עיצוב מחדש תלוי ניסיון של נוירון חושי חושי הריח של המוח הצעיר קישוריות סינפטית בתקופה קריטית לחיים מוקדמים

Summary

אנו מתארים כאן שיטות להשראת וניתוח שיפוץ תלוי חוויית ריח של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה במוח הצעיר של דרוזופילה .

Abstract

חוויה חושית של חוש הריח בשלב מוקדם גורמת לעיצוב מחדש דרמטי של גלומרולי סינפטי במוח הצעיר של דרוזופילה , שהוא תלוי מינון חווייתי, מוגבל זמנית והפיך באופן זמני רק בתקופה קריטית קצרה ומוגדרת היטב. הכיווניות של עיצוב מחדש של קישוריות סינפטית במעגל המוח נקבעת על ידי הריח הספציפי הפועל על קבוצת קולטני המשיב של נוירונים חושי ריח. באופן כללי, כל סוג נוירונים מבטא רק קולטן ריח יחיד ומעצבב גלומרולוס סינפטי ריח יחיד. במודל הגנטי של דרוזופילה , המערך המלא של גלומרולי חוש הריח מופה במדויק על ידי היענות ריחנית ותפוקות התנהגותיות. ריח אתיל בוטיראט (EB) מפעיל נוירונים קולטן Or42a המעצבבים את גלומרולוס VM7. במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים, חוויית EB מניעה סילוק סינפסות תלויות מינון בנוירונים חושי הריח Or42a. פרקי זמן מתוזמנים של חשיפה לריח EB במינון מאפשרים חקירה של גיזום קישוריות מעגלים תלויי ניסיון במוח צעיר. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה נעשית עם סמנים טרנסגניים מונעי קולטן Or42a המספקים כימות של מספר הסינפסה ונפח העצבוב. ערכת הכלים הגנטית המתוחכמת של דרוזופילה מאפשרת דיסקציה שיטתית של המנגנונים התאיים והמולקולריים המתווכים את עיצוב מחדש של מעגלי המוח.

Introduction

העיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים במהלך החיים המוקדמים מייצג את ההזדמנות האחרונה לשינויי קישוריות סינפטיים בקנה מידה גדול כדי להתאים לסביבה המשתנה מאוד והבלתי צפויה שאליה נולד בעל חיים. כקבוצה הנפוצה ביותר של בעלי חיים, חרקים חולקים את מנגנון השימור האבולוציוני הזה, היסודי של התקופה הקריטית¹. פרקי זמן קריטיים נפתחים עם תחילת הקלט החושי, מציגים שינויים הפיכים במעגל כדי לייעל את הקישוריות, ואז נסגרים כאשר כוחות הייצוב מתנגדים לשיפוץ נוסף². חרקים מסתמכים במיוחד על מידע חושי ריח ומראים תקופה קריטית מוגדרת היטב של חוש הריח. דרוזופילה מספקת מודל גנטי מצוין לחקר תקופה קריטית תלוית ניסיון זו במוח הצעיר. חוויית הריח בימים הראשונים שלאחר האקלוסיה מניעה שינויים מרשימים בקישוריות המעגלים בגלומרולי^{סינפטי 3,4} המזוהה בנפרד. כיוון השיפוץ תלוי בחוויית הקלט הספציפית של הריח. ריחות מסוימים גורמים לעלייה בנפח הגלומרולוס הסינפטי במשך מספר ימים לאחר האקלוסיה (dpe)3,5,6,7, בעוד שריחות אחרים גורמים לחיסול מהיר של סינפסות במהלך התקופה הקריטית של 0-2 dpe, וכתוצאה מכך נפח העצבוב ^8,9,10 ירד. באופן ספציפי, חוויית הריח של אתיל בוטיראט (EB) מניעה גיזום סינפטי תלוי מינון של נוירוני קולטן הריח Or42a רק במהלך תקופה קריטית זו של תחילת החיים⁸. סילוק הסינפסה הפיך לחלוטין על ידי ויסות קלט ריח EB בתקופה הקריטית, אך הופך לקבוע לאחר סגירת התקופה הקריטית. גיזום סינפטי תלוי ניסיון ריח זה מספק מערכת ניסיונית רבת ערך כדי להבהיר את המנגנונים המוגבלים זמנית העומדים בבסיס עיצוב מחדש של מעגלי מוח צעירים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המשמש להשראת וניתוח גיזום סינפטי תלוי ניסיון EB של נוירונים חושי חוש הריח של קולטן Or42a במהלך התקופה הקריטית המוקדמת בחיים. אנו מראים כי הדקים סינפטיים Or42a באונה האנטנלית VM7 glomerulus יכולים להיות מסומנים באופן ספציפי על ידי נהיגה טרנסגנית של סמן mCD8::GFP הקשור לקרום, או מאוחה ישירות למקדם Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ או באמצעות מערכת הביטוי הבינארי Gal4/UAS (Or42a-Gal4 נהיגה UAS-mCD8::GFP)¹². ניתן לתייג באופן דומה סינפסות נוירונים בודדות Or42a באמצעות ביטוי מהונדס ממוקד של סמני אזור פעיל קדם-סינפטיים המאוחים למערך של תגים פלואורסצנטיים (לדוגמה, Bruchpilot::RFP)⁸ או אות צפוף אלקטרונים עבור אנליזות סינפסות אולטרה-מבניות (למשל, miniSOG-mCherry)⁸. ניתן לצלם הדקים סינפטיים Or42a בשילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מראים כי גיזום גלומרולי סינפטי Or42a תלוי במינון EB, ומשתנה לריכוז חוויית הריח המתוזמנת. אחוז ריח EB המומס בשמן מינרלי המשמש כרכב יכול להיות מגוון, כמו גם משך הזמן המתוזמן של החשיפה לריח בבעלי חיים בשלב התפתחותי. לבסוף, אנו מראים את השיטות המשמשות לניתוח היקף הגיזום הגלומרולי הסינפטי על ידי מדידת עוצמת פלואורסצנטיות ונפח העצבוב של VM7. ניתן לכמת את מספר הסינפסות גם על ידי ספירת פונקטה סינפטית מסומנת ועל ידי מדידת פרמטרים של אולטרה-מבנה סינפטי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת⁸. בסך הכל, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גישה רבת עוצמה המאפשרת דיסקציה שיטתית של מנגנונים תאיים ומולקולריים כאחד המתווכת קישוריות סינפטית של מעגל הריח דרוזופילה במהלך תקופה קריטית לנוער. מערך החשיפה הכללי לריחות המתואר במחקר זה שימש במחקרים קודמים תוך שימוש בריחות אחרים וקביעת גלומרולי ^3,7 אחרים.

