Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

요약

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

초록

초기의 후각 감각 경험은 초파리 청소년 뇌에서 극적인 시냅스 사구체 리모델링을 유도하며, 이는 경험적으로 용량 의존적이고, 시간적으로 제한되며, 짧고 잘 정의된 결정적 기간에만 일시적으로 가역적입니다. 뇌 회로 시냅스 연결성 리모델링의 방향성은 후각 감각 뉴런의 반응 수용체 부류에 작용하는 특정 냄새 물질에 의해 결정됩니다. 일반적으로 각 뉴런 클래스는 단일 냄새 수용체만 발현하고 단일 후각 시냅스 사구체를 자극합니다. 초파리(Drosophila ) 유전자 모델에서, 후각 사구체의 전체 배열은 냄새 반응성과 행동 출력에 의해 정확하게 매핑되었습니다. 에틸 부티레이트(EB) 냄새 물질은 VM7 사구체를 자극하는 Or42a 수용체 뉴런을 활성화합니다. 생애 초기의 임계 기간 동안, EB 경험은 Or42a 후각 감각 뉴런에서 용량 의존적 시냅스 제거를 주도합니다. 투여된 EB 냄새 물질에 노출된 일정 기간을 통해 청소년 뇌의 경험 의존적 회로 연결성 가지치기를 조사할 수 있습니다. 더듬이엽 시냅스 사구체의 공초점 현미경 이미징은 시냅스 수와 신경 분포 부피의 정량화를 제공하는 Or42a 수용체 기반 형질전환 마커로 수행됩니다. 정교한 Drosophila genetic toolkit은 뇌 회로 리모델링을 매개하는 세포 및 분자 메커니즘의 체계적인 해부를 가능하게 합니다.

서문

어린 시절 동안 유년기의 뇌 회로를 개조하는 것은 동물이 태어나는 매우 가변적이고 예측할 수 없는 환경에 맞게 대규모 시냅스 연결성 변화를 일으킬 수 있는 마지막 기회를 나타냅니다. 가장 풍부한 동물 그룹인 곤충은 진화적으로 보존된 근본적인 임계시기 리모델링 메커니즘¹을 공유합니다. 임계 기간은 감각 입력의 시작과 함께 시작되고, 연결성을 최적화하기 위해 가역적인 회로 변화를 보이고, 안정화 힘이 추가 리모델링에 저항할 때 닫힙니다². 곤충은 특히 후각 감각 정보에 의존하며 잘 정의된 후각 임계 기간을 보여줍니다. 초파리(Drosophila)는 청소년 뇌에서 이러한 경험 의존적 임계 기간을 조사하기 위한 우수한 유전 모델을 제공합니다. 에클로젼 후 처음 몇 일 동안의 냄새 경험은 개별적으로 식별된 시냅스 사구체에서 현저한 회로 연결성 변화를 주도합니다 ^3,4. 리모델링의 방향은 특정 투입 냄새 경험에 따라 다릅니다. 일부 냄새 유발 물질은 폐색 (dpe) 후 몇 일 동안 시냅스 사구체 부피를 증가시키는 반면^,3,5,6,7 다른 냄새 물질은 0-2 dpe 임계 기간 동안 시냅스를 빠르게 제거하여 신경 분포 부피 ^8,9,10을 감소시킵니다. 특히, 에틸 부티레이트(ethyl butyrate, EB) 냄새 경험은 이 생애 초기의 임계 기간 동안에만 Or42a 후각 수용체 뉴런의 용량 의존적 시냅스 가지치기를 촉진한다⁸. 시냅스 제거는 임계 기간 내에 EB 냄새 주입을 조절함으로써 완전히 되돌릴 수 있지만 임계 기간이 끝나면 영구적이 됩니다. 이 후각 경험에 의존하는 시냅스 가지치기는 청소년 뇌 회로 리모델링의 기저에 있는 시간적으로 제한된 메커니즘을 설명할 수 있는 귀중한 실험 시스템을 제공합니다.

