ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

要約

このプロトコールは、簡単な in vitro 培養技術を使用して細胞動態を研究する方法を提供します。ゼブラフィッシュの研究者や教育者は、スケール内の蛍光核とアポトーシス細胞を視覚化することにより、骨の恒常性や基本的な細胞生物学に関連する細胞プロセスを研究する機会を提供します。

要約

ゼブラフィッシュの鱗は、標準的な研究室で教育や研究に使用するためのさまざまな利点があります。スケールは安楽死を必要とせずに簡単に収集でき、数週間以内に再生し、半透明で小さいため、標準的な顕微鏡で見ることができます。ゼブラフィッシュのウロコは、特に細胞動態や in vitro 培養方法を理解するために、学生が実践的な学習体験に取り組むユニークな機会を提供するため、教育環境で特に役立ちます。このプロトコルの主な目的は、基本的な実験装置を使用して、さまざまな生物学的研究で使用するために、培養中のゼブラフィッシュの鱗屑を収集し維持する方法を説明することです。さらに、プロトコルは、骨の吸収と沈着に関与する骨細胞の活動を調べることにより、骨の恒常性を理解するためのそれらの使用について詳しく説明します。また、核やアポトーシス細胞の可視化など、一般的な技術のための追加のプロトコルも含まれています。 in vitro 培養プロトコルは、最小限の試薬と機器で信頼性の高い結果をもたらします。この記事では、ゼブラフィッシュの鱗の in vitro 培養を使用して科学的な調査を促進する利点について説明し、教育環境への統合をサポートするために必要なリソースの概要を説明します。

概要

近年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、遺伝学、発生生物学、毒物学など、さまざまな科学分野で貴重なモデル生物として浮上しています^1,2,3。ゼブラフィッシュは、東南アジアの河川に自生する小さな熱帯淡水魚です⁴。それらは、メンテナンスが容易で、サイズが小さく、生殖周期が速く、半透明の胚があるため、生物学で人気のあるモデル生物^{になりました1。}これにより、それらの内部発達を容易に観察することができ、発生生物学におけるさまざまな生物学的プロセスを研究するのに理想的です。ゼブラフィッシュはヒトと遺伝的類似性を共有しています。ヒトの遺伝子の約70%は、少なくとも1つのゼブラフィッシュに対応するものを持っており、ヒトの遺伝性疾患や疾患を研究するための優れたモデルとなっています^5,6。ゼブラフィッシュの特定の遺伝子を操作することで、研究者は遺伝子の機能と挙動に関する貴重な洞察を得ることができ、それをヒトの健康研究⁶、遺伝子編集、トランスジェ^{ニック系統7,8}の作成に適用することができます。

ゼブラフィッシュの鱗^{は除去後に}再生し^9,10、実験に使用されながら、塩基性(非_CO2)インキュベーターで1〜3日間培養することができる¹¹。ゼブラフィッシュの鱗の使用は、安楽死を必要とせずに麻酔をかけた魚からゼブラフィッシュを除去できるため、基本的な実験室で有利です。ゼブラフィッシュの鱗屑は真皮骨格の構成要素であり、主に2つの層で構成されています:コラーゲン線維の層によって形成された厚く、部分的に石灰化した組織でできている内部層と、高度にミネラル化され、コラーゲン線維が織り交ぜられたネットワークを含む外部層^12,13).スケールのこれらの形態学的および細胞的特徴は、標準的な化合物顕微鏡で容易に観察できます。これらの特性により、ゼブラフィッシュの鱗は細胞および分子の研究に適したモデルとなっています。例えば、ゼブラフィッシュの鱗は、骨細胞の活性を含む骨の恒常性を研究するために使用されてきた^11,12。また、組織再生^9,14,15、遺伝子経路とシグナル伝達^14,16、代謝¹⁷、微生物叢研究¹⁸などを理解するためにも使用されています。ゼブラフィッシュは、他の魚類と同様に、汚染物質や毒素などの環境要因に対しても非常に敏感である19,20,21,22。そのため、魚の鱗は、魚の個体群の毒素への曝露を研究するために使用されます。これらの特性により、スケールは、環境要因が生物に与える影響について学生に教えるための優れたモデルとなっています。さらに、Tg(osterix:mCherry)やTg(runx2a:GFP)などのトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の鱗は、学生の実験に別のレベルの複雑さを加える可能性があります。

