若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

要約

ここでは、 ショウジョウバエ の幼若脳における触角葉シナプス糸球体の嗅覚経験依存的なリモデリングを誘導し、解析する方法について述べる。

要約

幼少期の嗅覚体験は、 ショウジョウバエ の幼若脳に劇的なシナプス糸球体リモデリングを誘発しますが、これは経験的に用量依存的で、時間的に制限され、短く明確に定義された臨界期にのみ一時的に可逆的です。脳回路シナプス接続リモデリングの方向性は、嗅覚ニューロンの応答性受容体クラスに作用する特定の匂い物質によって決定されます。一般に、各ニューロンクラスは単一の匂い受容体のみを発現し、単一の嗅覚シナプス糸球体を神経支配します。 ショウジョウバエ の遺伝子モデルでは、嗅覚糸球体の全配列が、匂い物質の応答性と行動出力によって正確にマッピングされています。酪酸エチル(EB)臭気剤は、VM7糸球体を神経支配するOr42a受容体ニューロンを活性化します。幼少期の重要な時期には、EBの経験はOr42a嗅覚ニューロンの用量依存的なシナプス除去を促進します。投与されたEB臭気物質曝露の期間を計ると、若年脳における経験依存的な回路接続性の剪定の調査が可能になります。触角葉シナプス糸球体の共焦点顕微鏡イメージングは、シナプス数と神経支配体積の定量化を提供するOr42a受容体駆動型トランスジェニックマーカーを使用して行われます。洗練された ショウジョウバエ の遺伝子ツールキットは、脳回路のリモデリングを媒介する細胞および分子メカニズムの体系的な解剖を可能にします。

概要

幼少期の幼若脳回路のリモデリングは、動物が生まれる高度に変化し、予測不可能な環境に合わせて大規模なシナプス結合性を変更する最後のチャンスです。昆虫は、最も豊富な動物群として、この進化的に保存された基本的な臨界期のリモデリングメカニズムを共有しています¹。臨界期は、感覚入力の開始とともに開き、接続性を最適化するために可逆的な回路変化を示し、安定化力がさらなる改造に抵抗すると閉じます²。昆虫は特に嗅覚情報に依存しており、明確に定義された嗅覚臨界期を示します。ショウジョウバエは、若年期の脳におけるこの経験依存性の臨界期を調査するための優れた遺伝モデルを提供します。脱皮後の最初の数日間の匂い物質の経験は、個々に同定されたシナプス糸球体^3,4の顕著な回路接続性の変化を引き起こします。リモデリングの方向は、特定の入力臭気体験によって異なります。一部の匂い物質は、閉塞後数日間(dpe⁾3,5,6,7のシナプス糸球体の体積の増加を引き起こしますが、他の匂い物質は、0-2 dpeの臨界期にシナプスの急速な排泄を引き起こし、神経支配の体積の減少をもたらします^8,9,10.具体的には、酪酸エチル(EB)の匂い体験は、この初期の重要な時期にのみ、Or42a嗅覚受容体ニューロンの用量依存的なシナプス刈り込みを促進します⁸。シナプスの除去は、臨界期内にEB臭物質の入力を調節することにより完全に可逆的ですが、臨界期の終了後に永続的になります。この嗅覚経験依存的なシナプス刈り込みは、若年脳回路リモデリングの根底にある時間制限メカニズムを解明するための貴重な実験システムを提供します。

ここでは、初期の臨界期にOr42a受容体嗅覚ニューロンのEB経験依存性シナプス刈り込みを誘導および分析するために使用される詳細なプロトコルを紹介します。我々は、触角葉VM7糸球体におけるOr42aシナプス終末が、膜つながれたmCD8::GFPマーカーをトランスジェネニック的に駆動することによって特異的に標識できることを示し、これは、Or42aプロモーター(Or42a-mCD8::GFP)¹¹に直接融合するか、またはGal4/UASバイナリ発現システム(Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)¹²を使用する。個々のOr42aニューロンシナプスは、蛍光タグの配列に融合したシナプス前活性ゾーンマーカーの標的トランスジェニック発現(例えば、Bruchpilot::RFP)⁸または超微細構造シナプス解析のための電子密度シグナル(例えば、miniSOG-mCherry)⁸を用いて、同様に標識することができる。Or42aシナプス終末は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と透過型電子顕微鏡を組み合わせてイメージングできます。Or42aシナプス糸球体の剪定はEBの用量依存的であり、時限臭気体験の濃度にスケーリングすることを示しています。ビヒクルとして使用される鉱物油に溶解するEB臭気物質の割合は、発生段階の動物における臭気物質曝露の時間時間と同様に、さまざまです。最後に、VM7神経支配蛍光の強度と体積を測定することにより、シナプス糸球体の剪定の程度を分析するために使用される方法を示します。シナプス数は、標識されたシナプス点をカウントし、透過型電子顕微鏡⁸を用いてシナプス超微細構造パラメータを測定することによっても定量化することができる。全体として、ここに示すプロトコルは、若年臨界期にショウジョウバエの嗅覚回路シナプス接続の剪定を媒介する細胞および分子メカニズムの両方の体系的な解剖を可能にする強力なアプローチです。この研究で説明した一般的な臭気曝露の設定は、他の臭気を使用した以前の研究で利用され、他の糸球体^3,7を分析しました。

プロトコル

1.臭気物質への曝露

1. 細い絵筆を使用して、40〜50匹の発達段階の動物をファレートダークサペ(25°Cでの蛹化後90 + h)として、標準的なコーンミール糖蜜食品を含む25 mm x 95 mmのポリスチレン ショウジョ ウバエバイアルに選別します(図1A)。
2. ショウジョウバエのバイアルの端に細かいステンレス鋼の金網を置き、ハエを封じ込めると同時に、良好な空気の流れを確保します。ワイヤーメッシュキャップをテープで留めた透明フィルムでショウジョウバエのバイアルの側面に固定します。
3. 1.5 mLの微量遠心チューブに、1 mLの100%鉱油を入れるか(ビヒクルコントロール)、または別のチューブで鉱油中の酪酸エチル(EB)臭気物質を溶解して、所望の濃度(例:15%(150 μL)または25%(250 μL))を生成します。
4. 車両制御チューブまたは微量遠心チューブを直立させて、密閉可能な3700 mLグラスロック容器に入れます。テープを使用して、 チューブをショウジョウバエ のバイアルと一緒に臭気チャンバーの中央にしっかりと固定します(図1B)。
5. ステージングされた ショウジョウバエ の蛹バイアルを含む密封された車両制御チャンバーとEB臭気チャンバーを、加湿された(70%)温度制御された(25°C)インキュベーターに12時間/ 12時間の明暗サイクルに置きます。.
6. 臭気剤チャンバーへの曝露の4時間後に新たに閉じたハエを取り出し、20〜25匹のハエを新しくした臭気剤のあるチャンバー内の新鮮な ショウジョウバエ バイアルに迅速に移します(図1A、B)。閉じていない蛹を捨てます。
7. ハエをインキュベーター内の密閉された臭気チャンバーに合計24時間保管します。より長い臭気物質の投与のために、24時間ごとに新しく作られた臭気チャンバー内の新しい ショウジョウバエ バイアルにハエを迅速に移します。
8. 発生段階にあるハエを70%エタノールの皿に1分間浸して麻酔をかけ、即時の脳解剖および免疫細胞化学処理に備えます。

2. 脳の解剖

1. バイアルにビヒクルコントロール(100%鉱油のみ)またはEB曝露(%EB)のラベルを付けてマークし、脳の解剖とその後の処理の全期間にわたってこれらの指定を維持します。各遺伝子型/臭気条件に対して10〜20匹の動物を処理します。
2. 鉗子を使用して、麻酔をかけた1匹のハエを、作りたてのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)¹³の小さな皿に移します。フライをPBSに浸し、フライを完全に沈めた状態で完全な脳の解剖を続けます。
3. 両手に細かい(#5)鋭利な鉗子を持ち、フライの腹側を上にして置き、一方の鉗子で上部胸部をつかみ、もう一方の鉗子で頭を吻の下につかみます。脳に侵入しないように注意してください。
4. 両手で反対方向にそっと引っ張って、頭を体の他の部分から取り外します。頭は胸部から簡単に外れるはずです。分離されたヘッドを解剖のために残します(図1C)。
5. 以前に胸部をつかむために使用した鉗子を、吻の反対側の下にスライドさせます。外骨格のキューティクルを反対方向にそっと引っ張り始め、目の間で引き裂かれて脳が現れます。
6. 引っ張ると、脳の視葉が外骨格とともに分離することがあります。これを防ぐには、外骨格のキューティクルを取り外す際に、2つの鉗子でゆっくりと着実に引っ張ります(図1C、中央)。
7. 頭から外骨格キューティクルを引き続き取り外します。外骨格のすべての部分が取り外されていることを確認します。脂肪体や突出している気管など、脳に付着している組織をすべて取り除きます。
8. 固着を防ぐため、P20ピペットチップをPBS + 0.2% Triton-X 100(PBST)ですすいでください。解剖直後に、キャップ付きチューブ内の固定溶液(4%パラホルムアルデヒド(PFA)+ 4%スクロース)に脳を移します(図1C、D)。

3. 脳免疫細胞化学

1. 脳を室温(RT)で30分間固定し、エンドオーバーエンド回転させます。脳をチューブに入れたまま、ピペットで取り外し、危険な固定剤を適切に廃棄してください。固定脳をPBSで3回すばやく洗浄します(図1D)。
2. 脳は、回転後にチューブのキャップに詰まっていることがよくあります。すべての移送で常に危険である脳の偶発的な損失を防ぐために、液体をピペッティングする際に解剖顕微鏡を使用してください。
3. 抗体標識の準備として、PBST + 1%ウシ血清アルブミン(BSA)+ 0.5%正常ヤギ血清(NGS)でRTで固定脳を1時間ブロックし、端から端まで一定の回転を行います(図1D)。
4. ブロックを取り外し、選択した一次抗体をPBST + 0.2% BSA + 0.1% NGSで適切に希釈して脳をインキュベートします。脳を一晩(14-16時間)4°Cで一定回転させてインキュベートします。
   注:使用した抗体の例:ラット抗CadN(希釈1:50)¹⁴ でシナプス糸球体を標識し、ニワトリ抗GFP(1:1000)⁸ でOr42a-mCD8::GFPを標識(図1D)します。
5. 一次抗体をピペットで取り出します。PBSTで脳を3回、20分間それぞれ洗浄します。PBSTで0.2% BSA + 0.1% NGSで希釈した二次抗体で脳を2時間、室温で一定回転させてインキュベートします。
   注:あるいは、脳を4°Cで一晩(14〜16時間)インキュベートします。 PBSTで抗体を0.2%BSA + 0.1%NGSで希釈します。ここで使用した二次抗体:488種類のヤギ抗ニワトリ抗体(1:250)および546種類のヤギ抗ラット抗体(1:250)。
6. 二次抗体をピペットで取り出します。PBSTで脳を3回、20分間それぞれ洗浄します。最後に、PBSで脳を20分間洗浄します(図1D)。
7. ガラス顕微鏡スライド(75 mm x 25 mm)を準備するには、両面粘着テープの薄いストリップを2枚~25 mm離してスライドに追加します。これにより、脳が押しつぶされないようにするためのスペーサーが提供されます。
8. 脳をマウントするための2つのテープストリップの間に10~15μLの封入剤をピペットで固定します。P20ピペットチップをPBSTで事前にすすぎた状態で、標識した脳を顕微鏡スライドに移します(図1E)。
9. 脳が移されたら、細い絵筆を使用して脳を整列させ、触角葉が上を向いていることを確認します。触角ローブを含むアーチ型のこぶがある側を探します。
10. 脳の向きが適切になったら、ガラスのカバースリップ(No.1.5H)で覆い、カバースリップがテープに固定されていることを確認します。次に、カバーガラスの側面に追加の封入剤を充填します(図1E)。
11. カバーガラスの端を透明なマニキュアで密封します。スライドを完全に乾かしてから、後でイメージングするために冷蔵庫に保管します。

4. 共焦点イメージング

1. イメージングの前に、すべての脳スライドを遺伝子型と経験条件の両方に盲検化し、後でデコードするためにスライドにコード化されたラベルをマークします。
2. 63倍の油浸対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用します。ここに示されているすべての画像でZeiss 510 META顕微鏡を使用しています(図1F)。
3. 使用する蛍光色素に適したレーザーラインを使用してください。ここでは、触角葉シナプス糸球体とOr42a嗅覚ニューロンイメージングにArgon 488およびHeNe 543レーザーを使用します(図2)。
4. 両方のチャンネルの最適なゲインとオフセットを決定し、理想的には両方のチャンネルのゲインを750<750とオフセット≈0に保ちます。これは、バックグラウンドを制限しながら、信号対雑音比を最適にするために行われます。
5. イメージングを脳の中心に配置します。イメージングすると、VM7糸球体は、解剖中に食道を切除した後、脳の中央に残された穴に近接して存在します(図2A)。
   注:VM7糸球体は常に食道の開口部の近くにあります。ただし、正確な位置とサイズは、脳の解剖と取り付けの違いによってわずかに異なるため、イメージング時にはこの点を考慮に入れてください。
6. イメージング解像度と光学スライスの厚さを選択します。ここでは、1024 x 1024の解像度で、Zスタックスライスの厚さが0.37μmのものが使用されます。
7. 触角ローブを通して共焦点Zスタック投影全体を取り、VM7糸球体のOr42aニューロン神経支配全体を確実に捕捉します。

5. シナプス測定

1. 遺伝子型/条件盲検画像をフィジー(1.54f)にロードします。[ Image (画像)] > [Color (カラー)] > [Split Channels (分割チャネル)] をクリックして、レーザーラインチャネルを分割します。
2. Or42a嗅覚チャネルでは、Zスタック全体をスクロールしてOr42a神経支配を含むスライスを特定し、蛍光の開始位置と終了位置を特定します。
3. Or42a ニューロン神経支配を含むスライスのみを含む合計スライス投影を作成するには 、[Image > Stacks] > [Z Project] >の [Sum Slices] をクリックし、 目的の範囲を入力します。
4. フィジーでは、トップバーの Lasso(なげなわ )ツールをクリックして、VM7糸球体のOr42aニューロン神経支配の輪郭をトレースし、各脳側糸球体を独立して治療します(図3)。
5. 円周にZスタックスライスの数と各スライスの厚さを掛けて、VM7シナプス糸球体神経支配ボリュームを求めます。シナプス数を定量化するために、find maxima ツールを find maxima stacks マクロと共に使用して、アウトライン化された領域 ^8,15 のシナプス プンクタをカウントできます。

結果

図1 は、嗅覚経験依存性の臨界期匂い物質曝露と脳イメージング法のワークフローを示しています。このプロトコールは、脱皮直前のファレートダークサナギの年齢マッチングから始まります(図1A)。蛹を4時間匂いチャンバーに入れ、次に新たに閉じた成体をビヒクルコントロールまたは投与されたEB臭気チャンバーのいず...

ディスカッション

ここで紹介する匂い物質曝露と脳イメージングプロトコルは、幼少期の重要な時期に経験に依存する嗅覚ニューロンのシナプス糸球体の剪定を確実に誘導し、定量化するために使用できます。この治療パラダイムを利用して嗅覚回路のリモデリングを探求する以前の研究では、排泄^3,4,5の2^日目...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f