Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Resumo

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Resumo

A experiência sensorial olfativa no início da vida induz uma remodelação dramática dos glomérulos sinápticos no cérebro juvenil de Drosophila , que é experimentalmente dependente da dose, temporalmente restrita e transitoriamente reversível apenas em um período crítico curto e bem definido. A direcionalidade da remodelação da conectividade sináptica do circuito cerebral é determinada pelo odorante específico que atua na classe de receptores respondentes dos neurônios sensoriais olfativos. Em geral, cada classe de neurônios expressa apenas um único receptor odorífero e inerva um único glomérulo sináptico olfatório. No modelo genético de Drosophila , toda a gama de glomérulos olfativos foi mapeada com precisão pela capacidade de resposta ao odor e produção comportamental. O odorante de butirato de etila (EB) ativa os neurônios receptores de Or42a que inervam o glomérulo VM7. Durante o período crítico do início da vida, a experiência da EB impulsiona a eliminação da sinapse dependente da dose nos neurônios sensoriais olfativos Or42a. Períodos cronometrados de exposição ao odor EB dosado permitem a investigação da poda de conectividade do circuito dependente da experiência no cérebro juvenil. A imagem de microscopia confocal dos glomérulos sinápticos do lobo antenal é feita com marcadores transgênicos acionados pelo receptor Or42a que fornecem quantificação do número de sinapses e do volume de inervação. O sofisticado kit de ferramentas genéticas de Drosophila permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a remodelação do circuito cerebral.

Introdução

A remodelação dos circuitos cerebrais juvenis durante o início da vida representa a última chance de mudanças de conectividade sináptica em larga escala para corresponder ao ambiente altamente variável e imprevisível em que um animal nasce. Como o grupo mais abundante de animais, os insetos compartilham esse mecanismo de remodelação do período crítico fundamental e evolutivamente conservado¹. Os períodos críticos abrem com o início da entrada sensorial, exibem mudanças reversíveis no circuito para otimizar a conectividade e, em seguida, fecham quando as forças de estabilização resistem a uma remodelação adicional². Os insetos são particularmente dependentes de informações sensoriais olfativas e mostram um período crítico olfativo bem definido. Drosophila fornece um excelente modelo genético para investigar esse período crítico dependente da experiência no cérebro juvenil. A experiência com odor durante os primeiros dias após a eclosão impulsiona mudanças marcantes na conectividade do circuito em glomérulos sinápticos identificados individualmente ^3,4. A direção da remodelação depende da experiência específica do odorante de entrada. Alguns odores causam um aumento no volume do glomérulo sináptico por alguns dias após a eclosão (dpe) ^{3 , 5 , 6 , 7} , enquanto outros odores causam uma rápida eliminação das sinapses durante o período crítico de 0-2 dpe, resultando em diminuição do volume de inervação^{8 , 9 , 10}. Especificamente, a experiência com odor de butirato de etila (EB) impulsiona a poda sináptica dependente da dose dos neurônios do receptor olfativo Or42a apenas durante esse período crítico de início de vida⁸. A eliminação da sinapse é completamente reversível pela modulação da entrada de odor EB dentro do período crítico, mas torna-se permanente após o encerramento do período crítico. Essa poda sináptica dependente da experiência olfativa fornece um sistema experimental valioso para elucidar os mecanismos temporalmente restritos subjacentes à remodelação do circuito cerebral juvenil.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usado para induzir e analisar a poda sináptica dependente da experiência EB de neurônios sensoriais olfativos do receptor Or42a durante o período crítico do início da vida. Mostramos que os terminais sinápticos Or42a no glomérulo VM7 do lobo antenal podem ser especificamente marcados por transgenicamente conduzindo um marcador mCD8::GFP amarrado à membrana, diretamente fundido ao promotor Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ ou usando o sistema de expressão binária Gal4/UAS (Or42a-Gal4 conduzindo UAS-mCD8::GFP)¹². As sinapses individuais do neurônio Or42a podem ser marcadas de forma semelhante usando a expressão transgênica direcionada de marcadores de zona ativa pré-sináptica fundidos a uma série de tags fluorescentes (por exemplo, Bruchpilot :: RFP) ⁸ ou um sinal denso em elétrons para análises de sinapses ultraestruturais (por exemplo, miniSOG-mCherry) ⁸. Os terminais sinápticos Or42a podem ser visualizados com uma combinação de microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que a poda dos glomérulos sinápticos de Or42a é dependente da dose de EB, escalando para a concentração da experiência de odor cronometrada. A porcentagem de odor EB dissolvido no óleo mineral usado como veículo pode ser variada, assim como a duração cronometrada da exposição ao odor em animais em estágio de desenvolvimento. Finalmente, mostramos os métodos usados para analisar a extensão da poda dos glomérulos sinápticos medindo a intensidade e o volume da fluorescência da inervação VM7. O número de sinapses também pode ser quantificado contando os pontos sinápticos marcados e medindo os parâmetros da ultraestrutura sináptica usando microscopia eletrônica de transmissão⁸. No geral, o protocolo mostrado aqui é uma abordagem poderosa que permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a poda da conectividade sináptica do circuito olfativo da Drosophila durante um período crítico juvenil. A configuração geral de exposição ao odor descrita neste estudo foi utilizada em estudos anteriores usando outros odores e testando outros glomérulos ^3,7.

Protocolo

1. Exposição ao odor

1. Usando um pincel fino, classifique 40-50 animais em estágio de desenvolvimento como pupas escuras faratos (90+ h pós-pupariação a 25 ° C) em frascos de Drosophila de poliestireno de 25 mm x 95 mm contendo alimento padrão de melaço de fubá (Figura 1A).
2. Coloque uma tela de arame de aço inoxidável fina sobre a extremidade dos frascos de Drosophila para conter as moscas e, ao mesmo tempo, permitir um bom fluxo de ar. Prenda as tampas de malha de arame com filme transparente colado na lateral dos frascos para Drosophila .
3. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, coloque 1 mL de óleo mineral 100% (controle do veículo) ou dissolva o odorante de butirato de etila (EB) em óleo mineral em outro tubo para produzir a concentração desejada (por exemplo, 15% (150 μL) ou 25% (250 μL)).
4. Coloque os tubos de controle do veículo ou microcentrífuga odorífera na vertical dentro de um recipiente Glasslock hermético de 3700 mL. Usando fita adesiva, ancore os tubos com segurança no centro das câmaras odoríferas junto com os frascos de Drosophila (Figura 1B).
5. Coloque as câmaras seladas de controle do veículo e odor EB contendo os frascos de pupas de farato de Drosophila encenados em uma incubadora umidificada (70%) com temperatura controlada (25 ° C) em um ciclo claro/escuro de 12 h / 12 h.
6. Remova as moscas recém-fechadas após 4 h de exposição à câmara de odor e transfira rapidamente 20-25 moscas para frascos de Drosophila frescos em câmaras com odor recém-feito ( Figura 1A , B ). Descarte as pupas não fechadas.
7. Mantenha as moscas em suas câmaras de odor seladas nas incubadoras por um total de 24 h. Para uma dosagem mais longa de odor, transfira rapidamente as moscas para novos frascos de Drosophila em câmaras de odor recém-feitas a cada 24 h.
8. Anestesie as moscas em estágio de desenvolvimento, submergindo-as em um prato de etanol a 70% por 1 minuto em preparação para dissecção cerebral imediata e processamento imunocitoquímico.

2. Dissecção cerebral

1. Marque os frascos como controle do veículo (somente óleo mineral 100%) ou exposto ao EB (% EB) rotulando e mantenha essas designações durante toda a duração da dissecção cerebral e processamento subsequente. Processe 10-20 animais para cada genótipo/condição odorante.
2. Usando uma pinça, transfira uma única mosca anestesiada para um pequeno prato de solução salina tamponada com fosfato (PBS) recém-feita13. Mergulhe a mosca em PBS e continue a dissecção cerebral completa com a mosca totalmente submersa.
3. Com uma pinça fina (# 5) afiada em ambas as mãos, coloque a mosca com o lado ventral para cima e segure a parte superior do tórax com uma pinça e a cabeça sob a tromba com a outra pinça. Tome cuidado para não penetrar no cérebro.
4. Remova a cabeça do resto do corpo puxando suavemente em direções opostas com as duas mãos. A cabeça deve se desprender facilmente do tórax; deixar a cabeça isolada para dissecção (Figura 1C).
5. Deslize a pinça usada anteriormente para segurar o tórax sob o lado oposto da tromba. Comece a puxar suavemente a cutícula do exoesqueleto em direções opostas para que ela rasgue entre os olhos para revelar o cérebro.
6. Ao puxar, os lobos ópticos do cérebro podem se separar junto com o exoesqueleto. Para evitar isso, use um puxão lento e constante com as duas pinças enquanto remove a cutícula do exoesqueleto (Figura 1C, meio).
7. Continue a remover a cutícula do exoesqueleto da cabeça. Certifique-se de que todas as partes do exoesqueleto sejam removidas. Remova todos os tecidos ligados ao cérebro, incluindo o corpo adiposo e qualquer traqueia saliente.
8. Para evitar que grude, enxágue uma ponta de pipeta P20 com PBS + 0.2% Triton-X 100 (PBST). Imediatamente após a dissecção, transfira o cérebro para a solução de fixação (4% de paraformaldeído (PFA) + 4% de sacarose) em um tubo tampado (Figura 1C,D).

3. Imunocitoquímica cerebral

1. Fixe o cérebro por 30 min em temperatura ambiente (RT) com rotação de ponta a ponta. Enquanto mantém os cérebros no tubo, pipete e descarte adequadamente o fixador perigoso. Lave rapidamente os cérebros fixos 3x com PBS (Figura 1D).
2. Os cérebros podem ser encontrados presos na tampa dos tubos após a rotação. Para evitar a perda acidental de cérebros, que é um perigo constante em todas as transferências, use um microscópio de dissecção ao pipetar líquidos.
3. Em preparação para a marcação de anticorpos, bloqueie os cérebros fixos por 1 h em RT em PBST + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,5% de soro de cabra normal (NGS) com rotação constante de ponta a ponta (Figura 1D).
4. Remova o bloqueio e incube os cérebros com o anticorpo primário selecionado diluído adequadamente em PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubar os cérebros durante a noite (14-16 h) a 4 °C com rotação constante.
   NOTA: Exemplos de anticorpos usados: anti-CadN de rato (diluição 1:50)¹⁴ para rotular glomérulos sinápticos e anti-GFP de galinha (1:1000)⁸ para rotular Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipetar o anticorpo primário. Lave os cérebros 3x por 20 minutos cada com PBST. Incubar cérebros com anticorpos secundários diluídos em PBST com 0,2% de BSA + 0,1% de NGS por 2 h em RT com rotação constante.
   NOTA: Alternativamente, incube os cérebros durante a noite (14-16 h) a 4 ° C. Diluir anticorpos em PBST com 0,2% de BSA + 0,1% de NGS; Anticorpos secundários usados aqui: 488 cabra anti-frango (1:250) e 546 cabra anti-rato (1:250).
6. Pipetar os anticorpos secundários. Lave os cérebros 3x por 20 minutos cada com PBST. Termine lavando os cérebros por 20 min com PBS (Figura 1D).
7. Prepare lâminas de microscópio de vidro (75 mm x 25 mm) adicionando duas tiras finas de fita adesiva dupla face à lâmina com ~ 25 mm de distância uma da outra. Isso fornece um espaçador para evitar esmagar os cérebros.
8. Pipeta ~ 10-15 μL de meio de montagem entre as duas tiras de fita para montar os cérebros. Com uma ponta de pipeta P20 pré-enxaguada com PBST, transfira os cérebros marcados para a lâmina do microscópio (Figura 1E).
9. Depois que os cérebros forem transferidos, use um pincel fino para alinhá-los, garantindo que os lobos antenais estejam voltados para cima. Procure o lado que tem a corcunda arqueada, que conterá os lobos antenais.
10. Assim que os cérebros estiverem devidamente orientados, cubra-os com uma lamínula de vidro (nº 1.5H), garantindo que a lamínula esteja presa na fita. Em seguida, preencha as laterais da lamínula com meio de montagem adicional (Figura 1E).
11. Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente. Deixe a lâmina secar completamente e guarde-a na geladeira para imagens subsequentes.

4. Imagem confocal

1. Cegue todas as lâminas cerebrais para as condições de genótipo e experiência antes da imagem, marcando a lâmina com um rótulo codificado para decodificação posterior.
2. Use um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo de 63x. Usamos um microscópio Zeiss 510 META em todas as imagens mostradas aqui (Figura 1F).
3. Use linhas de laser apropriadas para os fluoróforos empregados. Aqui, use um laser de argônio 488 e HeNe 543 para os glomérulos sinápticos do lobo antenal e imagens de neurônios sensoriais olfativos Or42a (Figura 2).
4. Determine o ganho e o deslocamento ideais para ambos os canais, idealmente mantendo o ganho para ambos os canais <750 e deslocamento ≈0. Isso é feito para garantir que a relação sinal-ruído seja ideal, limitando o plano de fundo.
5. Posicione a imagem no centro do cérebro. Ao obter imagens, os glomérulos VM7 residem proximalmente ao orifício deixado no meio do cérebro após a remoção do esôfago durante a dissecção (Figura 2A).
   NOTA: Os glomérulos VM7 estarão sempre próximos à abertura do esôfago. No entanto, a localização e o tamanho exatos variam ligeiramente com base na dissecção cerebral e nas diferenças de montagem, portanto, leve isso em consideração ao obter imagens.
6. Selecione a resolução da imagem e a espessura da fatia óptica. Aqui, a resolução de 1024 x 1024 com uma espessura de fatia de pilha Z de 0,37 μm é usada.
7. Faça uma projeção confocal inteira da pilha Z através do lobo antenal, garantindo a captura da inervação completa do neurônio Or42a dos glomérulos VM7.

5. Medições sinápticas

1. Carregue a imagem cega por genótipo/condição em Fiji (1.54f). Divida os canais da linha de laser clicando em Imagem > Cor > Dividir canais.
2. No canal sensorial olfativo Or42a, determine quais fatias contêm a inervação Or42a percorrendo toda a pilha Z, identificando onde a fluorescência começa e termina.
3. Crie uma projeção de fatias de soma incluindo apenas fatias contendo inervação de neurônios Or42a clicando em Pilhas de > de imagem > Projeto Z > Fatias de soma e inserindo o intervalo desejado.
4. Em Fiji, clique na ferramenta Lasso na barra superior para traçar o contorno da inervação do neurônio Or42a no glomérulo VM7, tratando cada glomérulo do lado do cérebro independentemente (Figura 3).
5. Multiplique a circunferência pelo número de fatias da pilha Z e a espessura de cada fatia para obter o volume de inervação do glomérulo sináptico VM7. Para quantificar o número de sinapses, a ferramenta find maxima pode ser usada junto com a macro find maxima stacks para contar os pontos de sinapse na região delineada ^8,15.

Resultados

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a exposição ao odor do período crítico dependente da experiência olfativa e os métodos de imagem cerebral. O protocolo começa com a correspondência etária das pupas escuras do farato imediatamente antes da eclosão (Figura 1A). As pupas são colocadas em câmaras odoríferas por 4 h e, em seguida, os adultos recém-fechados são colocados em frascos novos no controle do veícul...

Discussão

O protocolo de exposição a odores e imagens cerebrais apresentado aqui pode ser usado para induzir e quantificar de forma confiável a poda de glomérulos sinápticos de neurônios sensoriais olfativos dependentes da experiência durante um período crítico no início da vida. Estudos anteriores utilizando esse paradigma de tratamento para explorar a remodelação do circuito olfatório iniciaram a exposição ao odorante no^2º dia após a eclosão

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f