여기에서는 생애 초기 결정적 기간 동안 Or42a 수용체 후각 감각 뉴런의 EB 경험 의존적 시냅스 가지치기를 유도하고 분석하는 데 사용되는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 더듬이엽 VM7 사구체의 Or42a 시냅스 말단이 Or42a 프로모터(Or42a-mCD8::GFP)¹¹에 직접 융합되거나 Gal4/UAS 이진 발현 시스템(Or42a-Gal4가 UAS-mCD8::GFP를 구동)¹²을 사용하여 막 테더링된 mCD8::GFP 마커를 형질전환으로 구동함으로써 특이적으로 표지될 수 있음을 보여줍니다. 개별 Or42a 뉴런 시냅스는 형광 태그 어레이(예: Bruchpilot::RFP)⁸ 또는 초구조적 시냅스 분석을 위한 전자 밀도 신호(예: miniSOG-mCherry)⁸에 융합된 시냅스전 활성 영역 마커의 표적 형질전환 발현을 사용하여 유사하게 표지할 수 있습니다. Or42a 시냅스 말단은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 투과 전자 현미경의 조합으로 이미징할 수 있습니다. 우리는 Or42a 시냅스 사구체 가지치기가 EB 용량에 따라 달라지며 시간 지정된 냄새 경험의 농도에 따라 확장됨을 보여줍니다. 매개체로 사용되는 미네랄 오일에 용해된 EB 냄새 물질의 비율은 다양할 수 있으며, 발달 단계에 있는 동물에서 냄새 물질에 노출되는 시간도 다양할 수 있습니다. 마지막으로, VM7 신경 분포 형광 강도 및 부피를 측정하여 시냅스 사구체 가지치기 정도를 분석하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 시냅스 수는 또한 표지된 시냅스 반점을 계산하고 투과 전자 현미경⁸을 사용하여 시냅스 초구조 매개변수를 측정함으로써 정량화할 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 표시된 프로토콜은 청소년 임계 기간 동안 초파리 후각 회로 시냅스 연결성 가지치기를 매개하는 세포 및 분자 메커니즘의 체계적인 해부를 가능하게 하는 강력한 접근 방식입니다. 이 연구에서 설명한 일반적인 냄새 노출 설정은 이전 연구에서 다른 냄새를 사용하고 다른 사구체를 분석하는 데 사용되었습니다 ^3,7.

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프로토콜

1. 냄새 노출

1. 가는 붓을 사용하여 40-50마리의 발달 단계에 있는 동물을 pharate dark pupae(25°C에서 번데기 후 90+ 시간)로 분류하여 표준 옥수수 가루 당밀 식품이 들어 있는 25mm x 95mm 폴리스티렌 초파리 바이알로 분류합니다(그림 1A).
2. Drosophila 바이알 끝에 미세한 스테인리스 스틸 와이어 메쉬를 놓아 파리를 격리하는 동시에 공기 흐름을 원활하게 합니다. 테이프로 감싼 투명 필름으로 철망 캡을 Drosophila 바이알 측면에 고정합니다.
3. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 100% 미네랄 오일 1mL를 넣거나(차량 제어) 에틸 부티레이트(EB) 냄새제를 다른 튜브의 미네랄 오일에 용해시켜 원하는 농도(예: 15%(150μL) 또는 25%(250μL))를 생성합니다.
4. 차량 제어 또는 냄새가 나는 마이크로 원심분리기 튜브를 밀폐된 3700mL Glasslock 용기에 똑바로 세웁니다. 테이프를 사용하여 Drosophila 바이알과 함께 냄새 챔버 중앙에 튜브를 단단히 고정합니다(그림 1B).
5. 스테이지된 Drosophila pharate 번데기 바이알이 들어있는 밀봉된 차량 제어 및 EB 냄새 챔버를 12시간/12시간 명암주 주기로 가습(70%), 온도 제어(25°C) 인큐베이터에 넣습니다.
6. 냄새 챔버에 4시간 노출된 후 새로 닫힌 파리를 제거하고 20-25마리의 파리를 갓 만든 냄새 물질이 있는 챔버의 신선한 초파리 바이알로 빠르게 옮깁니다(그림 1A, B). 닫히지 않은 번데기는 버리십시오.
7. 인큐베이터의 밀폐된 냄새 챔버에 파리를 총 24시간 동안 보관하십시오. 더 긴 취취제 투여를 위해 24시간마다 갓 만든 취취제 챔버에서 파리를 새로운 Drosophila 바이알로 빠르게 이송하십시오.
8. 즉각적인 뇌 박리 및 면역세포화학 처리를 준비하기 위해 발달 단계에 있는 파리를 70% 에탄올 접시에 1분 동안 담가 마취시킵니다.

