早期关键时期少年脑嗅觉感觉神经元突触连接的经验依赖性重塑

摘要

我们在这里描述了诱导和分析 果蝇 幼年脑中触角叶突触肾小球依赖性重塑的方法。

摘要

早期的嗅觉感觉体验在 果蝇 幼年大脑中诱导戏剧性的突触肾小球重塑，这在经验上是剂量依赖性的，时间限制，并且仅在短暂、明确的关键时期短暂可逆。脑回路突触连接重塑的方向性由作用于嗅觉感觉神经元的响应受体类的特异性气味决定。一般来说，每个神经元类别只表达一个气味受体，并支配一个嗅觉突触肾小球。在 果蝇 遗传模型中，嗅觉肾小球的整个阵列已通过气味反应性和行为输出精确绘制。丁酸乙酯 （EB） 气味剂激活支配 VM7 肾小球的 Or42a 受体神经元。在生命早期的关键时期，EB 经历驱动 Or42a 嗅觉感觉神经元中的剂量依赖性突触消除。剂量 EB 气味暴露的定时时间允许研究青少年大脑中经验依赖性的电路连接修剪。触角叶突触肾小球的共聚焦显微镜成像是使用 Or42a 受体驱动的转基因标记物完成的，这些标记物提供突触数量和神经支配体积的定量。复杂的 果蝇 遗传工具包能够系统地剖析介导大脑回路重塑的细胞和分子机制。

引言

幼年早期大脑回路的重塑代表了大规模突触连接变化的最后机会，以匹配动物出生时高度可变、不可预测的环境。作为数量最多的动物群体，昆虫具有这种进化上保守的基础关键期重塑机制¹。关键期随着感觉输入的开始而打开，表现出可逆的电路变化以优化连接性，然后在稳定力抵抗进一步重塑时关闭²。昆虫特别依赖嗅觉信息，并显示出明确的嗅觉临界期。果蝇提供了一个很好的遗传模型来研究幼年大脑中这个依赖于经验的关键时期。羽化后最初几天的气味体验会导致单独识别的突触肾小球发生显着的回路连接变化 ^3,4。重塑的方向取决于特定的输入加臭剂体验。一些气味剂会导致突触肾小球体积在羽化后几天 （dpe） 增加 ^（dpe）3,5,6,7，而其他气味剂会导致突触在 0-2 dpe 临界期快速消除突触，导致神经支配体积减少 ^8,9,10.具体来说，丁酸乙酯 （EB） 气味体验仅在生命早期的关键时期驱动 Or42a 嗅觉受体神经元的剂量依赖性突触修剪⁸。突触消除在关键期通过调节 EB 气味剂输入是完全可逆的，但在关键期结束后成为永久性的。这种依赖于嗅觉经验的突触修剪提供了一个有价值的实验系统，以阐明青少年脑回路重塑的时间限制机制。

在这里，我们提出了一个详细的方案，用于在生命早期关键时期诱导和分析 Or42a 受体嗅觉感觉神经元的 EB 经验依赖性突触修剪。我们表明，触角叶 VM7 肾小球中的 Or42a 突触末端可以通过转基因驱动膜栓系的 mCD8::GFP 标记物来特异性标记，可以直接与 Or42a 启动子 （Or42a-mCD8::GFP）¹¹ 融合或使用 Gal4/UAS 二元表达系统 （Or42a-Gal4 驱动 UAS-mCD8::GFP）¹²。使用与荧光标签阵列融合的突触前活性区标志物的靶向转基因表达（例如 Bruchpilot::RFP）⁸ 或用于超微结构突触分析的电子密集信号（例如，miniSOG-mCherry）⁸，可以类似地标记单个 Or42a 神经元突触。Or42a 突触末梢可以通过激光扫描共聚焦显微镜和透射电子显微镜的组合进行成像。我们表明 Or42a 突触肾小球修剪是 EB 剂量依赖性的，根据定时气味体验的浓度进行缩放。溶解在用作载体的矿物油中的 EB 气味剂的百分比可以变化，发育阶段动物中气味暴露的时间持续时间也可以变化。最后，我们展示了用于通过测量 VM7 神经支配荧光强度和体积来分析突触肾小球修剪程度的方法。突触数也可以通过计数标记的突触点和使用透射电子显微镜测量突触超微结构参数来量化⁸。总体而言，此处显示的协议是一种强大的方法，能够在幼年关键期系统地剖析介导果蝇嗅觉回路突触连接修剪的细胞和分子机制。本研究中描述的一般气味暴露设置已在以前的研究中使用其他气味和测定其他肾小球 ^3,7。

研究方案

1. 气味接触

1. 使用细画笔，将 40-50 只发育阶段的动物分选为噬菌酸盐深色蛹（在 25 °C 下化蛹后 90 + 小时）放入含有标准玉米面糖蜜食物的 25 mm x 95 mm 聚苯乙烯 果蝇 小瓶中（图 1A）。
2. 将细不锈钢丝网放在 果蝇 小瓶的末端，以容纳苍蝇，同时保持良好的气流。用胶带透明薄膜将金属丝网盖固定在 果蝇 小瓶的侧面。
3. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 1 mL 100% 矿物油（载体对照）或将丁酸乙酯 （EB） 加臭剂溶解在另一管中的矿物油中，以产生所需的浓度（例如，15% （150 μL） 或 25% （250 μL））。
4. 将载体控制管或加臭微量离心管直立放置在密封的 3700 mL Glasslock 容器中。使用胶带将试管与果 蝇 小瓶一起牢固地固定在气味室的中心（图 1B）。
5. 将含有分阶段果 蝇 噬菌蛹小瓶的密封载体对照和 EB 气味室放入加湿 （70%）、温度控制 （25 °C） 培养箱中，进行 12 小时/12 小时的光照/黑暗循环。
6. 在气味剂室暴露 4 小时后取出新封闭的果蝇，并将 20-25 只果蝇快速转移到装有新鲜气味剂的腔室中的新鲜 果蝇 小瓶中（图 1A、B）。丢弃未闭合的蛹。
7. 将果蝇放在培养箱的密封加臭剂室中总共 24 小时。如需更长的气味剂量，每 24 小时将果蝇快速转移到新鲜制备的加臭剂室中的新果 蝇 小瓶中。
8. 通过将发育阶段的果蝇浸入 70% 乙醇的培养皿中 1 分钟来麻醉它们，以准备立即进行脑解剖和免疫细胞化学处理。

2. 脑解剖

1. 通过标记将样品瓶标记为载体对照（仅 100% 矿物油）或 EB 暴露 （% EB），并在整个脑解剖和后续处理期间保持这些名称。针对每种基因型/气味条件处理 10-20 只动物。
2. 使用镊子，将单个麻醉的苍蝇转移到一小盘新鲜制备的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） ^中13。将果蝇浸入 PBS 中，并在果蝇完全浸没的情况下继续全脑解剖。
3. 双手用细 （#5） 锋利的镊子，将苍蝇腹侧朝上，用一个镊子抓住上胸部，用另一个镊子抓住喙下的头部。注意不要穿透大脑。
4. 用双手向相反方向轻轻拉动，将头部从身体的其他部分移开。头部应该很容易从胸部分离;留下孤立的头部进行解剖（图 1C）。
5. 将先前用于抓住胸部的镊子滑到喙鼻的另一侧下方。开始向相反方向轻轻拉动外骨骼角质层，使其在眼睛之间撕裂，露出大脑。
6. 拉动时，脑视叶可能会与外骨骼一起分离。为防止这种情况，在去除外骨骼角质层的同时，用两个镊子缓慢、稳定地拉动（图 1C，中间）。
7. 继续从头部去除外骨骼角质层。确保移除外骨骼的所有部分。切除附着在大脑上的所有组织，包括脂肪体和任何突出的气管。
8. 为防止粘连，请用 PBS + 0.2% Triton-X 100 （PBST） 冲洗 P20 移液器吸头。解剖后，立即将大脑转移到加盖管中的固定溶液（4% 多聚甲醛 （PFA） + 4% 蔗糖）中（图 1C，D）。

3. 脑免疫细胞化学

1. 在室温 （RT） 下以端到端旋转固定大脑 30 分钟。在将大脑留在管中的同时，移液并妥善处理有害的固定剂。用 PBS 快速清洗固定的大脑 3 次（图 1D）。
2. 旋转后，通常会发现大脑卡在管帽中。为防止大脑意外丢失（这是所有转移过程中的持续危险），请在移液时使用解剖显微镜。
3. 为了准备抗体标记，在 PBST + 1% 牛血清白蛋白 （BSA） + 0.5% 正常山羊血清 （NGS） 中在 RT 下以恒定的端到端旋转将固定的大脑封闭 1 小时（图 1D）。
4. 去除块状物，用在 PBST + 0.2% BSA + 0.1% NGS 中适当稀释的选定一抗孵育大脑。将大脑在 4 °C 下孵育过夜（14-16 小时），并不断旋转。
   注:使用的示例抗体:大鼠抗 CadN（稀释度 1:50）¹⁴ 标记突触肾小球，鸡抗 GFP （1:1000）⁸ 标记 Or42a-mCD8::GFP（图 1D）。
5. 吸出一抗。用 PBST 洗涤大脑 3 次，每次 20 分钟。将大脑与在 PBST 中稀释的二抗和 0.2% BSA + 0.1% NGS 在 RT 下以恒定旋转孵育 2 小时。
   注意:或者，将大脑在 4 °C 下孵育过夜（14-16 小时）。 在 PBST 中用 0.2% BSA + 0.1% NGS 稀释抗体;此处使用的二抗:488 山羊抗鸡 （1:250） 和 546 山羊抗大鼠 （1:250）。
6. 吸出二抗。用 PBST 洗涤大脑 3 次，每次 20 分钟。最后用 PBS 洗涤大脑 20 分钟（图 1D）。
7. 通过在载玻片上添加两条薄的双面胶带来制备玻璃显微镜载玻片 （75 mm x 25 mm），彼此相距 ~25 mm。这提供了一个垫片，以避免压碎大脑。
8. 在两条胶带之间吸取 ~10-15 μL 的封固剂以安装大脑。使用用 PBST 预冲洗的 P20 移液器吸头，将标记的大脑转移到显微镜载玻片上（图 1E）。
9. 转移大脑后，使用细画笔对齐它们，确保触角叶朝上。寻找具有拱形驼峰的一侧，其中将包含触角叶。
10. 一旦大脑正确定向，用玻璃盖玻片（1.5H 号）盖住它们，确保盖玻片固定在胶带上。然后，用额外的安装介质填充盖玻片的侧面（图 1E）。
11. 用透明指甲油密封盖玻片的边缘。让载玻片彻底干燥，然后将其存放在冰箱中以备后续成像。

4. 共聚焦成像

1. 在成像之前，通过用编码标签标记载玻片以供以后解码，将所有脑载玻片对基因型和体验条件盲法。
2. 使用带有 63 倍油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜。我们在此处显示的所有图像中使用蔡司 510 META 显微镜（图 1F）。
3. 为所采用的荧光基团使用适当的激光线。在这里，使用 Argon 488 和 HeNe 543 激光器进行触角叶突触肾小球和 Or42a 嗅觉感觉神经元成像（图 2）。
4. 确定两个通道的最佳增益和偏移，理想情况下，两个通道的增益均为 <750，偏移为 ≈0。这样做是为了确保信噪比最佳，同时限制背景。
5. 将成像定位到大脑中心。成像时，VM7 肾小球位于解剖过程中切除食道后大脑中间留下的孔的近端（图 2A）。
   注意:VM7 肾小球将始终靠近食管开口。然而，确切的位置和大小会根据脑解剖和安装差异而略有不同，因此在成像时要考虑到这一点。
6. 选择成像分辨率和光学切片厚度。这里使用 1024 x 1024 分辨率和 0.37 μm 的 Z 堆栈切片厚度。
7. 通过触角叶进行整个共聚焦 Z 堆栈投影，确保捕获 VM7 肾小球的完整 Or42a 神经元神经支配。

5. 突触测量

1. 将基因型/条件盲图像加载到斐济 （1.54f） 中。通过单击 图像>颜色 > 分割通道来分割激光线通道。
2. 在 Or42a 嗅觉通道中，通过滚动整个 Z 堆栈来确定哪些切片包含 Or42a 神经支配，确定荧光开始和结束的位置。
3. 通过单击 Image > Stacks > Z Project > Sum Slices 并输入所需的范围，创建仅包含包含 Or42a 神经元神经支配的切片的总和切片投影。
4. 在斐济，单击顶部栏上的 套索 工具以追踪 VM7 肾小球中 Or42a 神经元神经支配的轮廓，独立治疗每个大脑侧肾小球（图 3）。
5. 将周长乘以 Z 堆栈切片的数量和每个切片的厚度，得到 VM7 突触肾小球神经支配体积。为了量化突触数量，可以将 find maxima 工具与 find maxima stacks 宏一起使用，以计算概述区域 ^8,15 中的突触点。

结果

图 1 显示了嗅觉体验依赖性关键期气味暴露和脑成像方法的工作流程。该方案从羽化前的噬菌体深色蛹的年龄匹配开始（图 1A）。将蛹放入加臭剂室中4小时，然后将新封闭的成虫翻转到载体对照或剂量的EB加臭剂室中的新鲜小瓶中（图1B）。我们通常暴露在加臭剂中 24 小时，尽管任何持续时间都是可能的...

讨论

此处介绍的气味暴露和脑成像方案可用于可靠地诱导和量化早期生命关键时期的经验依赖性嗅觉感觉神经元突触肾小球修剪。利用这种治疗范式来探索嗅觉回路重塑的早期研究在羽化后第^{2 天开始}接触气味 ^3,4,5。相比之下，我们在成虫羽化之前开始在噬菌体蛹中暴露气味，发现绝大多数重塑发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f