טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר דינמיקה תאית בסקאלות דגי זברה

Summary

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקר דינמיקה תאית באמצעות טכניקה פשוטה של תרבית חוץ גופית . הוא מספק הזדמנות לחוקרי דגי זברה ולמחנכים לחקור תהליכים תאיים, כגון אלה הקשורים להומאוסטזיס עצם ולביולוגיה בסיסית של התא, על ידי הדמיה של גרעינים פלואורסצנטיים ותאים אפופטוטיים בתוך הקשקשים.

Abstract

קשקשי דגי זברה מציעים מגוון יתרונות לשימוש במעבדות סטנדרטיות למטרות הוראה ומחקר. הקשקשים נאספים בקלות ללא צורך בהמתת חסד, מתחדשים תוך מספר שבועות, והם שקופים וקטנים, מה שמאפשר לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי. קשקשי דגי זברה שימושיים במיוחד בסביבות חינוכיות, מכיוון שהם מספקים הזדמנות ייחודית לתלמידים לעסוק בחוויות למידה מעשיות, במיוחד בהבנת דינמיקה תאית ושיטות גידול חוץ גופיות . מטרתו העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לאיסוף ותחזוקה של קשקשי דגי זברה בתרבית לשימוש במגוון מחקרים ביולוגיים באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. בנוסף, הפרוטוקול מפרט את השימוש בהם בהבנת הומאוסטזיס עצם על ידי בחינת הפעילות של תאי עצם המעורבים בספיגת עצם ושיקוע. הוא כולל גם פרוטוקולים נוספים לטכניקות כלליות, כגון הדמיה של גרעינים ותאים אפופטוטיים. פרוטוקול תרבית חוץ גופית מפיק תוצאות אמינות עם מינימום ריאגנטים וציוד. מאמר זה דן ביתרונות של שימוש בתרביות חוץ גופיות של קשקשי דגי זברה כדי לטפח חקירה מדעית ומתאר את המשאבים הדרושים לתמיכה בשילובם במסגרות חינוכיות.

Introduction

בשנים האחרונות, דגי זברה (Danio rerio) התגלו כאורגניזם מודל רב ערך בתחומים מדעיים שונים, כולל גנטיקה, ביולוגיה התפתחותית וטוקסיקולוגיה ^1,2,3. דגי זברה הם דגי מים מתוקים טרופיים קטנים שמקורם בנהרות דרום מזרח אסיה⁴. הם הפכו לאורגניזם מודל פופולרי בביולוגיה בשל תחזוקתם הקלה, גודלם הקטן, מחזור הרבייה המהיר והעוברים השקופים¹. זה מאפשר התבוננות קלה בהתפתחות הפנימית שלהם, מה שהופך אותם אידיאליים לחקר תהליכים ביולוגיים שונים בביולוגיה התפתחותית. דגי זברה חולקים דמיון גנטי עם בני אדם; כ -70% מהגנים האנושיים יש לפחות מקבילה אחת של דגי זברה, מה שהופך אותם למודל מצוין לחקר הפרעות גנטיות ומחלות בבני אדם ^5,6. על ידי מניפולציה של גנים ספציפיים בדגי זברה, חוקרים יכולים לקבל תובנות יקרות ערך על תפקודם והתנהגותם של גנים, אשר לאחר מכן ניתן ליישם במחקר בריאות האדם⁶, עריכת גנים, ויצירת קווים טרנסגניים ^7,8.

קשקשי דגי הזברה מתחדשים לאחר הסרה ^9,10 וניתן לגדל אותם בתרבית במשך יום עד שלושה ימים עם אינקובטור בסיסי (שאינו CO₂) בזמן שהם משמשים לניסויים¹¹. השימוש בקשקשים של דגי זברה הוא יתרון במעבדות בסיסיות מכיוון שניתן להסיר אותם מדגים מורדמים ללא צורך בהמתת חסד. קשקשי דגי זברה הם מרכיב בשלד העורי, המורכב בעיקר משתי שכבות: השכבה הפנימית, שהיא עבה ועשויה מרקמה מינרלית חלקית הנוצרת על ידי שכבות של סיבי קולגן, והשכבה החיצונית, שהיא מינרליזציה גבוהה ומכילה רשת של סיבי קולגן^{שזורים 12,13} (איור 1A-C). תכונות מורפולוגיות ותאיות אלה של הסולם נצפות בקלות תחת מיקרוסקופ מורכב סטנדרטי. מאפיינים אלה הופכים את קשקשי דגי הזברה למודל טוב לחקר תאים ומולקולריים. לדוגמה, קשקשי דגי זברה שימשו לחקר הומאוסטזיס עצם, כולל פעילות תאי עצם^11,12. הם שימשו גם להבנת התחדשות רקמות ^9,14,15, מסלולי גנים^{ואיתות 14,16}, מטבוליזם¹⁷, מחקרי מיקרוביוטה¹⁸ ועוד. דגי זברה, בדומה לטלאוסטים אחרים, רגישים מאוד גם לגורמים סביבתיים כגון מזהמים ורעלים 19,20,21,22. לכן, קשקשי דגים משמשים לחקר חשיפות לרעלים באוכלוסיות דגים. מאפיינים אלה הופכים את הסולמות למודל מצוין להוראת תלמידים על ההשפעות של גורמים סביבתיים על אורגניזמים חיים. בנוסף, סולמות מקווי דגי זברה טרנסגניים, כגון Tg (osterix:mCherry) ו-Tg (runx2a:GFP), יכולים להוסיף רמה נוספת של מורכבות לניסויי סטודנטים.

לסיכום, באמצעות שימוש בקשקשים של דגי זברה, חוקרים יכולים לתכנן ולערוך ניסויים כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה, ממנגנונים תאיים ועד שינויים סביבתיים. דגי זברה הם גם משאב יקר ערך בהשכלה הגבוהה מכיוון שהם יכולים לספק חוויות מעשיות בתכנון ניסויים, איסוף נתונים וניתוח. דגי זברה יכולים לשמש גם בקורסים מתקדמים ובתוכניות ממוקדות מחקר כדי לחקור תחומי עניין ספציפיים. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשימוש בקשקשים של דגי זברה בסביבות מחקר ולמידה בכיתה.

Protocol

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן עוקבים אחר הנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו מדי שנה על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סנט מרי / אוניברסיטת הר סנט וינסנט תחת פרוטוקולים מספר 20-14 ו- 21-12. לפני ביצוע פרוטוקול זה, על המשתמשים לוודא כי הנחיות פדרליות ומחוזיות לשימוש בבעלי חיים במחקר או בהוראה נשמרות²³. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים לתרבות בקנה מידה

1. הכינו מדיום DMEM עם HEPES (10 גרם אבקת DMEM, 5.95 גרם HEPES, ב 1 ליטר מים מזוקקים או dH₂O, pH: 6.91), aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.
2. הכינו את מדיום התרבית - פתרון עבודה (88% DMEM בינוני עם HEPES, 10% נסיוב בקר עוברי ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין [5000 יחידות פניצילין ו-5 מ"ג סטרפטומיצין למ"ל] מותאם לנפח הדרוש ביום ביצוע הניסוי.
   הערה: יש להכין את פתרון העבודה טרי מדי יום ולא ניתן לאחסן אותו. יש לשמור את מדיום התרבית קר (ב 4 ° C או על קרח) עד לשימוש.
3. Aliquot, פתרון העבודה של מדיום התרבית, לתוך המכולות שבהן יבוצע הניסוי. במקרה זה, 0.2 מ"ל צינורות או צלחת 96 באר שימשו. יש לשמור את האליציטוטים הללו על קרח עד לצורך.
   הערה: פתרון זה צריך להיות מוכן טרי ולא ניתן לאחסן אותו במשך יותר מיום אחד. עיין בטבלה 1 עבור כל הריאגנטים.

