早期关键时期少年脑嗅觉感觉神经元突触连接的经验依赖性重塑

摘要

我们在这里描述了诱导和分析 果蝇 幼年脑中触角叶突触肾小球依赖性重塑的方法。

摘要

早期的嗅觉感觉体验在 果蝇 幼年大脑中诱导戏剧性的突触肾小球重塑，这在经验上是剂量依赖性的，时间限制，并且仅在短暂、明确的关键时期短暂可逆。脑回路突触连接重塑的方向性由作用于嗅觉感觉神经元的响应受体类的特异性气味决定。一般来说，每个神经元类别只表达一个气味受体，并支配一个嗅觉突触肾小球。在 果蝇 遗传模型中，嗅觉肾小球的整个阵列已通过气味反应性和行为输出精确绘制。丁酸乙酯 （EB） 气味剂激活支配 VM7 肾小球的 Or42a 受体神经元。在生命早期的关键时期，EB 经历驱动 Or42a 嗅觉感觉神经元中的剂量依赖性突触消除。剂量 EB 气味暴露的定时时间允许研究青少年大脑中经验依赖性的电路连接修剪。触角叶突触肾小球的共聚焦显微镜成像是使用 Or42a 受体驱动的转基因标记物完成的，这些标记物提供突触数量和神经支配体积的定量。复杂的 果蝇 遗传工具包能够系统地剖析介导大脑回路重塑的细胞和分子机制。

引言

幼年早期大脑回路的重塑代表了大规模突触连接变化的最后机会，以匹配动物出生时高度可变、不可预测的环境。作为数量最多的动物群体，昆虫具有这种进化上保守的基础关键期重塑机制¹。关键期随着感觉输入的开始而打开，表现出可逆的电路变化以优化连接性，然后在稳定力抵抗进一步重塑时关闭²。昆虫特别依赖嗅觉信息，并显示出明确的嗅觉临界期。果蝇提供了一个很好的遗传模型来研究幼年大脑中这个依赖于经验的关键时期。羽化后最初几天的气味体验会导致单独识别的突触肾小球发生显着的回路连接变化 ^3,4。重塑的方向取决于特定的输入加臭剂体验。一些气味剂会导致突触肾小球体积在羽化后几天 （dpe） 增加 ^（dpe）3,5,6,7，而其他气味剂会导致突触在 0-2 dpe 临界期快速消除突触，导致神经支配体积减少 ^8,9,10

研究方案

1. 气味接触

1. 使用细画笔，将 40-50 只发育阶段的动物分选为噬菌酸盐深色蛹（在 25 °C 下化蛹后 90 + 小时）放入含有标准玉米面糖蜜食物的 25 mm x 95 mm 聚苯乙烯 果蝇 小瓶中（图 1A）。
2. 将细不锈钢丝网放在 果蝇 小瓶的末端，以容纳苍蝇，同时保持良好的气流。用胶带透明薄膜将金属丝网盖固定在 果蝇 小瓶的侧面。
3. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 1 mL 100% 矿物油（载体对照）或将丁酸乙酯 （EB） 加臭剂溶解在另一管中的矿物油中，以产生所需的浓度（例如，15% （150 μL） 或 25% （250 μL））。
4. 将载体控制管或加臭微量离心管直立放置在密封的 3700 mL Glasslock 容器中。使用胶带将试管与果 蝇 小瓶一起牢固地固定在气味室的中心（图 1B）。
5. 将含有分阶段果 蝇 噬菌蛹小瓶的密封载体对照和 EB 气味室放入加湿 （70%）、温度控制 （25 °C） 培养箱中，进行 12 小时/12 小时的光照/黑暗循环。
6. 在气味剂室暴露 4 小时后取出新....

讨论

此处介绍的气味暴露和脑成像方案可用于可靠地诱导和量化早期生命关键时期的经验依赖性嗅觉感觉神经元突触肾小球修剪。利用这种治疗范式来探索嗅觉回路重塑的早期研究在羽化后第^{2 天开始}接触气味 ^3,4,5。相比之下，我们在成虫羽化之前开始在噬菌体蛹中暴露气味，发现绝大多数重塑发?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f