要約すると、ゼブラフィッシュの鱗を使用することで、研究者は細胞メカニズムから環境変化まで、生物学のさまざまな側面を研究するための実験を設計し、実施することができます。ゼブラフィッシュは、実験計画、データ収集、分析の実践的な経験を提供できるため、高等教育においても貴重なリソースです。ゼブラフィッシュは、特定の関心領域を探求するために、上級コースや研究に焦点を当てたプログラムでも利用できます。この記事では、研究や教室での学習環境でゼブラフィッシュの鱗を使用するためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

ここに記載されているすべてのプロトコルは、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従っており、セントメアリーズ大学/マウントセントビンセント大学動物管理委員会によってプロトコル番号20-14および21-12の下で毎年承認されています。このプロトコルを実行する前に、ユーザーは、研究または教育における動物の使用に関する連邦および州のガイドラインが守られていることを確認しなければならない²³。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. スケール培養用試薬の調製

1. HEPES(10 gのDMEM粉末、5.95 gのHEPES、1 Lの蒸留水またはdH₂O、pH:6.91)でDMEM培地を調製し、分注し、4°Cで保存します。
2. 実験実施日に必要な量に調整した培養培地ワーキング溶液(HEPESを含む88%DMEM培地、10%ウシ胎児血清、および2%ペニシリン-ストレプトマイシン[5000ユニットのペニシリンと5mgのストレプトマイシン/mL])を準備します。
   注:作業溶液は毎日新鮮に調製する必要があり、保存することはできません。培地は、使用するまで冷たく(4°Cまたは氷の上)保管する必要があります。
3. 培養液の作業溶液を実験を行う容器に分注します。この場合、0.2 mLチューブまたは96ウェルプレートを使用しました。必要になるまで、これらのアリコートを氷の上に保ちます。
   注:この溶液は新鮮に調製する必要があり、1日以上保存することはできません。すべての試薬については 、表1 を参照してください。

2.生きた魚の鱗を取り除く

1. ゼブラフィッシュ用の容器または水槽を、4〜5匹の成魚に対して水量が約2Lになるように準備します。
   注:ゼブラフィッシュに適した水の典型的なパラメータは、pH 7.5、温度28.5°C、導電率640-781μS、および12-12時間の暗光サイクルです。タンク内の温度が常に維持されていることを確認してください。
2. 魚網を使って4-5匹の成魚を捕獲し、上に用意したゼブラフィッシュの飼育水槽に入れます。
3. 魚を麻酔する場所に少なくとも60mLの水を入れた容器を準備します。
   注:魚はコンテナ内を移動でき、飛び出さないように十分な深さにある必要があります。この容器には、緩衝液を添加した0.01%トリカインメタンスルホン酸(MS222)を入れ、ゼブラフィッシュの水(0.3 gのMS222、300 mLのゼブラフィッシュ水システムに615 μLの1 M NaOHを10倍に希釈した0.1% MS222を希釈)で構成する必要があります。
   注意:これらの実験を行う個人は、ゼブラフィッシュを捕獲、麻酔、および取り扱うために、施設の動物倫理委員会の承認を得る必要があります。同様に、使用される麻酔薬は低濃度のトリカインメタンスルホン酸(MS222)であり、これは魚の生物学で一般的に使用される化学物質ですが、使い捨てニトリル手袋、安全メガネ/スプラッシュゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具などの適切な取り扱いが必要です(詳細については、MS222の安全データシートを参照してください)。
4. ステップ1で以前に使用したのと同じ仕様(少なくとも2 Lの水)で、スケール除去後に魚を配置する回収容器を準備します。このコンテナには、上記のように、十分なスペースと正しい水パラメータが必要です。
5. 網を使用して、1匹の成魚を0.01%MS222の容器に慎重に移します。魚が完全に動かなくなり、手術の動きが最小限になるまで待ちます(これには通常10分もかかりません)。
   注:このステップ全体は、一度に1匹の魚で実行されます。取り扱っている魚から鱗がうまく取り除かれ、その魚が回収容器に移されるまで、次の魚に麻酔をかけないでください。
6. 成魚のゼブラフィッシュを、濡れたペーパータオルで裏打ちされた逆さのシャーレに個別に置きます。
7. 解剖実体顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して、個々の魚から最大10〜12の鱗を取り除きます。鱗は魚の外側領域から取り除かれ、鱗は体の他の部分と比較して大きく、より一定のサイズを持っています(図2)。魚の両面が使えます。
   1. スケールの自然な方向(つまり、前方から後方の方向)にそっと引っ張って、スケールを一度に1つずつ取り外します。これはできるだけ早く行う必要があります。
8. スケールの劣化を防ぐために、スケール培養培地作業溶液(ステップ1.1で調製)が入った個別の0.2 mLチューブに各スケールを入れます。代わりに、96ウェルプレートを使用することができます。
   注:個々のスケールを別々のチューブまたはウェルに分離すると、スケールがくっつくのを防ぎ、複数の実験に必要な個々のスケールを追跡できます。
9. 特定の実験でスケール処理が必要な場合は、このステップで適用します。一部のプロトコルの例については、ステップ 4 と 5 を参照してください。
10. スケール付きのチューブを28°Cのインキュベーターに入れます。 培地は24時間ごとに交換する必要があります(培地作業溶液を使用)。ここで概説した実験には、非_CO2 インキュベーターを使用しました。
11. スケール除去後、ゼブラフィッシュを慎重に回収水槽に戻し、移動が再開するまで監視します。ピペットまたは曝気石を使用してタンクに空気を供給し、回復を早めます。
12. 動きが回復したら、ゼブラフィッシュを通常の飼育水槽に戻します。使用されていた魚は、他の魚とは別に保管して、別々に回復できるようにし、どの魚が積極的に鱗を再生しているかを追跡することを忘れないでください。
13. ~2週間待ってから、これらの同じ魚からスケール除去を繰り返します。これにより、彼らが自然にスケールを再生する時間が与えられます。