2. הסרת קשקשים מדגים חיים

1. הכינו מיכל או מכל לדגי הזברה בנפח מים של כ-2 ליטר עבור 4-5 דגים בוגרים.
   הערה: הפרמטרים האופייניים של המים המתאימים לדגי זברה הם pH 7.5, טמפרטורה 28.5 מעלות צלזיוס, מוליכות 640-781 μS ומחזור אור כהה של 12-12 שעות. ודא כי הטמפרטורה נשמרת כל הזמן במיכל.
2. השתמשו ברשת דגים כדי ללכוד 4-5 דגי זברה בוגרים והניחו אותם במיכל האחיזה של דגי הזברה שהוכן למעלה.
3. הכינו מיכל עם לפחות 60 מ"ל מים שבו הדגים יהיו מורדמים.
   הערה: הדגים חייבים להיות מסוגלים לנוע במיכל ולהיות עמוקים מספיק כדי למנוע מהם לקפוץ החוצה. מיכל זה צריך להכיל 0.01% טריקאין מתאן-סולפונט חוצץ (MS222), אשר צריך להיות מורכב ממי דגי זברה (לדלל 0.1% MS222, אשר מוכן עם 0.3 גרם של MS222, 615 μL של 1 M NaOH ב 300 מ"ל של מערכת המים של דגי זברה, עשר פעמים).
   זהירות: אנשים המבצעים ניסויים אלה חייבים לקבל את אישור המועצה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים כדי לתפוס, להרדים ולטפל בדגי זברה. באופן דומה, חומר ההרדמה המשמש הוא ריכוז נמוך של טריקאין מתאן-סולפונט (MS222), שהוא כימיקל נפוץ בביולוגיה של דגים אך כזה הדורש טיפול נאות, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה (עיין בגיליון נתוני הבטיחות של MS222 לקבלת מידע נוסף).
4. הכינו מיכל התאוששות עם אותם מפרטים שבהם נעשה שימוש קודם לכן בשלב 1 (לפחות 2 ליטר מים) שבו הדגים יוצבו לאחר הסרת האבנית. מיכל זה צריך להיות מספיק מקום ואת הפרמטרים הנכונים מים, כפי שצוין לעיל.
5. באמצעות רשת, העבר בזהירות דג זברה בוגר יחיד למיכל עם 0.01% MS222. המתן עד שהדג אינו נייד לחלוטין ויש לו תנועה אופרקולרית מינימלית (זה בדרך כלל לוקח פחות מ -10 דקות).
   הערה: כל השלב הזה מתבצע דג אחד בכל פעם. אין להרדים את הדג הבא עד שהקשקשים הוסרו בהצלחה מהדג המטופל ועד שהדג הועבר למיכל ההתאוששות.
6. הניחו בנפרד את דג הזברה הבוגר על צלחת פטרי הפוכה מרופדת במגבת נייר רטובה.
7. תחת מיקרוסקופ מנתח ובאמצעות מלקחיים עדינים, להסיר מקסימום של 10-12 קשקשים מדג בודד. הקשקשים מוסרים מהאזור הצידי של הדג, שבו הקשקשים גדולים יותר ויש להם גודל קבוע יותר בהשוואה לחלקים אחרים של הגוף (איור 2). ניתן להשתמש בשני צידי הדג.
   1. הסר את הקשקשים אחד בכל פעם על ידי משיכה עדינה בכיוון הטבעי של הסולם (כלומר, בכיוון מקדמי לאחורי). זה צריך להיעשות מהר ככל האפשר.
8. מקם כל סולם בנפרד בצינור נפרד של 0.2 מ"ל המכיל את תרבית האבנית פתרון עבודה בינונית (שהוכן בשלב 1.1) כדי למנוע את התפרקות הקשקשים. צלחת 96 בארות יכולה לשמש כחלופה.
   הערה: בידוד של מאזניים בודדים בצינורות או בארות נפרדים מונע מהקשקשים להידבק זה לזה ומאפשר מעקב אחר מאזניים בודדים שעשויים להידרש לניסויים מרובים.
9. אם הניסוי הספציפי דורש טיפול בקנה מידה, יישם אותו בשלב זה. לקבלת דוגמאות של פרוטוקולים מסוימים, עיין בשלבים 4 ו- 5.
10. שים את הצינורות עם הקשקשים בתוך אינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. מדיום התרבות צריך להיות שונה כל 24 שעות (עם פתרון מדיום תרבות עבודה). אינקובטור שאינו CO₂ שימש לניסויים המתוארים כאן.
11. לאחר הסרת האבנית, יש להחזיר בזהירות את דגי הזברה למיכל ההתאוששות ולפקח עד לחידוש התנועה. פיפטה או אבן אוורור משמש כדי לספק אוויר במיכל כדי להאיץ את ההתאוששות.
12. לאחר חידוש התנועה, החזירו את דגי הזברה למיכל גידול רגיל. זכרו לשמור על הדגים ששימשו בנפרד מכל דג אחר, כדי שיוכלו להתאושש בנפרד ולעקוב אחר אילו דגים מחדשים באופן פעיל את הקשקשים שלהם.
13. המתן ~ שבועיים לפני שתחזור על הסרת אבנית מאותם דגים. זה מאפשר להם זמן לחדש את הקשקשים שלהם באופן טבעי.

3. קיבוע קשקשים

1. שטפו את הקשקשים שלוש פעמים עם 200 μL של 1x של מלח חוצץ פוספט (PBS) מוכן מ 10x PBS (עבור 1 L, להוסיף 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl, ו 11.2 גרם של Na₂HPO₄, להוסיף dH₂O עד 1 L).
2. הסר את PBS 1x והוסף 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) למשך הלילה ב 4 ° C. עבור 100 מ"ל של PFA, להוסיף 4 גרם של paraformaldehyde ו 0.1 גרם של NaOH, ולאחר מכן להוסיף 1x PBS עד 100 מ"ל. מערבבים על פלטה חמה המוגדרת לאש נמוכה ומערבבים עד שהתמיסה נקייה, ואז מניחים לתמיסה להתקרר ולייצב את רמת החומציות ל-7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 1).
3. לאחר הקיבוע, לשטוף את הקשקשים שלוש פעמים עם 200 μL של 1x PBS. אחסנו את הקשקשים בטמפרטורה של 4°C.
   אזהרה: PFA מזיק. עיין בגיליון נתוני הבטיחות לקבלת מידע נוסף. כל התהליכים הללו דורשים טיפול מתאים, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה.

4. הומאוסטזיס עצם

הערה: שני הליכים הומאוסטזיס עצם מתוארים להלן. חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP) וצביעת פוספט אלקליין (AP) משמשים בדרך כלל לזיהוי אוסטאוקלסטים ואוסטאובלסטים פעילים, בהתאמה. אוסטאוקלסטים סופחים מחדש את מטריצת העצם ואילו אוסטאובלסטים מפקידים את מטריצת העצם. AP הוא האנזים העיקרי המשתחרר על ידי אוסטאובלסטים במהלך היווצרות עצם, בעוד TRAP מופרש על ידי אוסטאוקלסטים לתוך החלל החומצי בין האוסטאוקלסטים לבין מטריצת העצם, ומסייע בפירוק עצם^וספיגה 24,25,26. פרוטוקול זה זמין גם ברשת המידע של דגי הזברה²⁷ופורסם בעבר²⁸. פוספטאז אלקליין הוא אנזים המיוצר על ידי סוגי תאים מרובים כחלק מהתהליך המטבולי. תהליך זה אינו ספציפי לחלוטין לאוסטאובלסטים, אך ברקמת העצם הוא משמש כסמן לתפקוד אוסטאובלסטים.

1. צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP)
   1. מניחים כל אבנית קבועה לתוך צינור 0.2 מ"ל או צלחת 96 באר עם 200 μL של dH₂O. שטפו את הקשקשים על ידי הוספה והסרה של כ-150 μL של dH₂O למשך 15 דקות שלוש פעמים. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 2).
   2. הסר את הקשקשים מצינור 0.2 מ"ל או באר והנח אותם בצינור חדש המכיל 200 μL של חיץ טרטרט 50 mM. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      1. עבור 100 mM של חיץ טרטרט, להכין מיכל זכוכית, להוסיף 2.3 גרם של חומצה טרטרית, ומערבבים אותו עם 0.2 M אצטט חיץ (pH 5.5) עד 100 מ"ל של פתרון. יש לערבב היטב ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. כדי להכין מאגר טרטרט של 50 mM, הוסף נפחים שווים של dH₂O ו- 100 mM tartrate buffer. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 3 וטבלה 4).
   3. הסר את חיץ הטרטרט מהצינור והוסף 200 μL של תמיסת מצע TRAP. לדגור על הדגימות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא שהדגימות נשארות בחושך.
      1. הכינו מיכל זכוכית כהה והוסיפו 30 מ"ל של 100 מ"ל חיץ טרטרט 100 מ"ל, 1 מ"ל של PRS הקסאזוטי (תמיסת הידרוכלוריד פאררוזאנילין) ו-2 מ"ל של תמיסת מצע אנזים. מערבבים היטב.
         הערה: לא ניתן לאחסן פתרון זה; יש לשמור אותו בחושך בטמפרטורת החדר בזמן השימוש. לקבלת הפתרונות הדרושים להכנת פתרון מצע TRAP, ראה קובץ משלים 1 (טבלאות 5-9).
   4. הסר את תמיסת מצע TRAP ושטוף את הקשקשים על ידי הוספה והסרה של כ- 150 μL של dH₂O למשך 15 דקות, שלוש פעמים.
   5. הסר את הקשקשים מן הצינור ומניחים אותם לתוך צינור חדש או באר עם 200 μL של 80% גליצרול (עבור 100 מ"ל, לערבב 80 מ"ל של גליצרול עם 20 מ"ל של dH₂O) עטוף ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה ולאחסן אותם ב 4 ° C.
   6. כדי לדמיין את הקשקשים מתחת למיקרוסקופ, השתמש שקע או שקופית קעורה.
2. צביעת פוספט אלקליין (AP)
   1. מניחים כל אבנית קבועה בצינור 0.2 מ"ל או צלחת 96 בארות עם 200 μL של dH₂O ושוטפים אותם על ידי הוספה והסרה של כ -150 μL של dH₂O למשך 15 דקות, שלוש פעמים. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 2).
   2. הסר את הקשקשים מהצינורות או הבארות של 0.2 מ"ל והכנס אותם לצינור חדש המכיל 200 מיקרוליטר של חיץ tris-maleate ודגור עליו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      1. עבור מאגר זה, להכין מיכל זכוכית ולהוסיף 0.605 גרם של חיץ tris ו 0.55 גרם של חומצה maleic. מוסיפים dH₂O עד 25 מ"ל ומערבבים היטב. התייצב ל- pH 8.3. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 10).
   3. הסר את חיץ tris-maleate מהצינור והוסף 200 μL של תמיסת מצע AP. דוגרים עליו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ודא שהדגימות נשארות בחושך.
      1. עבור פתרון זה, להכין מיכל זכוכית כהה, להוסיף 8 מ"ג של מלח diazonium, ומערבבים אותו עם 0.1 מ"ל של napthol-AS-TR-פוספט ב N,N-dimethylformamide, ו 10 מ"ל של חיץ tris-maleate (pH 8.3), מערבבים היטב. הכינו פתרון זה טרי. לפרטים ראו קובץ משלים 1 (טבלה 11).
   4. הסר את תמיסת מצע AP ושטוף את הקשקשים על-ידי הוספה והסרה של 200 μL של dH₂O למשך 15 דקות, שלוש פעמים.
   5. הסר את הקשקשים מהצינור והכנס אותם לצינור חדש או לבאר עם 200 μL של 80% גליצרול עטוף ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   6. כדי לדמיין את הקשקשים באמצעות מיקרוסקופ, מקם את הקשקשים על שקופית קעורה או שקע.
      זהירות: רוב הריאגנטים המשמשים בצביעת TRAP ו-AP עלולים להזיק. עיין בגיליון נתוני הבטיחות עבור כל כימיקל. כל ההליכים הללו דורשים טיפול מתאים, כגון ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות ניטריל חד פעמיות, משקפי בטיחות/משקפי התזה ומעיל מעבדה.

5. הדמיה של דינמיקה תאית בקשקשים של דגי זברה

הערה: ניתן להשתמש במגוון שיטות צביעה כדי להמחיש הבדלים בין קני מידה ולתייג תאים בתוך הסולם (איור 3B). לדוגמה, שיטות להכתמת גרעינים וליזוזומים בתוך תאי הסולם מתוארות להלן.