Protocol

1. חשיפה לריח

1. בעזרת מכחול עדין, מיין 40-50 חיות בשלבים התפתחותיים כגלמים כהים (90+ שעות לאחר הגלמים ב-25°C) לבקבוקוני פוליסטירן דרוזופילה בגודל 25 מ"מ x 95 מ"מ המכילים מזון דבשת קמח תירס סטנדרטי (איור 1A).
2. הניחו רשת תיל עדינה מפלדת אל-חלד על קצה בקבוקוני הדרוזופילה כדי להכיל את הזבובים תוך מתן זרימת אוויר טובה. הדקו את מכסי רשת התיל בעזרת סרט שקוף מודבק לצד בקבוקוני הדרוזופילה .
3. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להניח 1 מ"ל של 100% שמן מינרלי (בקרת רכב) או להמיס את ריח אתיל בוטיראט (EB) בשמן מינרלי בצינור אחר כדי להפיק את הריכוז הרצוי (למשל, 15% (150 μL) או 25% (250 μL)).
4. הניחו את צינורות בקרת הרכב או המיקרוצנטריפוגות הריחניות זקופות בתוך מיכל Glasslock אטום בנפח 3700 מ"ל. בעזרת נייר דבק, עגנו היטב את הצינורות במרכז תאי הריח יחד עם בקבוקוני הדרוזופילה (איור 1B).
5. הניחו את בקרת הרכב האטומה ואת תאי הריח EB המכילים את בקבוקוני הגלמים המבוימים של דרוזופילה לאינקובטור לח (70%), מבוקר טמפרטורה (25°C) במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות.
6. הוציאו את הזבובים שזה עתה נסגרו לאחר 4 שעות של חשיפה לתא הריח, והעבירו במהירות 20-25 זבובים לבקבוקוני דרוזופילה טריים בתאים עם ריח טרי (איור 1A,B). השליכו את הגלמים הלא סגורים.
7. שמרו את הזבובים בתאי הריח האטומים שלהם באינקובטורים למשך 24 שעות בסך הכל. למינון ארוך יותר של ריחנים, העבירו במהירות את הזבובים לבקבוקוני דרוזופילה חדשים בתאי ריח טריים כל 24 שעות.
8. הרדימו את הזבובים בשלב התפתחותי על ידי טבילתם בצלוחית של 70% אתנול למשך דקה אחת כהכנה לדיסקציה מיידית של המוח ולעיבוד אימונוציטוכימי.

2. דיסקציה מוחית

1. סמן בקבוקונים כבקרת רכב (100% שמן מינרלי בלבד) או EB חשוף (% EB) על ידי תיוג ושמירה על כינויים אלה למשך כל משך הדיסקציה המוחית והעיבוד שלאחר מכן. תהליך 10-20 בעלי חיים עבור כל מצב גנוטיפ/ריח.
2. בעזרת מלקחיים, העבירו זבוב מורדם בודד לתוך צלחת קטנה של מלח טרי חוצץ פוספטים (PBS)¹³. לטבול את הזבוב ב-PBS ולהמשיך בדיסקציה מוחית מלאה כשהזבוב שקוע במלואו.
3. עם מלקחיים מחודדים עדינים (# 2) בשתי הידיים, הניחו את הצד הגחוני של הזבוב למעלה ואחזו את בית החזה העליון במלקחיים אחת ואת הראש מתחת לחוטם עם המלקחיים האחרים. היזהרו לא לחדור למוח.
4. הסר את הראש משאר הגוף על ידי משיכה עדינה לכיוונים מנוגדים בשתי הידיים. הראש צריך בקלות להתנתק מבית החזה; השאירו את הראש המבודד לדיסקציה (איור 1C).
5. החלק את המלקחיים ששימשו בעבר לאחיזת בית החזה מתחת לצד הנגדי של החוטם. התחל למשוך בעדינות את הקוטיקולה השלד החיצוני בכיוונים מנוגדים, כך שהוא קורע בין העיניים כדי לחשוף את המוח.
6. בעת המשיכה, האונות האופטיות במוח עשויות להיפרד יחד עם השלד החיצוני. כדי למנוע זאת, השתמשו במשיכה איטית ויציבה עם שתי המלקחיים תוך הסרת הקוטיקולה של השלד החיצוני (איור 1C, באמצע).
7. המשך להסיר את הקוטיקולה של השלד החיצוני מהראש. ודא שכל חלקי השלד החיצוני מוסרים. הסר את כל הרקמות המחוברות למוח, כולל גוף השומן וכל קנה נשימה מקרין.
8. למניעת הידבקות, יש לשטוף קצה פיפטה P20 עם PBS + 0.2% Triton-X 100 (PBST). מיד לאחר הנתיחה, העבירו את המוחות לתמיסת הקיבוע (4% פרפורמלדהיד (PFA) + 4% סוכרוז) בצינור סגור (איור 1C,D).

3. אימונוציטוכימיה במוח

1. תקן את המוח למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם סיבוב מקצה לקצה. תוך שמירה על המוח בצינור, פיפטה להיפטר כראוי קיבוע מסוכן. שטפו במהירות מוחות קבועים פי 3 עם PBS (איור 1D).
2. לעתים קרובות ניתן למצוא מוחות תקועים במכסה הצינורות לאחר סיבוב. כדי למנוע אובדן מוחות בשוגג, המהווה סכנה מתמדת בכל ההעברות, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה בזמן שפיכת נוזלים.
3. כהכנה לתיוג נוגדנים, חסמו את המוח הקבוע למשך שעה אחת ב-RT ב-PBST + אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) + סרום עיזים רגיל 0.5% (NGS) עם סיבוב קבוע מקצה לקצה (איור 1D).
4. הסר את הבלוק ודגור על מוחות עם הנוגדן הראשוני שנבחר מדולל כראוי ב- PBST + 0.2% BSA + 0.1% NGS. לדגור על המוח במשך הלילה (14-16 שעות) ב 4 ° C עם סיבוב קבוע.
   הערה: נוגדנים לדוגמה בשימוש: עכברוש אנטי-CadN (דילול 1:50)¹⁴ כדי לתייג גלומרולי סינפטי ועוף אנטי-GFP (1:1000)⁸ כדי לתייג Or42a-mCD8::GFP (איור 1D).
5. פיפטה מהנוגדן הראשוני. שטפו את המוחות 3 פעמים במשך 20 דקות כל אחד עם PBST. לדגור על מוחות עם נוגדנים משניים מדוללים ב-PBST עם 0.2% BSA + 0.1% NGS במשך שעתיים ב-RT עם סיבוב קבוע.
   הערה: לחלופין, לדגור על המוח במשך הלילה (14-16 שעות) ב 4 ° C. נוגדנים מדוללים ב- PBST עם 0.2% BSA + 0.1% NGS; נוגדנים משניים המשמשים כאן: 488 עיזים נגד עוף (1:250) ו-546 נגד חולדות עיזים (1:250).
6. פיפטה מהנוגדנים המשניים. שטפו את המוחות 3 פעמים במשך 20 דקות כל אחד עם PBST. סיימו על-ידי שטיפת מוחות במשך 20 דקות עם PBS (איור 1D).
7. הכן שקופיות מיקרוסקופ זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) על ידי הוספת שתי רצועות דקות של סרט דבק דו צדדי לשקופית ~ 25 מ"מ זו מזו. זה מספק ספייסר כדי למנוע ריסוק המוח.
8. פיפטה ~ 10-15 μL של אמצעי הרכבה בין שתי רצועות הסרט כדי להרכיב את המוח. עם קצה פיפטה P20 שנשטף מראש עם PBST, העבירו את המוחות המסומנים אל שקופית המיקרוסקופ (איור 1E).
9. לאחר העברת המוחות, השתמשו במברשת צבע עדינה כדי ליישר אותם, וודאו שאונות האנטנה פונות כלפי מעלה. חפש את הצד שיש לו את הדבשת המקושתת, אשר יכיל את אונות האנטנה.
10. ברגע שהמוח מכוון כראוי, כסו אותו בכיסוי זכוכית (מס' 1.5H), וודאו שהכיסוי מאובטח על סרט הדבק. לאחר מכן, מלאו את דפנות הכיסוי באמצעי הרכבה נוסף (איור 1E).
11. אטמו את שולי הכיסוי בלק שקוף. הניחו לשקופית להתייבש היטב ואחסנו אותה במקרר לצורך הדמיה נוספת.

4. הדמיה קונפוקלית

1. עיוור את כל שקופיות המוח הן לגנוטיפ והן לחוות מצבים לפני הדמיה על ידי סימון השקופית בתווית מקודדת לפענוח מאוחר יותר.
2. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם מטרה טבילת שמן פי 63. אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss 510 META בכל התמונות שמוצגות כאן (איור 1F).
3. השתמש בקווי לייזר מתאימים עבור הפלואורופורים שבהם נעשה שימוש. כאן, השתמשו בלייזר Argon 488 ו-HeNe 543 עבור גלומרולי סינפטי של אונת האנטנה והדמיית נוירון חושי ריח Or42a (איור 2).
4. קבע את הרווח והקיזוז האופטימליים עבור שני הערוצים, תוך שמירה אידיאלית על הרווח עבור שני הערוצים <750 והיסט ≈0. זה נעשה כדי להבטיח את האות לרעש הוא אופטימלי תוך הגבלת הרקע.
5. מיקום הדמיה למרכז המוח. בעת הדמיה, הגלומרולי VM7 שוכן בסמיכות לחור שנותר במרכז המוח לאחר הסרת הוושט במהלך דיסקציה (איור 2A).
   הערה: גלומרולי VM7 תמיד יהיה קרוב לפתיחת הוושט. עם זאת, המיקום והגודל המדויקים משתנים מעט בהתבסס על דיסקציה מוחית והבדלי התגברות, לכן קחו זאת בחשבון בעת ההדמיה.
6. בחרו ברזולוציית ההדמיה ובעובי הפרוסה האופטית. כאן, 1024 x 1024 ברזולוציה עם עובי פרוסת Z של 0.37 מיקרומטר משמש.
7. בצע הקרנה קונפוקלית שלמה של מחסנית Z דרך אונת האנטנה, כדי להבטיח את לכידתו של עצבוב הנוירונים המלא Or42a של גלומרולי VM7.

5. מדידות סינפטיות

1. טען את התמונה עיוורת הגנוטיפ/מצב לתוך פיג'י (1.54f). פצל את ערוצי קו הלייזר על-ידי לחיצה על Image > Color > Split Channels.
2. בערוץ חוש הריח Or42a, קבעו אילו פרוסות מכילות את העצבוב Or42a על ידי גלילה לאורך כל ערימת Z, וזהו היכן הפלואורסצנטיות מתחילה ומסתיימת.
3. צור הקרנת סכום פרוסות הכוללת רק פרוסות המכילות עצבוב נוירונים Or42a על-ידי לחיצה על Image > Stacks > Z Project > Sum Slices והזנת הטווח הרצוי.
4. בפיג'י, לחצו על הכלי לאסו בסרגל העליון כדי לעקוב אחר קווי המתאר של עצבוב תאי העצב Or42a בגלומרולוס VM7, ומטפלים בכל גלומרולוס צד במוח בנפרד (איור 3).
5. הכפל את ההיקף במספר פרוסות ערימת Z ובעובי של כל פרוסה כדי לקבל את נפח העצבוב של גלומרולוס סינפטי VM7. כדי לכמת את מספר הסינפסה, ניתן להשתמש בכלי חיפוש מקסימלי יחד עם המאקרו find maxima stacks כדי לספור את synapse puncta באזור המתאר ^8,15.

תוצאות

איור 1 מראה את תהליך העבודה של חשיפה לריח, חשיפה לריחות תקופתיים קריטיים ושיטות הדמיה מוחית. הפרוטוקול מתחיל בהתאמת הגיל של הגלמים הכהים של הפאראט מיד לפני האקלוסיה (איור 1A). הגלמים מוכנסים לתאי ריח למשך 4 שעות, ואז הופכים בוגרים שזה עתה נסג...

Discussion

ניתן להשתמש בפרוטוקול החשיפה לריח והדמיית המוח המוצגים כאן כדי לגרום ולכמת באופן מהימן גיזום גלומרולי סינפטי של נוירוני חוש הריח תלויי ניסיון במהלך תקופה קריטית מוקדמת בחיים. מחקרים מוקדמים יותר שהשתמשו בפרדיגמת טיפול זו כדי לחקור שיפוץ מעגלי ריח החלו בחשיפה לריח^בי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f