Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

요약

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

초기의 후각 감각 경험은 초파리 청소년 뇌에서 극적인 시냅스 사구체 리모델링을 유도하며, 이는 경험적으로 용량 의존적이고, 시간적으로 제한되며, 짧고 잘 정의된 결정적 기간에만 일시적으로 가역적입니다. 뇌 회로 시냅스 연결성 리모델링의 방향성은 후각 감각 뉴런의 반응 수용체 부류에 작용하는 특정 냄새 물질에 의해 결정됩니다. 일반적으로 각 뉴런 클래스는 단일 냄새 수용체만 발현하고 단일 후각 시냅스 사구체를 자극합니다. 초파리(Drosophila ) 유전자 모델에서, 후각 사구체의 전체 배열은 냄새 반응성과 행동 출력에 의해 정확하게 매핑되었습니다. 에틸 부티레이트(EB) 냄새 물질은 VM7 사구체를 자극하는 Or42a 수용체 뉴런을 활성화합니다. 생애 초기의 임계 기간 동안, EB 경험은 Or42a 후각 감각 뉴런에서 용량 의존적 시냅스 제거를 주도합니다. 투여된 EB 냄새 물질에 노출된 일정 기간을 통해 청소년 뇌의 경험 의존적 회로 연결성 가지치기를 조사할 수 있습니다. 더듬이엽 시냅스 사구체의 공초점 현미경 이미징은 시냅스 수와 신경 분포 부피의 정량화를 제공하는 Or42a 수용체 기반 형질전환 마커로 수행됩니다. 정교한 Drosophila genetic toolkit은 뇌 회로 리모델링을 매개하는 세포 및 분자 메커니즘의 체계적인 해부를 가능하게 합니다.

서문

어린 시절 동안 유년기의 뇌 회로를 개조하는 것은 동물이 태어나는 매우 가변적이고 예측할 수 없는 환경에 맞게 대규모 시냅스 연결성 변화를 일으킬 수 있는 마지막 기회를 나타냅니다. 가장 풍부한 동물 그룹인 곤충은 진화적으로 보존된 근본적인 임계시기 리모델링 메커니즘¹을 공유합니다. 임계 기간은 감각 입력의 시작과 함께 시작되고, 연결성을 최적화하기 위해 가역적인 회로 변화를 보이고, 안정화 힘이 추가 리모델링에 저항할 때 닫힙니다². 곤충은 특히 후각 감각 정보에 의존하며 잘 정의된 후각 임계 기간을 보여줍니다. 초파리(Drosophila)는 청소년 뇌에서 이러한 경험 의존적 임계 기간을 조사하기 위한 우수한 유전 모델을 제공합니다. 에클로젼 후 처음 몇 일 동안의 냄새 경험은 개별적으로 식별된 시냅스 사구체에서 현저한 회로 연결성 변화를 주도합니다 ^3,4. 리모델링의 방향은 특정 투입 냄새 경험에 따라 다릅니다. 일부 냄새 유발 물질은 폐색 (dpe) 후 몇 일 동안 시냅스 사구체 부피를 증가시키는 반면^,....

프로토콜

1. 냄새 노출

1. 가는 붓을 사용하여 40-50마리의 발달 단계에 있는 동물을 pharate dark pupae(25°C에서 번데기 후 90+ 시간)로 분류하여 표준 옥수수 가루 당밀 식품이 들어 있는 25mm x 95mm 폴리스티렌 초파리 바이알로 분류합니다(그림 1A).
2. Drosophila 바이알 끝에 미세한 스테인리스 스틸 와이어 메쉬를 놓아 파리를 격리하는 동시에 공기 흐름을 원활하게 합니다. 테이프로 감싼 투명 필름으로 철망 캡을 Drosophila 바이알 측면에 고정합니다.
3. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 100% 미네랄 오일 1mL를 넣거나(차량 제어) 에틸 부티레이트(EB) 냄새제를 다른 튜브의 미네랄 오일에 용해시켜 원하는 농도(예: 15%(150μL) 또는 25%(250μL))를 생성합니다.
4. 차량 제어 또는 냄새가 나는 마이크로 원심분리기 튜브를 밀폐된 3700mL Glasslock 용기에 똑바로 세웁니다. 테이프를 사용하여 Drosophila 바이알과 함께 냄새 챔버 중앙에 튜브를 단단히 고정합니....

토론

여기에 제시된 냄새 노출 및 뇌 영상 프로토콜은 생애 초기의 중요한 기간 동안 경험 의존적 후각 감각 뉴런 시냅스 사구체 가지치기를 안정적으로 유도하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 후각 회로 리모델링을 탐구하기 위해 이 치료 패러다임을 활용한 초기 연구는 폐막 후 2^일째에 냄새 노출을 시작했습니다 ^3,4,5

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f