1. צביעת DAPI לתצוגה חזותית של גרעיני תאים
   הערה: DAPI משמש לסימון הגרעינים של כל התאים על-ידי תיוג הדנ"א. DAPI הוא סמן פלואורסצנטי שנקשר בחוזקה לאזורים מועשרים באדנין ותימין ברצפי DNA.
   1. לפני השימוש ב- DAPI, ודא שהקשקשים קבועים ב- 4% paraformaldehyde (שלב 3). שטפו את הקשקשים עם 200 μL 1x PBS במשך 5 דקות לאחר התיקון.
   2. הכן פתרון עבודה DAPI בדילול 1:10 כדלקמן. ערבבו 1 μL של DAPI עם 9 μL של 1x PBS לקבלת נפח כולל של 10 μL.
   3. לאחר הכנת תמיסת DAPI, השתמש במלקחיים או פיפטה מפלסטיק כדי להניח את האבנית על שקופית קעורה, להסיר PBS עודף, ולהוסיף סביב 10 μL של תמיסת DAPI מוכנה.
      הערה: DAPI יכתים את הסולם באופן מיידי, כך שניתן יהיה להמחיש אותו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אורך גל עירור של 352-402 ננומטר ואורך גל פליטה של 417-477 ננומטר. DAPI יכתים את כל גרעיני התא בצבע כחול בוהק. כדי לראות את כל קנה המידה בשדה הראייה, נעשה שימוש במטרה 4x. גרעינים מוכתמים בודדים נראים באמצעות המטרה 20x.
   4. ספור את מספר הגרעינים המוכתמים ב- DAPI כדי לקבוע את מספר התאים בסולם.
2. צביעה אפופטוטית להדמיית מוות תאי בדגימות חיות
   הערה: ניתן להשתמש בכתמים פלואורסצנטיים כדי לסמן תאים אפופטוטיים. לדוגמה, פרוטוקול סמן הפלואורסצנטי המשמש כאן הוא עבור סביבות חומציות וניתן להשתמש בו לתיוג ומעקב אחר אברונים חומציים כמו ליזוזומים. עלייה במספר האברונים הללו מתואמת עם מוות מוגבר של תאים. כתם זה צריך להיות מיושם על קשקשים לא קבועים כי הם נמשכו טרי או כבר תרבית עד 2 ימים.
   1. הכינו תמיסה של הכתם הפלואורסצנטי למעקב אפופטוזיס בהתאם להוראות היצרן על ידי שימוש במדיום התרבית כמדלל.
      הערה: ריכוז הכתם הפלואורסצנטי יכול להשתנות באופן דרסטי בהתאם לשיטת האפופטוזיס בה משתמשים. עיין בפרוטוקול המסחרי של הכתם המועדף לקבלת פרטים ספציפיים על הריכוזים המומלצים.
   2. בזהירות להסיר את המדיום תרבית מכל צינור 0.2 מ"ל או גם צלחת 96 באר אם הקשקשים היו תרבית בעבר.
   3. הוסף מספיק תמיסת צביעה פלואורסצנטית כדי לכסות את כל קנה המידה (סביב 50 μL).
   4. מכסים את כל הצינורות ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה ומשאירים למשך 30 דקות.
   5. הסר את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית מהצינורות או הבארות.
   6. לשטוף דגימות על ידי הוספת 200 μL של 1x PBS לצינורות או בארות במשך 5 דקות.
   7. הסר את PBS והוסף 200 μL של 4% PFA לצינורות או בארות כדי לתקן את הדגימות במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
   8. שטפו דגימות על ידי הוספת 200 μL 1x PBS לצינורות או לבארות למשך 5 דקות.
   9. מעבירים את הקשקשים לתוך צינור חדש של 0.2 מ"ל או באר, ומוסיפים 200 μL של PBS 1x טרי. כסו צינורות/בארות אלה ברדיד אלומיניום כדי למנוע דהייה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   10. כדי להמחיש את הקשקשים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, השתמש בשקופית קעורה או שקע, ואת המסנן הנכון. לאות הפלואורסצנטי המשמש כאן יש מקסימום עירור ופליטה של 577-590 ננומטר. הכתם הפלואורסצנטי מראה תאים אפופטוטיים המכילים ליזוזומים באדום.
   11. ספרו את מספר התאים המוכתמים על מנת לקבוע את מספר התאים שעוברים אפופטוזיס.
       הערה: רדיד אלומיניום משמש במהלך צביעה ואחסון כדי למנוע דהייה. דגימות ניתן לאחסן בחושך במשך כמה שעות או אפילו ימים, תלוי איזה כתם פלואורסצנטי משמש. כדי לאחסן דגימות פלורסנט לפרקי זמן ארוכים יותר, השתמש בפרוטוקול קיבוע והרכבה התואם לכתם הפלואורסצנטי. כל הכתמים הפלואורסצנטיים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה של לפחות פי 20. המסנן ששימש היה כדלקמן: עבור DAPI 417-477 ננומטר; למעקב אפופטוזיס 577-590 ננומטר.

תוצאות

לאחרונה, פרוטוקול תרבית בקנה מידה זה שימש לחקר הומאוסטזיס^{עצם 11}. מאזניים יכולים לשרוד במדיום התרבות לפחות יומיים. מספרי התאים האפופטוטיים נותחו בכל יום של תרבית, עד שלושה ימים לכל היותר, על ידי ספירת התאים המסומנים. תוצאות אלה הראו כי תאים אפופטוטיים גדלו באו...

Discussion

קשקשי דגי זברה הם מודל נגיש במבחנה לחקר מגוון תהליכים ביולוגיים שונים שניתן לשמור עליהם עד יומיים בשיטת תרבית ואינקובטור המדמה את סביבתם הטבעית¹¹. למאזניים יש התפלגות קבועה ופרופורציונלית של תאים נוכחים, המאפשרת לחוקרים לצפות, לספור ולתייג תאים ולבצע ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer