A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים כאן שיטות להשראת וניתוח שיפוץ תלוי חוויית ריח של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה במוח הצעיר של דרוזופילה .

Abstract

חוויה חושית של חוש הריח בשלב מוקדם גורמת לעיצוב מחדש דרמטי של גלומרולי סינפטי במוח הצעיר של דרוזופילה , שהוא תלוי מינון חווייתי, מוגבל זמנית והפיך באופן זמני רק בתקופה קריטית קצרה ומוגדרת היטב. הכיווניות של עיצוב מחדש של קישוריות סינפטית במעגל המוח נקבעת על ידי הריח הספציפי הפועל על קבוצת קולטני המשיב של נוירונים חושי ריח. באופן כללי, כל סוג נוירונים מבטא רק קולטן ריח יחיד ומעצבב גלומרולוס סינפטי ריח יחיד. במודל הגנטי של דרוזופילה , המערך המלא של גלומרולי חוש הריח מופה במדויק על ידי היענות ריחנית ותפוקות התנהגותיות. ריח אתיל בוטיראט (EB) מפעיל נוירונים קולטן Or42a המעצבבים את גלומרולוס VM7. במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים, חוויית EB מניעה סילוק סינפסות תלויות מינון בנוירונים חושי הריח Or42a. פרקי זמן מתוזמנים של חשיפה לריח EB במינון מאפשרים חקירה של גיזום קישוריות מעגלים תלויי ניסיון במוח צעיר. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה נעשית עם סמנים טרנסגניים מונעי קולטן Or42a המספקים כימות של מספר הסינפסה ונפח העצבוב. ערכת הכלים הגנטית המתוחכמת של דרוזופילה מאפשרת דיסקציה שיטתית של המנגנונים התאיים והמולקולריים המתווכים את עיצוב מחדש של מעגלי המוח.

Introduction

העיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים במהלך החיים המוקדמים מייצג את ההזדמנות האחרונה לשינויי קישוריות סינפטיים בקנה מידה גדול כדי להתאים לסביבה המשתנה מאוד והבלתי צפויה שאליה נולד בעל חיים. כקבוצה הנפוצה ביותר של בעלי חיים, חרקים חולקים את מנגנון השימור האבולוציוני הזה, היסודי של התקופה הקריטית1. פרקי זמן קריטיים נפתחים עם תחילת הקלט החושי, מציגים שינויים הפיכים במעגל כדי לייעל את הקישוריות, ואז נסגרים כאשר כוחות הייצוב מתנגדים לשיפוץ נוסף2. חרקים מסתמכים במיוחד על מידע חושי ריח ומראים תקופה קריטית מוגדרת היטב של חוש הריח. דרוזופילה מספקת מודל גנטי מצוין לחקר תקופה קריטית תלוית ניסיון....

Protocol

1. חשיפה לריח

  1. בעזרת מכחול עדין, מיין 40-50 חיות בשלבים התפתחותיים כגלמים כהים (90+ שעות לאחר הגלמים ב-25°C) לבקבוקוני פוליסטירן דרוזופילה בגודל 25 מ"מ x 95 מ"מ המכילים מזון דבשת קמח תירס סטנדרטי (איור 1A).
  2. הניחו רשת תיל עדינה מפלדת אל-חלד על קצה בקבוקוני הדרוזופילה כדי להכיל את הזבובים תוך מתן זרימת אוויר טובה. הדקו את מכסי רשת התיל בעזרת סרט שקוף מודבק לצד בקבוקוני הדרוזופילה .
  3. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להניח 1 מ"ל של 100% שמן מינרלי (בקרת רכב) או להמיס את ריח אתיל בוטיראט (EB) בשמן מינרלי בצינור אחר כדי להפיק את הריכוז ....

תוצאות

איור 1 מראה את תהליך העבודה של חשיפה לריח, חשיפה לריחות תקופתיים קריטיים ושיטות הדמיה מוחית. הפרוטוקול מתחיל בהתאמת הגיל של הגלמים הכהים של הפאראט מיד לפני האקלוסיה (איור 1A). הגלמים מוכנסים לתאי ריח למשך 4 שעות, ואז הופכים בוגרים שזה עתה נסג.......

Discussion

ניתן להשתמש בפרוטוקול החשיפה לריח והדמיית המוח המוצגים כאן כדי לגרום ולכמת באופן מהימן גיזום גלומרולי סינפטי של נוירוני חוש הריח תלויי ניסיון במהלך תקופה קריטית מוקדמת בחיים. מחקרים מוקדמים יותר שהשתמשו בפרדיגמת טיפול זו כדי לחקור שיפוץ מעגלי ריח החלו בחשיפה לריחבי.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי Broadie Lab האחרים על תרומתם רבת הערך. הדמויות נוצרו באמצעות BioRender.com. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות MH084989 NS131557 לק"ב.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
For Odor Exposure
Drosophila vialsGenesee Scientific32-110
Ethyl butyrateSigma AldrichE15701
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Mineral oilSigma AldrichM3516
Odor chambersGlasslock
Paint brushesWinsor & NewtonSeries 233
ParafilmThermofisherS37440
Wire meshScienceware378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proofDecon Labs2801Diluted to 70%
ForcepsFine Science Tools11251-30Dumont #5
Paraformaldehyde Electron Microscope Sciences157-8Diluted to 4%
Petri dishesFisher Scientific 08-757-100B
Phosphate-buffered salineThermo Fisher Scientific70011-044Diluted to 1x
SucroseFisher Scientific BP220-1
SylgardElectron Microscope Sciences24236-10
Triton-X 100Fisher Scientific BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chickenInvitrogenA11039
546 goat anti-ratInvitrogenA11081
Bovine serum albumin Sigma AldrichA9647
Chicken anti-GFPAbcam13970
CoverslipsAvantor48366-06725 x 25 mm
Double-sided tapeScotch34-8724-5228-8
Fluoromount-G Electron Microscope Sciences17984-25
Microscope slidesFisher Scientific12-544-275 x 25 mm
Nail polishSally Hansen109Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serumSigma AldrichG9023
Rat anti-CadNDevelopmental Studies Hybridoma BankAB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscopeCarl ZeissZeiss 510 META 
Fiji softwareFijiVersion 2.14.0/1.54f

References

  1. English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
  2. Fabian, B., Sachse, S. Experience-....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Or42a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved