Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi

Özet

Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.

Özet

Erken yaşam koku alma duyusal deneyimi, Drosophila çocuk beyninde, deneyimsel olarak doza bağımlı, zamansal olarak kısıtlı ve yalnızca kısa, iyi tanımlanmış bir kritik dönemde geçici olarak geri dönüşümlü olan dramatik sinaptik glomerül yeniden şekillenmesine neden olur. Beyin devresi sinaptik bağlantı yeniden şekillenmesinin yönlülüğü, koku alma duyu nöronlarının yanıt veren reseptör sınıfına etki eden spesifik koku verici tarafından belirlenir. Genel olarak, her nöron sınıfı sadece tek bir koku reseptörünü eksprese eder ve tek bir koku alma sinaptik glomerulusunu innerve eder. Drosophila genetik modelinde, koku alma glomerüllerinin tam dizisi, koku verici duyarlılığı ve davranışsal çıktı ile tam olarak haritalanmıştır. Etil bütirat (EB) koku verici, VM7 glomerulusunu innerve eden Or42a reseptör nöronlarını aktive eder. Erken yaşam kritik döneminde, EB deneyimi, Or42a koku alma duyu nöronlarında doza bağlı sinaps eliminasyonunu yönlendirir. Dozlanmış EB koku maruziyetinin zamanlanmış periyotları, çocuk beyninde deneyime bağlı devre bağlantı budamasının araştırılmasına izin verir. Anten lob sinaptik glomerüllerinin konfokal mikroskopi görüntülemesi, sinaps sayısı ve innervasyon hacminin ölçülmesini sağlayan Or42a reseptörü güdümlü transgenik belirteçlerle yapılır. Gelişmiş Drosophila genetik araç seti, beyin devresinin yeniden şekillenmesine aracılık eden hücresel ve moleküler mekanizmaların sistematik olarak incelenmesini sağlar.

Giriş

Erken yaşamda genç beyin devrelerinin yeniden şekillenmesi, bir hayvanın doğduğu oldukça değişken, öngörülemeyen ortama uyacak şekilde büyük ölçekli sinaptik bağlantı değişiklikleri için son şansı temsil eder. En bol bulunan hayvan grubu olan böcekler, bu evrimsel olarak korunmuş, temel kritik dönem yeniden şekillenme mekanizmasını paylaşırlar¹. Kritik dönemler, duyusal girdinin başlamasıyla açılır, bağlantıyı optimize etmek için tersine çevrilebilir devre değişiklikleri sergiler ve ardından stabilizasyon kuvvetleri daha fazla yeniden şekillenmeye direndiğinde kapanır². Böcekler özellikle koku alma duyusal bilgisine bağımlıdır ve iyi tanımlanmış bir koku alma kritik periyodu gösterir. Drosophila, çocuk beynindeki bu deneyime bağlı kritik dönemi araştırmak için mükemmel bir genetik model sunar. Eklosyonu takip eden ilk birkaç gün boyunca koku deneyimi, bireysel olarak tanımlanan sinaptik glomerüllerde çarpıcı devre bağlantı değişikliklerine neden olur ^3,4. Yeniden şekillenme yönü, spesifik giriş koku verici deneyimine bağlıdır. Bazı koku vericiler, eklosiyon sonrası (dpe)3,5,6,7 sonrası birkaç gün boyunca sinaptik glomerulus hacminde bir artışa neden olurken, diğer koku vericiler 0-2 dpe kritik dönemde sinapsların hızlı bir şekilde elimine edilmesine neden olarak innervasyon hacminin azalmasına neden olur ^8,9,10. Spesifik olarak, etil bütirat (EB) koku verici deneyimi, Or42a koku alma reseptörü nöronlarının doza bağlı sinaptik budamasını yalnızca bu erken yaşam kritik döneminde⁸ yönlendirir. Sinaps eliminasyonu, kritik periyot içinde EB koku girdisini modüle ederek tamamen geri dönüşümlüdür, ancak kritik periyodun kapanmasını takiben kalıcı hale gelir. Bu koku alma deneyimine bağlı sinaptik budama, genç beyin devresinin yeniden şekillenmesinin altında yatan zamansal olarak kısıtlı mekanizmaları aydınlatmak için değerli bir deneysel sistem sağlar.

Burada, erken yaşam kritik döneminde Or42a reseptörü koku alma duyu nöronlarının EB deneyimine bağlı sinaptik budamasını indüklemek ve analiz etmek için kullanılan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Anten lob VM7 glomerulusundaki Or42a sinaptik terminallerinin, doğrudan Or42a promotörüne (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ kaynaşmış veya Gal4/UAS ikili ifade sistemi (Or42a-Gal4 kullanan UAS-mCD8::GFP)¹² kullanılarak, membrana bağlı bir mCD8::GFP işaretleyicisinin transgenik olarak sürülmesiyle spesifik olarak etiketlenebileceğini gösteriyoruz. Bireysel Or42a nöron sinapsları, bir dizi floresan etikete (örneğin, Bruchpilot::RFP)⁸ kaynaşmış presinaptik aktif bölge belirteçlerinin hedeflenmiş transgenik ekspresyonu veya ultrastrüktürel sinaps analizleri için elektron yoğun bir sinyal (örneğin, miniSOG-mCherry)⁸ kullanılarak benzer şekilde etiketlenebilir. OR42a sinaptik terminalleri, lazer taramalı konfokal mikroskopi ve transmisyon elektron mikroskobunun bir kombinasyonu ile görüntülenebilir. Or42a sinaptik glomerül budamasının EB dozuna bağımlı olduğunu ve zamanlanmış koku verici deneyiminin konsantrasyonuna ölçeklendiğini gösteriyoruz. Bir araç olarak kullanılan mineral yağda çözünen EB koku maddesinin yüzdesi, gelişimsel olarak evrelenmiş hayvanlarda koku maddesine maruz kalmanın zamanlanmış süresi gibi değişebilir. Son olarak, VM7 innervasyon floresan yoğunluğunu ve hacmini ölçerek sinaptik glomerül budamasının kapsamını analiz etmek için kullanılan yöntemleri gösteriyoruz. Sinaps sayısı ayrıca etiketli sinaptik punkta sayılarak ve transmisyon elektron mikroskobu⁸ kullanılarak sinaptik yapı parametreleri ölçülerek de ölçülebilir. Genel olarak, burada gösterilen protokol, genç kritik bir dönemde Drosophila koku alma devresi sinaptik bağlantı budamasına aracılık eden hem hücresel hem de moleküler mekanizmaların sistematik olarak diseksiyonunu sağlayan güçlü bir yaklaşımdır. Bu çalışmada açıklanan genel koku maruziyeti kurulumu, diğer kokular kullanılarak ve diğer glomerüller ^3,7 kullanılarak önceki çalışmalarda kullanılmıştır.

Protokol

1. Koku maruziyeti

1. İnce bir boya fırçası kullanarak, gelişimsel olarak evrelenmiş 40-50 hayvanı, standart mısır unu pekmezi yemi içeren 25 mm x 95 mm polistiren Drosophila şişelerine fazat koyu pupa (25 ° C'de 90+ saat sonra) olarak sıralayın (Şekil 1A).
2. Sinekleri tutmak ve aynı zamanda iyi hava akışı sağlamak için Drosophila şişelerinin ucuna ince paslanmaz çelik tel örgü yerleştirin. Bantlanmış şeffaf film ile tel örgü kapakları Drosophila şişelerinin yan tarafına sabitleyin.
3. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, 1 mL %100 mineral yağ (araç kontrolü) yerleştirin veya istenen konsantrasyonu elde etmek için mineral yağda etil bütirat (EB) kokusunu çözün (örn., %15 (150 μL) veya %25 (250 μL)).
4. Araç kontrol veya koku verici mikrosantrifüj tüplerini hava geçirmez 3700 mL Glasslock kabına dik olarak yerleştirin. Bant kullanarak, tüpleri Drosophila şişeleri ile birlikte koku odalarının ortasına güvenli bir şekilde sabitleyin (Şekil 1B).
5. Aşamalı Drosophila pharate pupa şişelerini içeren kapalı araç kontrol ve EB koku verici odalarını, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde nemlendirilmiş (%70), sıcaklık kontrollü (25 °C) bir inkübatöre yerleştirin.
6. 4 saatlik koku haznesi maruziyetinden sonra yeni kapatılan sinekleri çıkarın ve 20-25 sineği taze yapılmış koku verici içeren odalardaki taze Drosophila şişelerine hızla aktarın (Şekil 1A, B). Kapatılmamış pupaları atın.
7. Sinekleri kapalı koku odalarında, inkübatörlerde toplam 24 saat bekletin. Daha uzun koku verici dozu için, sinekleri her 24 saatte bir yeni yapılmış koku verici odalarındaki yeni Drosophila şişelerine hızla aktarın.
8. Gelişimsel olarak evrelenmiş sinekleri, acil beyin diseksiyonu ve immünositokimya işlemine hazırlık olarak 1 dakika boyunca% 70 etanol içeren bir tabağa batırarak uyuşturun.

2. Beyin diseksiyonu

1. Şişeleri etiketleyerek araç kontrolü (yalnızca %100 mineral yağ) veya EB'ye maruz kalan (% EB) olarak işaretleyin ve bu tanımlamaları tüm beyin diseksiyonu ve sonraki işlem süresi boyunca koruyun. Her genotip/koku verici durumu için 10-20 hayvanı işleyin.
2. Forseps kullanarak, anestezi uygulanmış tek bir sineği yeni yapılmış fosfat tamponlu salin (PBS) içeren küçük bir tabağa ^aktarın13. Sineği PBS'ye daldırın ve sinek tamamen suya batırılmış halde tam beyin diseksiyonuna devam edin.
3. Her iki elinizde ince (# 5) keskinleştirilmiş forseps ile, sinek ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve bir forseps ile üst toraksı ve diğer forseps ile hortumun altındaki başı kavrayın. Beyne nüfuz etmemeye dikkat edin.
4. İki elinizle zıt yönlerde hafifçe çekerek başı vücudun geri kalanından çıkarın. Baş, torakstan kolayca ayrılmalıdır; diseksiyon için izole edilmiş başlığı bırakın (Şekil 1C).
5. Daha önce göğüs kafesi kavramak için kullanılan forsepsleri hortumun karşı tarafının altına kaydırın. Dış iskelet kütikülünü zıt yönlerde nazikçe çekmeye başlayın, böylece beyni ortaya çıkarmak için gözler arasında yırtılır.
6. Çekerken, beyin optik lobları dış iskelet ile birlikte ayrılabilir. Bunu önlemek için, dış iskelet kütikülünü çıkarırken iki forseps ile yavaş, sabit bir çekme kullanın (Şekil 1C, orta).
7. Dış iskelet kütikülünü baştan çıkarmaya devam edin. Dış iskeletin tüm parçalarının çıkarıldığından emin olun. Yağ gövdesi ve çıkıntılı trakea dahil olmak üzere beyne bağlı tüm dokuları çıkarın.
8. Yapışmayı önlemek için P20 pipet ucunu PBS + %0,2 Triton-X 100 (PBST) ile durulayın. Diseksiyondan hemen sonra, beyinleri kapaklı bir tüpte sabitleme solüsyonuna (% 4 paraformaldehit (PFA) +% 4 sükroz) aktarın (Şekil 1C, D).

3. Beyin immünositokimyası

1. Beyni, uçtan uca döndürme ile oda sıcaklığında (RT) 30 dakika sabitleyin. Beyinleri tüpte tutarken, pipetleyin ve tehlikeli sabitleyiciyi uygun şekilde atın. Sabit beyinleri PBS ile 3x hızlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1D).
2. Beyinler genellikle rotasyondan sonra tüplerin kapağına sıkışmış olarak bulunabilir. Tüm transferlerde sürekli bir tehlike olan kazara beyin kaybını önlemek için, sıvıları pipetlerken bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
3. Antikor etiketlemesine hazırlanırken, sabit beyinleri PBST +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 0.5 normal keçi serumu (NGS) ve sabit uçtan uca rotasyon ile RT'de 1 saat bloke edin (Şekil 1D).
4. Bloğu çıkarın ve beyinleri PBST +% 0.2 BSA +% 0.1 NGS'de uygun şekilde seyreltilmiş seçilen primer antikor ile inkübe edin. Beyni gece boyunca (14-16 saat) 4 ° C'de sabit rotasyonla inkübe edin.
   NOT: Kullanılan örnek antikorlar: sinaptik glomerülleri etiketlemek için sıçan anti-CadN (seyreltme 1:50)¹⁴ ve Or42a-mCD8::GFP'yi etiketlemek için tavuk anti-GFP (1:1000)⁸ (Şekil 1D).
5. Birincil antikoru pipetleyin. Beyinleri PBST ile her biri 3 dakika boyunca 20 kez yıkayın. PBST'de %0.2 BSA + %0.1 NGS ile seyreltilmiş ikincil antikorlarla beyinleri, sabit rotasyonla RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Alternatif olarak, beyinleri gece boyunca (14-16 saat) 4 ° C'de kuluçkaya yatırın. PBST'deki antikorları% 0.2 BSA +% 0.1 NGS ile seyreltin; Burada kullanılan ikincil antikorlar: 488 keçi anti-tavuk (1:250) ve 546 keçi anti-sıçan (1:250).
6. İkincil antikorları pipetleyin. Beyinleri PBST ile her biri 3 dakika boyunca 20 kez yıkayın. Beyinleri PBS ile 20 dakika yıkayarak bitirin (Şekil 1D).
7. Slayta birbirinden ~ 25 mm aralıklarla iki ince çift taraflı yapışkan bant şeridi ekleyerek cam mikroskop slaytlarını (25 mm x 25 mm) hazırlayın. Bu, beyinlerin ezilmesini önlemek için bir ara parça sağlar.
8. Beyni monte etmek için iki bant şeridi arasına ~ 10-15 μL montaj ortamı pipetleyin. PBST ile önceden durulanmış bir P20 pipet ucu ile, etiketli beyinleri mikroskop lamına aktarın (Şekil 1E).
9. Beyinler aktarıldıktan sonra, anten loblarının yukarı baktığından emin olarak hizalamak için ince bir boya fırçası kullanın. Anten loblarını içerecek olan kemerli kambura sahip tarafı arayın.
10. Beyinler düzgün bir şekilde yönlendirildikten sonra, lamellerin bant üzerinde sağlam olduğundan emin olmak için onları bir cam lamel (No. 1.5H) ile örtün. Ardından, lamel kenarlarını ek montaj ortamı ile doldurun (Şekil 1E).
11. Lamelin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Slaytın iyice kurumasını bekleyin ve ardından sonraki görüntüleme için buzdolabında saklayın.

4. Konfokal görüntüleme

1. Daha sonra kod çözme için slaydı kodlanmış bir etiketle işaretleyerek görüntülemeden önce tüm beyin slaytlarını hem genotip hem de deneyim koşullarına kör edin.
2. 63x yağa daldırma objektifine sahip lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Burada gösterilen tüm resimlerde bir Zeiss 510 META mikroskobu kullanıyoruz (Şekil 1F).
3. Kullanılan floroforlar için uygun lazer çizgileri kullanın. Burada, anten lobu sinaptik glomerül ve Or42a koku alma duyusal nöron görüntülemesi için bir Argon 488 ve HeNe 543 lazer kullanın (Şekil 2).
4. Her iki kanal için en uygun kazancı ve ofseti belirleyin, ideal olarak her iki kanal için kazancı <750 ve ofset ≈0 tutun. Bu, arka planı sınırlarken sinyal-gürültünün optimum olmasını sağlamak için yapılır.
5. Görüntülemeyi beynin merkezine yerleştirin. Görüntüleme yapılırken VM7 glomerülleri, diseksiyon sırasında özofagusun çıkarılmasını takiben beynin ortasında kalan deliğe proksimalde yerleşir (Şekil 2A).
   NOT: VM7 glomerülleri her zaman yemek borusunun açıklığına yakın olacaktır. Bununla birlikte, tam konum ve boyut, beyin diseksiyonu ve montaj farklılıklarına bağlı olarak biraz değişir, bu nedenle görüntüleme yaparken bunu göz önünde bulundurun.
6. Görüntüleme çözünürlüğünü ve optik dilim kalınlığını seçin. Burada, 0,37 μm'lik bir Z-yığını dilim kalınlığına sahip 1024 x 1024 çözünürlük kullanılır.
7. VM7 glomerüllerinin tam Or42a nöron innervasyonunun yakalanmasını sağlamak için anten lobu boyunca tüm bir konfokal Z-yığını projeksiyonunu alın.

5. Sinaptik ölçümler

1. Genotip/durum körü görüntüyü Fiji'ye (1.54f) yükleyin. Image > Color (Renk) > Split Channel (Kanalları Böl) seçeneğini tıklatarak lazer çizgi kanallarını bölün.
2. Or42a koku alma duyu kanalında, floresansın nerede başladığını ve bittiğini belirleyerek, Z yığınının tamamı boyunca kaydırarak hangi dilimlerin Or42a innervasyonunu içerdiğini belirleyin.
3. Görüntü > Yığınları > Z Projesi > Dilimleri Topla'ya tıklayarak ve istenen aralığı girerek yalnızca Or42a nöron innervasyonu içeren dilimleri içeren bir toplam dilim projeksiyonu oluşturun.
4. Fiji'de, VM7 glomerulusundaki Or42a nöron innervasyonunun ana hatlarını izlemek için üst çubuktaki Kement aracına tıklayın ve her bir beyin tarafı glomerulusunu bağımsız olarak tedavi edin (Şekil 3).
5. VM7 sinaptik glomerulus innervasyon hacmini elde etmek için çevreyi Z-yığın dilimlerinin sayısı ve her dilimin kalınlığı ile çarpın. Sinaps sayısını ölçmek için, maksimum bul aracı, belirtilen ^8,15 bölgesindeki sinaps punktasını saymak için maksimum yığınları bul makrosu ile birlikte kullanılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1 , koku alma deneyimine bağlı kritik dönem, koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme yöntemleri için iş akışını göstermektedir. Protokol, eklosiyondan hemen önce fazat koyu pupaların yaş eşleştirmesi ile başlar (Şekil 1A). Pupalar 4 saat boyunca koku verici odalara yerleştirilir ve daha sonra yeni kapatılmış yetişkinler ya araç kontrolünde ya da dozlanmış EB koku verici odalarında taze ?...

Tartışmalar

Burada sunulan koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme protokolü, erken yaşamda kritik bir dönemde deneyime bağlı koku alma duyusal nöron sinaptik glomerül budamasını güvenilir bir şekilde indüklemek ve ölçmek için kullanılabilir. Koku alma devresinin yeniden şekillenmesini araştırmak için bu tedavi paradigmasını kullanan daha önceki çalışmalar, eklosiyondan 2^{. gün} sonra koku maruziyetine^başladı

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f