ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

要約

このプロトコールは、簡単な in vitro 培養技術を使用して細胞動態を研究する方法を提供します。ゼブラフィッシュの研究者や教育者は、スケール内の蛍光核とアポトーシス細胞を視覚化することにより、骨の恒常性や基本的な細胞生物学に関連する細胞プロセスを研究する機会を提供します。

要約

ゼブラフィッシュの鱗は、標準的な研究室で教育や研究に使用するためのさまざまな利点があります。スケールは安楽死を必要とせずに簡単に収集でき、数週間以内に再生し、半透明で小さいため、標準的な顕微鏡で見ることができます。ゼブラフィッシュのウロコは、特に細胞動態や in vitro 培養方法を理解するために、学生が実践的な学習体験に取り組むユニークな機会を提供するため、教育環境で特に役立ちます。このプロトコルの主な目的は、基本的な実験装置を使用して、さまざまな生物学的研究で使用するために、培養中のゼブラフィッシュの鱗屑を収集し維持する方法を説明することです。さらに、プロトコルは、骨の吸収と沈着に関与する骨細胞の活動を調べることにより、骨の恒常性を理解するためのそれらの使用について詳しく説明します。また、核やアポトーシス細胞の可視化など、一般的な技術のための追加のプロトコルも含まれています。 in vitro 培養プロトコルは、最小限の試薬と機器で信頼性の高い結果をもたらします。この記事では、ゼブラフィッシュの鱗の in vitro 培養を使用して科学的な調査を促進する利点について説明し、教育環境への統合をサポートするために必要なリソースの概要を説明します。

概要

近年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、遺伝学、発生生物学、毒物学など、さまざまな科学分野で貴重なモデル生物として浮上しています^1,2,3。ゼブラフィッシュは、東南アジアの河川に自生する小さな熱帯淡水魚です⁴。それらは、メンテナンスが容易で、サイズが小さく、生殖周期が速く、半透明の胚があるため、生物学で人気のあるモデル生物^{になりました1。}これにより、それらの内部発達を容易に観察することができ、発生生物学におけるさまざまな生物学的プロセスを研究するのに理想的です。ゼブラフィッシュはヒトと遺伝的類似性を共有しています。ヒトの遺伝子の約70%は、少なくとも1つのゼブラフィッシュに対応するものを持っており、ヒトの遺伝性疾患や疾患を研究するための優れたモデルとなっています^5,6。ゼブラフィッシュの特定の遺伝子を操作することで、研究者は遺伝子の機能と挙動に関する貴重な洞察を得ることができ、それをヒトの健康研究⁶

プロトコル

ここに記載されているすべてのプロトコルは、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従っており、セントメアリーズ大学/マウントセントビンセント大学動物管理委員会によってプロトコル番号20-14および21-12の下で毎年承認されています。このプロトコルを実行する前に、ユーザーは、研究または教育における動物の使用に関する連邦および州のガイドラインが守られていることを確認しなければならない²³。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. スケール培養用試薬の調製

1. HEPES(10 gのDMEM粉末、5.95 gのHEPES、1 Lの蒸留水またはdH₂O、pH:6.91)でDMEM培地を調製し、分注し、4°Cで保存します。
2. 実験実施日に必要な量に調整した培養培地ワーキング溶液(HEPESを含む88%DMEM培地、10%ウシ胎児血清、および2%ペニシリン-ストレプトマイシン[5000ユニットのペニシリンと5mgのストレプトマイシン/mL])を準備します。
   注:作業溶液は毎日新鮮に調製する必要があり、保存することはできません。培地は、使用するまで冷たく(4°Cまたは氷の上)保管する必要があります。

ディスカッション

ゼブラフィッシュの鱗は、自然環境をシミュレートするための培養方法とインキュベーターを使用して最大2日間維持できるさまざまな生物学的プロセスを研究するための、簡単にアクセスできる in vitro モデルです¹¹。スケールは、存在する細胞が規則的かつ比例して分布しているため、研究者は細胞の観察、カウント、標識、および基本的?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer