Зависимое от опыта ремоделирование синаптической связи обонятельных сенсорных нейронов ювенильного мозга в раннем критическом периоде жизни

Резюме

Мы описываем методы индуцирования и анализа зависимого от обоняния ремоделирования синаптических клубочков антенной доли в ювенильном мозге дрозофилы .

Аннотация

Обонятельный сенсорный опыт в раннем возрасте вызывает драматическое ремоделирование синаптических клубочков в ювенильном мозге дрозофилы , которое эмпирически дозозависимо, ограничено во времени и временно обратимо только в короткий, четко определенный критический период. Направленность ремоделирования синаптических связей мозговой цепи определяется специфическим запахом, действующим на класс рецепторов-респондентов обонятельных сенсорных нейронов. В целом, каждый класс нейронов экспрессирует только один рецептор запаха и иннервирует один обонятельный синаптический клубок. В генетической модели дрозофилы полный массив обонятельных клубочков был точно отображен по реакции на запах и поведенческому выходу. Одорант этилбутирата (EB) активирует нейроны рецептора Or42a, иннервирующие клубочек VM7. В ранний критический период жизни опыт БЭ приводит к дозозависимой элиминации синапсов в обонятельных сенсорных нейронах Or42a. Временные периоды воздействия дозированного одоранта БЭ позволяют исследовать зависимое от опыта отсечение цепных связей в ювенильном мозге. Конфокальная микроскопия синаптических клубочков антенной доли проводится с помощью трансгенных маркеров, управляемых рецепторами Or42a, которые обеспечивают количественную оценку количества синапсов и объема иннервации. Сложный генетический инструментарий дрозофилы позволяет проводить систематическое препарирование клеточных и молекулярных механизмов, опосредующих ремоделирование мозговых цепей.

Введение

Ремоделирование ювенильных мозговых цепей в раннем возрасте представляет собой последний шанс для крупномасштабных изменений синаптических связей, чтобы соответствовать очень изменчивой, непредсказуемой среде, в которой рождается животное. Будучи наиболее многочисленной группой животных, насекомые разделяют этот эволюционно консервативный, основополагающий механизм ремоделирования критического периода¹. Критические периоды открываются с началом сенсорного ввода, демонстрируют обратимые изменения контуров для оптимизации связности, а затем закрываются, когда силы стабилизации сопротивляются дальнейшему

протокол

1. Воздействие одоранта

1. С помощью тонкой кисти отсортируйте 40-50 животных на стадии развития в виде фаратных темных куколок (через 90+ ч после окукливания при 25 °C) в полистирольные флаконы дрозофилы размером 25 мм x 95 мм, содержащие стандартный корм из кукурузной патоки (рис. 1A).
2. Поместите тонкую проволочную сетку из нержавеющей стали на концы флаконов дрозофилы , чтобы сдерживать мух и при этом обеспечивать хороший поток воздуха. Закрепите крышки из проволочной сетки с помощью прозрачной пленки на боковой стороне флаконов дрозофилы .

Результаты

На рисунке 1 показан рабочий процесс для обонятельного опыта, критического периода, воздействия запаха и методов визуализации мозга. Протокол начинается с сопоставления возраста фаратных темных куколок непосредственно перед экслозией (ри.......

Обсуждение

Представленный здесь протокол воздействия одорантов и визуализации мозга может быть использован для надежного индуцирования и количественной оценки зависимой от опыта обрезки синаптических клубочков обонятельных сенсорных нейронов в ранний критический период жи.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f