2. 뇌 해부

1. 라벨링을 통해 바이알을 차량 제어(100% 미네랄 오일만 해당) 또는 EB 노출(% EB)로 표시하고 뇌 절개 및 후속 처리의 전체 기간 동안 이러한 지정을 유지합니다. 각 유전자형/냄새 상태에 대해 10-20마리의 동물을 처리합니다.
2. 겸자를 사용하여 마취된 파리 한 마리를 갓 만든 인산염 완충 식염수(PBS)¹³가 담긴 작은 접시에 옮깁니다. 파리를 PBS에 담그고 파리를 완전히 잠근 상태에서 전체 뇌 해부를 계속합니다.
3. 양손에 가늘고 (#5) 날카로운 집게를 놓고 플라이 복부 쪽을 위로 놓고 한 집게로 위쪽 흉부를 잡고 다른 집게로 아래의 머리를 잡습니다. 뇌에 침투하지 않도록 주의하십시오.
4. 양손으로 반대 방향으로 부드럽게 당겨 몸의 나머지 부분에서 머리를 제거합니다. 머리는 흉부에서 쉽게 분리되어야 합니다. 해부를 위해 격리된 머리를 그대로 둡니다(그림 1C).
5. 이전에 흉부를 잡기 위해 사용한 집게를 주둥이의 반대쪽 아래로 밀어 넣습니다. 외골격 큐티클을 반대 방향으로 부드럽게 당겨 눈 사이를 찢어 뇌를 드러내도록 합니다.
6. 당길 때 뇌 시신경엽이 외골격과 함께 분리될 수 있습니다. 이를 방지하려면 외골격 큐티클을 제거하면서 두 개의 겸자를 천천히 꾸준히 잡아당깁니다(그림 1C, 가운데).
7. 머리에서 외골격 표피를 계속 제거합니다. 외골격의 모든 부분이 제거되었는지 확인합니다. 뚱뚱한 몸체와 돌출된 기관을 포함하여 뇌에 부착된 모든 조직을 제거합니다.
8. 달라붙는 것을 방지하기 위해 P20 피펫 팁을 PBS + 0.2% Triton-X 100(PBST)으로 헹굽니다. 해부 직후 뇌를 뚜껑이 있는 튜브에 담긴 고정 용액(4% 파라포름알데히드(PFA) + 4% 자당)으로 옮깁니다(그림 1C,D).

3. 뇌 면역세포화학(Brain immunocytochemistry)

1. 엔드 투 엔드 회전으로 실온(RT)에서 30분 동안 뇌를 고정합니다. 뇌를 튜브에 유지하면서 피펫을 제거하고 위험한 고정액을 적절하게 폐기하십시오. PBS로 고정된 뇌를 3번 빠르게 세척합니다(그림 1D).
2. 뇌는 회전 후 튜브의 뚜껑에 끼어 있는 것을 종종 볼 수 있습니다. 모든 이식에서 지속적인 위험인 우발적인 뇌 손실을 방지하려면 액체를 피펫팅하는 동안 해부 현미경을 사용하십시오.
3. 항체 라벨링을 준비하기 위해 PBST + 1% 소 혈청 알부민(BSA) + 0.5% 정상 염소 혈청(NGS)에서 RT에서 1시간 동안 고정 뇌를 일정한 종단 간 회전으로 차단합니다(그림 1D).
4. 블록을 제거하고 선택한 1차 항체를 PBST + 0.2% BSA + 0.1% NGS에 적절하게 희석하여 뇌를 배양합니다. 일정한 회전으로 4 ° C에서 밤새 (14-16 시간) 뇌를 배양합니다.
   참고: 사용된 항체의 예: 시냅스 사구체를 표지하기 위한 쥐 항-CadN(희석 1:50)¹⁴ 및 Or42a-mCD8::GFP를 표지하기 위한 닭 항-GFP(1:1000)⁸.
5. 1차 항체를 피펫팅합니다. PBST로 각각 20분씩 3번씩 뇌를 세척합니다. 일정한 회전으로 RT에서 2시간 동안 0.2% BSA + 0.1% NGS로 PBST에 희석된 2차 항체로 뇌를 배양합니다.
   참고: 또는 4 °C에서 밤새(14-16시간) 뇌를 배양합니다. PBST에서 0.2% BSA + 0.1% NGS로 항체를 희석합니다. 2차 항체: 488 goat anti-chicken (1:250) and 546 goat anti-rat (1:250).
6. 2차 항체를 피펫팅합니다. PBST로 각각 20분씩 3번씩 뇌를 세척합니다. PBS로 20분 동안 뇌를 씻어 마무리합니다(그림 1D).
7. 유리 현미경 슬라이드(75mm x 25mm)를 준비합니다. 두 개의 얇은 양면 접착 테이프 스트립을 슬라이드에 ~25mm 간격으로 추가합니다. 이것은 뇌를 부수는 것을 방지하기 위한 스페이서를 제공합니다.
8. 뇌를 장착하기 위해 두 테이프 스트립 사이에 ~10-15μL의 장착 매체를 피펫팅합니다. PBST로 미리 헹궈진 P20 피펫 팁을 사용하여 라벨이 부착된 브레인을 현미경 슬라이드에 옮깁니다(그림 1E).
9. 뇌가 이식되면 가는 붓을 사용하여 정렬하고 더듬이엽이 위쪽을 향하도록 합니다. 더듬이 로브를 포함할 아치형 혹이 있는 면을 찾으십시오.
10. 뇌의 방향이 제대로 잡히면 유리 커버슬립(No. 1.5H)으로 덮어 커버슬립이 테이프에 단단히 고정되었는지 확인합니다. 그런 다음 커버슬립의 측면을 추가 장착 매체로 채웁니다(그림 1E).
11. 커버슬립의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 완전히 건조시킨 다음 후속 이미징을 위해 냉장고에 보관합니다.

4. 공초점 이미징

1. 이미징 전에 모든 뇌 슬라이드를 유전자형과 경험 상태 모두에 대해 블라인드 블라인드 하여 나중에 해독할 수 있도록 슬라이드에 암호화된 레이블을 표시합니다.
2. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경과 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하십시오. 여기에 표시된 모든 이미지에는 Zeiss 510 META 현미경이 사용되었습니다(그림 1F).
3. 사용된 형광단에 적합한 레이저 라인을 사용하십시오. 여기서는 Argon 488 및 HeNe 543 레이저를 사용하여 더듬이엽 시냅스 사구체 및 Or42a 후각 감각 뉴런 이미징을 수행합니다(그림 2).
4. 두 채널 모두에 대한 최적의 게인과 오프셋을 결정하며, 이상적으로는 두 채널 모두에 대한 게인 <750 및 오프셋 ≈0을 유지합니다. 이는 배경을 제한하면서 신호 대 잡음비가 최적이 되도록 하기 위해 수행됩니다.
5. 이미징을 뇌 중앙에 배치합니다. 이미징 시 VM7 사구체는 절개 중 식도를 제거한 후 뇌 중앙의 왼쪽 구멍에 근접하게 존재합니다(그림 2A).
   알림: VM7 사구체는 항상 식도 입구에 가깝습니다. 그러나 정확한 위치와 크기는 뇌 박리와 장착 차이에 따라 약간 다르므로 이미징 시 이 점을 고려해야 합니다.
6. 이미징 해상도(imaging resolution)와 optical slice 두께를 선택합니다. 여기서는 1024 x 1024 해상도와 0.37μm의 Z-스택 슬라이스 두께가 사용됩니다.
7. 더듬이 로브를 통해 전체 공초점 Z-stack 투영을 수행하여 VM7 사구체의 전체 Or42a 뉴런 신경 분포를 캡처합니다.

5. 시냅스 측정

1. 유전자형/조건맹 영상을 Fiji(1.54f)에 불러옵니다. 이미지 > 색상 > 채널 분할을 클릭하여 레이저 라인 채널을 분할합니다.
2. Or42a 후각 감각 채널에서 Z-스택 전체를 스크롤하여 형광이 시작되고 끝나는 위치를 식별하여 Or42a 신경 분포가 포함된 슬라이스를 확인합니다.
3. Image > Stacks > Z Project > Sum Slices를 클릭하고 원하는 범위를 입력하여 Or42a 뉴런 신경을 포함하는 슬라이스만 포함하는 합계 슬라이스 투영법을 만듭니다.
4. 피지에서는 상단 표시줄의 올가미 도구를 클릭하여 VM7 사구체의 Or42a 뉴런 신경 분포의 윤곽을 추적하여 각 뇌 쪽 사구체를 독립적으로 처리합니다(그림 3).
5. 둘레에 Z-stack 슬라이스의 수와 각 슬라이스의 두께를 곱하여 VM7 시냅스 사구체 신경 분포 부피를 얻습니다. 시냅스 수를 정량화하기 위해 최대 값 찾기 도구를 최대 스택 찾기 매크로와 함께 사용하여 윤곽이 표시된 영역^8,15에서 시냅스 점을 계산할 수 있습니다.

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결과

그림 1 은 후각 경험에 따른 임계 기간 냄새 노출 및 뇌 영상 방법에 대한 워크플로우를 보여줍니다. 이 프로토콜은 에클로젼 직전에 pharate dark pupae의 연령 일치로 시작합니다(그림 1A). 번데기를 4시간 동안 냄새 챔버에 넣은 다음 새로 닫힌 성체를 차량 제어 또는 투여된 EB 냄새 챔버에서 새 바이알로 뒤집습니다(

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토론

여기에 제시된 냄새 노출 및 뇌 영상 프로토콜은 생애 초기의 중요한 기간 동안 경험 의존적 후각 감각 뉴런 시냅스 사구체 가지치기를 안정적으로 유도하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 후각 회로 리모델링을 탐구하기 위해 이 치료 패러다임을 활용한 초기 연구는 폐막 후 2^일째에 냄새 노출을 시작했습니다 ^3,4,5

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f