3. スケールの固定

1. 10x PBSから調製したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1xでスケールを3回洗浄します(1Lの場合、80 gのNaCl、2 gのKCl、および11.2 gのNa₂HPO₄を加え、1 LまでdH₂Oを加えます)。
2. 1x PBSを取り出し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を200 μLを4°Cで一晩加えます。 PFA100 mLに対して、パラホルムアルデヒド4 gとNaOH0.1 gを添加し、次いでPBS1x 100 mLまで添加します。弱火に設定したホットプレートで混合し、溶液が透明になるまで攪拌し、溶液を冷ましてpHを7.4に安定させます。-20°Cで保存してください。 詳細は 、別紙1 (表1)をご覧ください。
3. 固定後、スケールを200 μLの1x PBSで3回洗浄します。はかりは4°Cで保管します。
   注意:PFAは有害です。詳細については、安全データシートを参照してください。これらすべてのプロセスでは、使い捨てニトリル手袋、安全メガネ/スプラッシュゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具など、適切な取り扱いが必要です。

4. 骨の恒常性

注:2つの骨恒常性維持手順を以下に説明します。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)およびアルカリ性リン酸(AP)染色は、通常、それぞれ活性破骨細胞および骨芽細胞を同定するために使用されます。破骨細胞は骨基質を吸収し、骨芽細胞は骨基質を沈着させます。APは骨形成中に骨芽細胞によって放出される主要な酵素であり、TRAPは破骨細胞によって破骨細胞と骨基質の間の酸性空間に分泌され、骨の破壊と吸収を助けます24,25,26。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ情報ネットワーク²⁷および以前に公開された²⁸でも利用可能です。アルカリホスファターゼは、代謝過程の一部として複数の細胞タイプによって産生される酵素です。このプロセスは骨芽細胞に完全に特異的なものではありませんが、骨組織では骨芽細胞機能のマーカーとして使用されます。

1. 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色
   1. 各固定スケールを0.2 mLチューブまたは200 μLのdH₂Oを入れた96ウェルプレートに入れ、約150 μLのdH₂Oを15分間3回追加および除去してスケールを洗浄します。詳細は 、別紙1 (表2)をご覧ください。
   2. 0.2 mLチューブまたはウェルからスケールを取り出し、200 μLの50 mM酒石酸バッファーを含む新しいチューブに入れます。室温で1時間インキュベートします。
      1. 酒石酸緩衝液100 mMの場合、ガラス容器を調製し、酒石酸2.3 gを加え、0.2 M酢酸緩衝液(pH 5.5)と溶液100 mLになるまで混合します。よく攪拌し、4°Cで保存します。 50 mM の酒石酸バッファーを調製するには、同量の dH₂O バッファーと 100 mM の酒石酸バッファーを添加します。詳細は 、別紙1 (表3、表4)をご覧ください。
   3. 酒石酸バッファーをチューブから取り出し、200 μLのTRAP基質溶液を加えます。サンプルを室温で1時間インキュベートします。サンプルが暗闇に残っていることを確認してください。
      1. 暗いガラス容器を調製し、100 mM酒石酸緩衝液30 mL、六六ゾチ化PRS(パラロサニリン塩酸塩溶液)1 mL、酵素基質溶液2 mLを加えます。よくかき混ぜます。
         注:このソリューションは保存できません。使用中は室温で暗所に保管してください。TRAP基質溶液の調製に必要な溶液については、 補足ファイル1 (表5-9)を参照してください。
   4. TRAP基質溶液を取り出し、約150 μLのdH₂Oを15分間、3回添加および除去してスケールを洗浄します。
   5. スケールをチューブから取り出し、200 μLの80%グリセロール(100 mLの場合は、80 mLのグリセロールと20 mLのdH₂Oを混合)をアルミホイルで包んだ新しいチューブまたはウェルに入れ、退色を防ぎ、4°Cで保存します。
   6. 顕微鏡でスケールを視覚化するには、くぼみまたは凹型スライドを使用します。
2. アルカリリン酸(AP)染色
   1. 各固定スケールを 200 μL の dH₂O を入れた 0.2 mL チューブまたは 96 ウェルプレートに入れ、約 150 μL の dH₂O を 15 分間 3 回加えて取り外して洗浄します。詳細は 、別紙1 (表2)をご覧ください。
   2. 0.2 mLのチューブまたはウェルからスケールを取り出し、200 μLのトリスマレイン酸バッファーを含む新しいチューブに入れ、室温で1時間インキュベートします。
      1. この緩衝液には、ガラス容器を調製し、0.605gのトリス緩衝液と0.55gのマレイン酸を加えます。dH₂Oを25 mLまで加え、よく撹拌します。pH 8.3に安定させます。4°Cで保存してください。 詳細は 、別紙1 (表10)をご覧ください。
   3. トリスマレイン酸バッファーをチューブから取り出し、200 μLのAP基質溶液を加えます。室温で1時間インキュベートします。サンプルが暗闇に残っていることを確認してください。
      1. この溶液には、暗いガラス容器を準備し、8 mgのジアゾニウム塩を加え、N、N-ジメチルホルムアミド中の0.1 mLのナプトール-AS-TR-リン酸、および10 mLのトリス-マレイン酸緩衝液(pH 8.3)と混合し、よく攪拌します。この溶液を新鮮に準備します。詳細は、別紙1(表11)をご覧ください。
   4. AP基質溶液を取り出し、200 μLのdH₂Oを15分間3回添加および除去してスケールを洗浄します。
   5. チューブからスケールを取り出し、色あせを防ぐために200 μLの80%グリセロールをアルミホイルで包んだ新しいチューブまたはウェルに入れます。4°Cで保存してください。
   6. 顕微鏡を使用してスケールを視覚化するには、スケールを凹面またはくぼみスライドに置きます。
      注意:TRAPおよびAP染色に使用される試薬のほとんどは有害である可能性があります。各化学物質の安全データシートを参照してください。これらすべての手順には、使い捨てニトリル手袋、安全メガネ/スプラッシュゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具など、適切な取り扱いが必要です。

5. ゼブラフィッシュのスケールにおける細胞動態の可視化

注:スケール間の違いを視覚化し、スケール内の細胞を標識するために、さまざまな染色方法を使用できます(図3B)。例えば、スケールの細胞内の核とリソソームを染色する方法を以下に概説します。

1. 細胞核可視化のためのDAPI染色
   注:DAPIは、DNAを標識することにより、すべての細胞の核をマークするために使用されます。DAPIは、DNA配列中のアデニンとチミンが豊富な領域に強く結合する蛍光マーカーです。
   1. DAPIを使用する前に、スケールが4%パラホルムアルデヒドで固定されていることを確認してください(ステップ3)。固定後、スケールを200 μL 1x PBSで5分間洗浄します。
   2. 次のように、DAPIワーキング溶液を1:10の希釈で調製します。1 μL の DAPI と 9 μL の 1x PBS を混合して、総容量 10 μL にします。
   3. DAPI溶液を調製した後、鉗子またはプラスチックピペットを使用してスケールを凹型スライドに置き、余分なPBSを取り除き、調製したDAPI溶液を約10μL加えます。
      注:DAPIはスケールをすぐに染色するため、励起波長352-402 nm、発光波長417-477 nmの蛍光顕微鏡を使用して視覚化できます。DAPIは、すべての細胞核を明るい青色に染色します。視野内で全縮尺を見るために、4倍の対物レンズを使用しました。染色された単一の核は、20倍対物レンズを使用して観察できます。
   4. スケール内の細胞数を決定するために、DAPI染色された核の数を数えます。
2. 生サンプル中の細胞死可視化のためのアポトーシス染色
   注:蛍光染色剤は、アポトーシス細胞の標識に使用できます。例えば、ここで使用される蛍光マーカープロトコルは酸性環境用であり、リソソームのような酸性オルガネラの標識および追跡に使用できます。これらの細胞小器官の数の増加は、細胞死の増加と相関しています。この染色は、新たに吸引された、または最大2日間培養された未固定のスケールに適用する必要があります。
   1. アポトーシス追跡用の蛍光染色液を調製し、製造元の指示に従って、培地を希釈剤として使用します。
      注:蛍光染色の濃度は、使用するアポトーシス方法によって大幅に変化する可能性があります。推奨濃度の具体的な詳細については、選択した染色剤の市販プロトコールを参照してください。
   2. 各0.2 mLチューブから培地を慎重に取り出し、スケールが以前に培養されている場合は96ウェルプレートからウェルを取り出します。
   3. スケール全体をカバーするのに十分な蛍光染色溶液(約50 μL)を添加します。
   4. 色あせを防ぐためにすべてのチューブをアルミホイルで覆い、30分間放置します。
   5. 蛍光染色液をチューブまたはウェルから取り出します。
   6. サンプルを洗浄するには、1x PBS200 μLをチューブまたはウェルに5分間加えます。
   7. PBSを取り外し、200 μLの4% PFAをチューブまたはウェルに加えて、サンプルを室温で1時間固定します。
   8. サンプルを洗浄するには、200 μL 1x PBSをチューブまたはウェルに5分間加えます。
   9. スケールを新しい0.2 mLチューブまたはウェルに移し、新鮮な1x PBSを200 μL加えます。これらのチューブ/ウェルをアルミホイルで覆い、色あせを防ぎます。4°Cで保存してください。
   10. 蛍光顕微鏡でスケールを視覚化するには、凹型またはくぼみスライドと適切なフィルターを使用します。ここで使用される蛍光シグナルの励起および発光の最大値は577〜590nmです。蛍光染色は、リソソームを含むアポトーシス細胞を赤色で示しています。
   11. アポトーシスを受けている細胞の数を決定するために、染色された細胞の数を数えます。
       注:アルミホイルは、色あせを防ぐために染色および保管中に使用されます。サンプルは、使用する蛍光染色剤に応じて、数時間または数日間、暗闇で保管できます。蛍光サンプルを長期間保存するには、蛍光染色剤に適合した固定およびマウントプロトコルを使用してください。すべての蛍光染色は、少なくとも20倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して視覚化しました。使用したフィルターは次の通りでした:DAPI 417-477 nm用;アポトーシストラッキング用577-590nm。

結果

最近、このスケール培養プロトコルは、骨の恒常性を研究するために使用されました¹¹。鱗は、培養液中で少なくとも2日間生存することができます。アポトーシス細胞の数は、標識細胞をカウントすることにより、培養の各日、最大3日間まで分析しました。これらの結果から、培養3日目にはアポトーシス細胞が有意に増加することが示され、ここ?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュの鱗は、自然環境をシミュレートするための培養方法とインキュベーターを使用して最大2日間維持できるさまざまな生物学的プロセスを研究するための、簡単にアクセスできる in vitro モデルです¹¹。スケールは、存在する細胞が規則的かつ比例して分布しているため、研究者は細胞の観察、カウント、標識、および基本的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer