavemente na direção natural da escama (ou seja, na direção de anterior para posterior). Isso deve ser feito o mais rápido possível.
8. Coloque cada incrustação individual em um tubo separado de 0,2 mL contendo a solução de trabalho do meio de cultura de incrustações (preparada na etapa 1.1) para evitar a degradação das incrustações. Uma placa de 96 poços pode ser usada como alternativa.
   NOTA: O isolamento de incrustações individuais em tubos ou poços separados evita que as incrustações grudem e permite o rastreamento de incrustações individuais que podem ser necessárias para vários experimentos.
9. Se o experimento específico exigir um tratamento de escala, aplique-o nesta etapa. Para obter exemplos de alguns protocolos, consulte as etapas 4 e 5.
10. Coloque os tubos com as escamas dentro de uma incubadora a 28 °C. O meio de cultura deve ser trocado a cada 24 h (com a solução de trabalho do meio de cultura). Uma incubadora não-CO₂ foi usada para os experimentos descritos aqui.
11. Após a remoção da incrustação, retorne cuidadosamente o peixe-zebra ao tanque de recuperação e monitore até que o movimento seja retomado. Uma pipeta ou pedra de aeração é usada para fornecer ar no tanque para acelerar a recuperação.
12. Assim que o movimento for restaurado, devolva o peixe-zebra a um tanque de criação regular. Lembre-se de manter os peixes que foram usados separadamente de qualquer outro peixe para que eles possam se recuperar separadamente e acompanhar quais peixes estão regenerando ativamente suas escamas.
13. Espere ~ 2 semanas antes de repetir a remoção de escamas desses mesmos peixes. Isso dá tempo para que eles regenerem suas escamas naturalmente.

3. Fixação de escamas

1. Lave as escamas três vezes com 200 μL de 1x de solução salina tamponada com fosfato (PBS) preparada a partir de 10x PBS (para 1 L, adicione 80 g de NaCl, 2 g de KCl e 11,2 g de Na₂HPO₄, adicione dH₂O até 1 L).
2. Remova o 1x PBS e adicione 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) durante a noite a 4 °C. Para 100 ml de PFA, adicione 4 g de paraformaldeído e 0,1 g de NaOH e, em seguida, adicione 1x PBS até 100 mL. Misture em uma placa quente em fogo baixo e mexa até que a solução esteja límpida, depois deixe a solução esfriar e estabilizar o pH em 7,4. Conservar a -20 °C. Para obter detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1 (Tabela 1).
3. Após a fixação, lavar as escamas três vezes com 200 μL de PBS 1x. Armazenar a balança a 4 °C.
   CUIDADO: O PFA é prejudicial. Consulte a ficha de dados de segurança para obter mais informações. Todos esses processos requerem manuseio adequado, como equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas descartáveis de nitrilo, óculos de segurança/óculos de proteção e jaleco.

4. Homeostase óssea

NOTA: Dois procedimentos de homeostase óssea são descritos abaixo. A coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e fosfato alcalino (AP) é normalmente usada para identificar osteoclastos e osteoblastos ativos, respectivamente. Os osteoclastos reabsorvem a matriz óssea enquanto os osteoblastos depositam a matriz óssea. A AP é a principal enzima liberada pelos osteoblastos durante a formação óssea, enquanto a TRAP é secretada pelos osteoclastos no espaço ácido entre o osteoclasto e a matriz óssea, auxiliando na quebra e reabsorção óssea 24,25,26. Este protocolo também está disponível na The Zebrafish Information Network²⁷e foi publicado anteriormente²⁸. A fosfatase alcalina é uma enzima produzida por vários tipos de células como parte do processo metabólico. Este processo não é totalmente específico para osteoblastos, mas no tecido ósseo, é usado como um marcador para a função dos osteoblastos.

1. Coloração de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
   1. Coloque cada escala fixa em um tubo de 0,2 mL ou uma placa de 96 poços com 200 μL de dH₂O. Lave as escamas adicionando e removendo cerca de 150 μL de dH₂O por 15 min três vezes. Para obter detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1 (Tabela 2).
   2. Remova as escamas do tubo ou poço de 0,2 mL e coloque-as em um novo tubo que contenha 200 μL de tampão tartarato de 50 mM. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
      1. Para 100 mM de tampão tartarato, prepare um recipiente de vidro, adicione 2,3 g de ácido tartárico e misture com tampão acetato 0,2 M (pH 5,5) até 100 mL de solução. Mexer bem e conservar a 4 °C. Para preparar 50 mM de tampão tartarato, adicione volumes iguais de dH₂O e 100 mM tampão tartarato. Para obter detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1 (Tabela 3 e Tabela 4).
   3. Remova o tampão tartarato do tubo e adicione 200 μL de solução de substrato TRAP. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente. Certifique-se de que as amostras permaneçam no escuro.
      1. Prepare um recipiente de vidro escuro e adicione 30 mL de tampão tartarato 100 mM, 1 mL de PRS hexazotizado (solução de cloridrato de pararosanilina) e 2 mL de solução de substrato enzimático. Mexa bem.
         NOTA: Esta solução não pode ser armazenada; Mantenha-o no escuro à temperatura ambiente durante o uso. Para as soluções necessárias para preparar a solução de substrato TRAP, consulte o Arquivo Suplementar 1 (Tabelas 5-9).
   4. Remova a solução de substrato TRAP e lave as escamas adicionando e removendo cerca de 150 μL de dH₂O por 15 min, três vezes.
   5. Retire as escamas do tubo e coloque-as em um novo tubo ou poço com 200 μL de glicerol a 80% (para 100 mL, misture 80 mL de glicerol com 20 mL de dH₂O) envolto em papel alumínio para evitar o desbotamento e armazene-os a 4 °C.
   6. Para visualizar as escamas ao microscópio, use uma lâmina de depressão ou côncava.
2. Coloração de fosfato alcalino (AP)
   1. Coloque cada escala fixa em um tubo de 0,2 mL ou placa de 96 poços com 200 μL de dH₂O e lave-os adicionando e removendo cerca de 150 μL de dH₂O por 15 min, três vezes. Para obter detalhes, consulte o Arquivo Suplementar 1 (Tabela 2).
   2. Remova as escamas dos tubos ou poços de 0,2 mL e coloque-as em um novo tubo que contenha 200 μL de tampão tris-maleato e incube-o por 1 h em temperatura ambiente.
      1. Para este tampão, prepare um recipiente de vidro e adicione 0,605 g de tampão tris e 0,55 g de ácido maleico. Adicionar dH₂O até 25 mL e mexer bem. Estabilize para pH 8,3. Conservar a 4 °C. Para mais informações, ver o ficheiro suplementar 1 (quadro 10).
   3. Remova o tampão trismaleato do tubo e adicione 200 μL de solução de substrato AP. Incube por 1 h em temperatura ambiente. Certifique-se de que as amostras permaneçam no escuro.
      1. Para esta solução, prepare um recipiente de vidro escuro, adicione 8 mg de sal de diazônio e misture com 0,1 mL de natol-AS-TR-fosfato em N,N-dimetilformamida e 10 mL de tampão tris-maleato (pH 8,3), mexa bem. Prepare esta solução fresca. Para mais informações, ver o ficheiro suplementar 1 (quadro 11).
   4. Remova a solução de substrato AP e lave as escamas adicionando e removendo 200 μL de dH₂O por 15 min, três vezes.
   5. Remova as escamas do tubo e coloque-as em um novo tubo ou poço com 200 μL de glicerol a 80% envolto em papel alumínio para evitar o desbotamento. Conservar a 4 °C.
   6. Para visualizar as escamas usando um microscópio, coloque-as em uma lâmina côncava ou de depressão.
      CUIDADO: A maioria dos reagentes usados na coloração TRAP e AP pode ser prejudicial. Consulte a ficha de dados de segurança de cada produto químico. Todos esses procedimentos requerem manuseio adequado, como equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas descartáveis de nitrilo, óculos de segurança/óculos de proteção e jaleco.

5. Visualização da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

NOTA: Uma variedade de métodos de coloração pode ser usada para visualizar as diferenças entre as escamas e rotular as células dentro da escala (Figura 3B). Por exemplo, métodos para corar núcleos e lisossomos dentro das células da escama são descritos abaixo.

1. Coloração DAPI para visualização de núcleos celulares
   NOTA: O DAPI é usado para marcar os núcleos de todas as células, rotulando o DNA. DAPI é um marcador fluorescente que se liga fortemente a regiões enriquecidas para adenina e timina em sequências de DNA.
   1. Antes de usar o DAPI, certifique-se de que as balanças sejam fixadas em paraformaldeído a 4% (etapa 3). Lave a balança com 200 μL 1x PBS por 5 min após a fixação.
   2. Preparar uma solução de trabalho DAPI numa diluição de 1:10 do seguinte modo: Misture 1 μL de DAPI com 9 μL de 1x PBS para fazer um volume total de 10 μL.
   3. Depois de preparar a solução de DAPI, use uma pinça ou uma pipeta de plástico para colocar a escala em uma lâmina côncava, remova o excesso de PBS e adicione cerca de 10 μL da solução de DAPI preparada.
      NOTA: O DAPI manchará a escala imediatamente, para que possa ser visualizada usando um microscópio de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 352-402 nm e um comprimento de onda de emissão de 417-477 nm. O DAPI manchará todos os núcleos celulares com uma cor azul brilhante. Para visualizar toda a escala no campo de visão, foi utilizada a objetiva 4x. Núcleos corados únicos são visíveis usando a objetiva de 20x.
   4. Conte o número de núcleos corados com DAPI para determinar o número de células na escala.
2. Coloração apoptótica para visualização da morte celular em amostras vivas
   NOTA: As manchas fluorescentes podem ser usadas para rotular células apoptóticas. Por exemplo, o protocolo de marcador de fluorescência usado aqui é para ambientes ácidos e pode ser usado para rotular e rastrear organelas ácidas como lisossomos. Um aumento no número dessas organelas está correlacionado com o aumento da morte celular. Essa mancha deve ser aplicada em escamas não fixadas que foram recém-arrancadas ou cultivadas por até 2 dias.
   1. Prepare uma solução da coloração fluorescente para rastreamento de apoptose de acordo com as instruções do fabricante, usando o meio de cultura como diluente.
      NOTA: A concentração da coloração fluorescente pode mudar drasticamente dependendo do método de apoptose usado. Consulte o protocolo comercial da coloração de escolha para obter detalhes específicos sobre as concentrações recomendadas.
   2. Remova cuidadosamente o meio de cultura de cada tubo ou poço de 0,2 mL de uma placa de 96 poços se as escamas foram previamente cultivadas.
   3. Adicione solução de coloração fluorescente suficiente para cobrir toda a escala (cerca de 50 μL).
   4. Cubra todos os tubos com papel alumínio para evitar o desbotamento e deixe por 30 min.
   5. Remova a solução de coloração fluorescente dos tubos ou poços.
   6. Lave as amostras adicionando 200 μL de 1x PBS aos tubos ou poços por 5 min.
   7. Remova o PBS e adicione 200 μL de PFA a 4% aos tubos ou poços para fixar as amostras por 1 h em temperatura ambiente.
   8. Lave as amostras adicionando 200 μL 1x PBS aos tubos ou poços por 5 min.
   9. Transfira as escamas para um novo tubo ou poço de 0,2 mL e adicione 200 μL de PBS 1x fresco. Cubra esses tubos/poços com papel alumínio para evitar o desbotamento. Conservar a 4 °C.
   10. Para visualizar as escamas com um microscópio de fluorescência, use uma lâmina côncava ou de depressão e o filtro correto. O sinal fluorescente usado aqui tem um máximo de excitação e emissão de 577-590 nm. A coloração fluorescente mostra células apoptóticas contendo lisossomos em vermelho.
   11. Conte o número de células coradas para determinar o número de células submetidas à apoptose.
       NOTA: A folha de alumínio é usada durante a coloração e armazenamento para evitar o desbotamento. As amostras podem ser armazenadas no escuro por algumas horas ou até dias, dependendo de qual mancha fluorescente é usada. Para armazenar amostras fluorescentes por períodos mais longos, use um protocolo de fixação e montagem compatível com a mancha fluorescente. Todas as colorações fluorescentes foram visualizadas usando um microscópio de fluorescência com aumento de pelo menos 20x. O filtro utilizado foi o seguinte: para DAPI 417-477 nm; para rastreamento de apoptose 577-590 nm.

Resultados

Recentemente, esse protocolo de cultura em escala foi usado para estudar a homeostase óssea¹¹. As escamas podem sobreviver no meio de cultura por pelo menos 2 dias. O número de células apoptóticas foi analisado em cada dia de cultivo, até um máximo de três dias, por meio da contagem das células marcadas. Esses resultados mostraram que as células apoptóticas aumentaram significativamente no terceiro dia de cultivo, indicando que o tempo de cultivo deve se...

Discussão

As escamas de peixe-zebra são um modelo in vitro de fácil acesso para estudar uma variedade de processos biológicos diferentes que podem ser mantidos por até 2 dias usando um método de cultura e uma incubadora para simular seu ambiente natural¹¹. As escalas têm uma distribuição regular e proporcional das células presentes, o que permite aos pesquisadores visualizar, contar e rotular células e realizar experimentos simples de biologia celular usa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer