עיצוב מחדש תלוי ניסיון של נוירון חושי חושי הריח של המוח הצעיר קישוריות סינפטית בתקופה קריטית לחיים מוקדמים

Summary

אנו מתארים כאן שיטות להשראת וניתוח שיפוץ תלוי חוויית ריח של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה במוח הצעיר של דרוזופילה .

Abstract

חוויה חושית של חוש הריח בשלב מוקדם גורמת לעיצוב מחדש דרמטי של גלומרולי סינפטי במוח הצעיר של דרוזופילה , שהוא תלוי מינון חווייתי, מוגבל זמנית והפיך באופן זמני רק בתקופה קריטית קצרה ומוגדרת היטב. הכיווניות של עיצוב מחדש של קישוריות סינפטית במעגל המוח נקבעת על ידי הריח הספציפי הפועל על קבוצת קולטני המשיב של נוירונים חושי ריח. באופן כללי, כל סוג נוירונים מבטא רק קולטן ריח יחיד ומעצבב גלומרולוס סינפטי ריח יחיד. במודל הגנטי של דרוזופילה , המערך המלא של גלומרולי חוש הריח מופה במדויק על ידי היענות ריחנית ותפוקות התנהגותיות. ריח אתיל בוטיראט (EB) מפעיל נוירונים קולטן Or42a המעצבבים את גלומרולוס VM7. במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים, חוויית EB מניעה סילוק סינפסות תלויות מינון בנוירונים חושי הריח Or42a. פרקי זמן מתוזמנים של חשיפה לריח EB במינון מאפשרים חקירה של גיזום קישוריות מעגלים תלויי ניסיון במוח צעיר. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה נעשית עם סמנים טרנסגניים מונעי קולטן Or42a המספקים כימות של מספר הסינפסה ונפח העצבוב. ערכת הכלים הגנטית המתוחכמת של דרוזופילה מאפשרת דיסקציה שיטתית של המנגנונים התאיים והמולקולריים המתווכים את עיצוב מחדש של מעגלי המוח.

Introduction

העיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים במהלך החיים המוקדמים מייצג את ההזדמנות האחרונה לשינויי קישוריות סינפטיים בקנה מידה גדול כדי להתאים לסביבה המשתנה מאוד והבלתי צפויה שאליה נולד בעל חיים. כקבוצה הנפוצה ביותר של בעלי חיים, חרקים חולקים את מנגנון השימור האבולוציוני הזה, היסודי של התקופה הקריטית¹. פרקי זמן קריטיים נפתחים עם תחילת הקלט החושי, מציגים שינויים הפיכים במעגל כדי לייעל את הקישוריות, ואז נסגרים כאשר כוחות הייצוב מתנגדים לשיפוץ נוסף². חרקים מסתמכים במיוחד על מידע חושי ריח ומראים תקופה קריטית מוגדרת היטב של חוש הריח. דרוזופילה מספקת מודל גנטי מצוין לחקר תקופה קריטית תלוית ניסיון....

Protocol

1. חשיפה לריח

1. בעזרת מכחול עדין, מיין 40-50 חיות בשלבים התפתחותיים כגלמים כהים (90+ שעות לאחר הגלמים ב-25°C) לבקבוקוני פוליסטירן דרוזופילה בגודל 25 מ"מ x 95 מ"מ המכילים מזון דבשת קמח תירס סטנדרטי (איור 1A).
2. הניחו רשת תיל עדינה מפלדת אל-חלד על קצה בקבוקוני הדרוזופילה כדי להכיל את הזבובים תוך מתן זרימת אוויר טובה. הדקו את מכסי רשת התיל בעזרת סרט שקוף מודבק לצד בקבוקוני הדרוזופילה .
3. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להניח 1 מ"ל של 100% שמן מינרלי (בקרת רכב) או להמיס את ריח אתיל בוטיראט (EB) בשמן מינרלי בצינור אחר כדי להפיק את הריכוז ....

תוצאות

איור 1 מראה את תהליך העבודה של חשיפה לריח, חשיפה לריחות תקופתיים קריטיים ושיטות הדמיה מוחית. הפרוטוקול מתחיל בהתאמת הגיל של הגלמים הכהים של הפאראט מיד לפני האקלוסיה (איור 1A). הגלמים מוכנסים לתאי ריח למשך 4 שעות, ואז הופכים בוגרים שזה עתה נסג.......

Discussion

ניתן להשתמש בפרוטוקול החשיפה לריח והדמיית המוח המוצגים כאן כדי לגרום ולכמת באופן מהימן גיזום גלומרולי סינפטי של נוירוני חוש הריח תלויי ניסיון במהלך תקופה קריטית מוקדמת בחיים. מחקרים מוקדמים יותר שהשתמשו בפרדיגמת טיפול זו כדי לחקור שיפוץ מעגלי ריח החלו בחשיפה לריח^בי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f