若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

要約

ここでは、 ショウジョウバエ の幼若脳における触角葉シナプス糸球体の嗅覚経験依存的なリモデリングを誘導し、解析する方法について述べる。

要約

幼少期の嗅覚体験は、 ショウジョウバエ の幼若脳に劇的なシナプス糸球体リモデリングを誘発しますが、これは経験的に用量依存的で、時間的に制限され、短く明確に定義された臨界期にのみ一時的に可逆的です。脳回路シナプス接続リモデリングの方向性は、嗅覚ニューロンの応答性受容体クラスに作用する特定の匂い物質によって決定されます。一般に、各ニューロンクラスは単一の匂い受容体のみを発現し、単一の嗅覚シナプス糸球体を神経支配します。 ショウジョウバエ の遺伝子モデルでは、嗅覚糸球体の全配列が、匂い物質の応答性と行動出力によって正確にマッピングされています。酪酸エチル(EB)臭気剤は、VM7糸球体を神経支配するOr42a受容体ニューロンを活性化します。幼少期の重要な時期には、EBの経験はOr42a嗅覚ニューロンの用量依存的なシナプス除去を促進します。投与されたEB臭気物質曝露の期間を計ると、若年脳における経験依存的な回路接続性の剪定の調査が可能になります。触角葉シナプス糸球体の共焦点顕微鏡イメージングは、シナプス数と神経支配体積の定量化を提供するOr42a受容体駆動型トランスジェニックマーカーを使用して行われます。洗練された ショウジョウバエ の遺伝子ツールキットは、脳回路のリモデリングを媒介する細胞および分子メカニズムの体系的な解剖を可能にします。

概要

幼少期の幼若脳回路のリモデリングは、動物が生まれる高度に変化し、予測不可能な環境に合わせて大規模なシナプス結合性を変更する最後のチャンスです。昆虫は、最も豊富な動物群として、この進化的に保存された基本的な臨界期のリモデリングメカニズムを共有しています¹。臨界期は、感覚入力の開始とともに開き、接続性を最適化するために可逆的な回路変化を示し、安定化力がさらなる改造に抵抗すると閉じます²。昆虫は特に嗅覚情報に依存しており、明確に定義された嗅覚臨界期を示します。ショウジョウバエは、若年期の脳におけるこの経験依存性の臨界期を調査するための優れた遺伝モデルを提供します。脱皮後の最初の数日間の匂い物質の経験は、個々に同定されたシナプス糸球体^3,4の顕著な回路接続性の変化を引き起こします。リモデリングの方向は、特定の入力臭気体験によって異なります。一部の匂い物質は、閉塞後数日間(dpe⁾3,5,6,7のシナプス糸球体の体積の増加を引き起こしますが、他の匂い物質は、0-2 dpeの臨界期にシナプスの急速な排泄を引き起こし、神経支配の体積の減少をもたらします

プロトコル

1.臭気物質への曝露

1. 細い絵筆を使用して、40〜50匹の発達段階の動物をファレートダークサペ(25°Cでの蛹化後90 + h)として、標準的なコーンミール糖蜜食品を含む25 mm x 95 mmのポリスチレン ショウジョ ウバエバイアルに選別します(図1A)。
2. ショウジョウバエのバイアルの端に細かいステンレス鋼の金網を置き、ハエを封じ込めると同時に、良好な空気の流れを確保します。ワイヤーメッシュキャップをテープで留めた透明フィルムでショウジョウバエのバイアルの側面に固定します。
3. 1.5 mLの微量遠心チューブに、1 mLの100%鉱油を入れるか(ビヒクルコントロール)、または別のチューブで鉱油中の酪酸エチル(EB)臭気物質を溶解して、所望の濃度(例:15%(150 μL)または25%(250 μL))を生成します。
4. 車両制御チューブまたは微量遠心チューブを直立させて、密閉可能な3700 mLグラスロック容器に入れます。テープを使用して、 チューブをショウジョウバエ のバイアルと一緒に臭気チャンバーの中央にしっかりと固定します(図1B)。
5. ステー....

結果

図1 は、嗅覚経験依存性の臨界期匂い物質曝露と脳イメージング法のワークフローを示しています。このプロトコールは、脱皮直前のファレートダークサナギの年齢マッチングから始まります(図1A)。蛹を4時間匂いチャンバーに入れ、次に新たに閉じた成体をビヒクルコントロールまたは投与されたEB臭気チャンバーのいず.......

ディスカッション

ここで紹介する匂い物質曝露と脳イメージングプロトコルは、幼少期の重要な時期に経験に依存する嗅覚ニューロンのシナプス糸球体の剪定を確実に誘導し、定量化するために使用できます。この治療パラダイムを利用して嗅覚回路のリモデリングを探求する以前の研究では、排泄^3,4,5の2^{日目.......}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f