Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

Resumo

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Resumo

A experiência sensorial olfativa no início da vida induz uma remodelação dramática dos glomérulos sinápticos no cérebro juvenil de Drosophila , que é experimentalmente dependente da dose, temporalmente restrita e transitoriamente reversível apenas em um período crítico curto e bem definido. A direcionalidade da remodelação da conectividade sináptica do circuito cerebral é determinada pelo odorante específico que atua na classe de receptores respondentes dos neurônios sensoriais olfativos. Em geral, cada classe de neurônios expressa apenas um único receptor odorífero e inerva um único glomérulo sináptico olfatório. No modelo genético de Drosophila , toda a gama de glomérulos olfativos foi mapeada com precisão pela capacidade de resposta ao odor e produção comportamental. O odorante de butirato de etila (EB) ativa os neurônios receptores de Or42a que inervam o glomérulo VM7. Durante o período crítico do início da vida, a experiência da EB impulsiona a eliminação da sinapse dependente da dose nos neurônios sensoriais olfativos Or42a. Períodos cronometrados de exposição ao odor EB dosado permitem a investigação da poda de conectividade do circuito dependente da experiência no cérebro juvenil. A imagem de microscopia confocal dos glomérulos sinápticos do lobo antenal é feita com marcadores transgênicos acionados pelo receptor Or42a que fornecem quantificação do número de sinapses e do volume de inervação. O sofisticado kit de ferramentas genéticas de Drosophila permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a remodelação do circuito cerebral.

Introdução

A remodelação dos circuitos cerebrais juvenis durante o início da vida representa a última chance de mudanças de conectividade sináptica em larga escala para corresponder ao ambiente altamente variável e imprevisível em que um animal nasce. Como o grupo mais abundante de animais, os insetos compartilham esse mecanismo de remodelação do período crítico fundamental e evolutivamente conservado¹. Os períodos críticos abrem com o início da entrada sensorial, exibem mudanças reversíveis no circuito para otimizar a conectividade e, em seguida, fecham quando as forças de estabilização resistem a uma remodelação adicion....

Protocolo

1. Exposição ao odor

1. Usando um pincel fino, classifique 40-50 animais em estágio de desenvolvimento como pupas escuras faratos (90+ h pós-pupariação a 25 ° C) em frascos de Drosophila de poliestireno de 25 mm x 95 mm contendo alimento padrão de melaço de fubá (Figura 1A).
2. Coloque uma tela de arame de aço inoxidável fina sobre a extremidade dos frascos de Drosophila para conter as moscas e, ao mesmo tempo, permitir um bom fluxo de ar. Prenda as tampas de malha de arame com filme transparente colado na lateral dos frascos para Drosophila .
....

Discussão

O protocolo de exposição a odores e imagens cerebrais apresentado aqui pode ser usado para induzir e quantificar de forma confiável a poda de glomérulos sinápticos de neurônios sensoriais olfativos dependentes da experiência durante um período crítico no início da vida. Estudos anteriores utilizando esse paradigma de tratamento para explorar a remodelação do circuito olfatório iniciaram a exposição ao odorante no^2º dia após a eclosão

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f