Rimodellamento dipendente dall'esperienza del cervello giovanile, neurone sensoriale olfattivo, connettività sinaptica in un periodo critico della prima infanzia

Riepilogo

Descriviamo qui i metodi per indurre e analizzare il rimodellamento olfattivo dipendente dall'esperienza dei glomeruli sinaptici del lobo antennale nel cervello giovanile di Drosophila .

Abstract

L'esperienza sensoriale olfattiva precoce induce un drammatico rimodellamento dei glomeruli sinaptici nel cervello giovanile di Drosophila , che è esperienzialmente dose-dipendente, temporalmente limitato e transitoriamente reversibile solo in un breve periodo critico ben definito. La direzionalità del rimodellamento della connettività sinaptica del circuito cerebrale è determinata dall'odorante specifico che agisce sulla classe di recettori rispondenti dei neuroni sensoriali olfattivi. In generale, ogni classe di neuroni esprime un solo recettore olfattivo e innerva un singolo glomerulo sinaptico olfattivo. Nel modello genetico di Drosophila , l'intera gamma di glomeruli olfattivi è stata mappata con precisione dalla risposta agli odori e dall'output comportamentale. L'odorizzante etilbutirrato (EB) attiva i neuroni del recettore Or42a che innervano il glomerulo VM7. Durante il primo periodo critico della vita, l'esperienza dell'EB guida l'eliminazione delle sinapsi dose-dipendenti nei neuroni sensoriali olfattivi Or42a. Periodi temporizzati di esposizione all'odorizzante EB dosato consentono di studiare la potatura della connettività circuitale dipendente dall'esperienza nel cervello giovanile. L'imaging al microscopio confocale dei glomeruli sinaptici del lobo antennale viene eseguito con marcatori transgenici guidati dal recettore Or42a che forniscono la quantificazione del numero di sinapsi e del volume di innervazione. Il sofisticato kit di strumenti genetici per la Drosophila consente la dissezione sistematica dei meccanismi cellulari e molecolari che mediano il rimodellamento dei circuiti cerebrali.

Introduzione

Il rimodellamento dei circuiti cerebrali giovanili durante i primi anni di vita rappresenta l'ultima possibilità per cambiamenti di connettività sinaptica su larga scala per adattarsi all'ambiente altamente variabile e imprevedibile in cui un animale nasce. Essendo il gruppo di animali più abbondante, gli insetti condividono questo meccanismo di rimodellamento del periodo critico fondamentale^{e conservato dal} punto di vista evolutivo 1. I periodi critici si aprono con l'inizio dell'input sensoriale, mostrano cambiamenti reversibili del circuito per ottimizzare la connettività e poi si chiudono quando le forze di stabilizzazione resistono a ulteriori rimodellamenti². Gli insetti dipendono particolarmente dalle informazioni sensoriali olfattive e mostrano un periodo critico olfattivo ben definito. La Drosophila fornisce un eccellente modello genetico per studiare questo periodo critico dipendente dall'esperienza nel cervello giovanile. L'esperienza degli odori durante i primi giorni dopo l'eclosion guida sorprendenti cambiamenti di connettività circuitale nei glomeruli sinaptici ^3,4 identificati individualmente. La direzione del rimodellamento dipende dall'esperienza specifica dell'odorizzante in ingresso. Alcuni odoranti causano un aumento del volume del glomerulo sinaptico per un paio di giorni dopo l'eclosione (dpe)3,5,6,7, mentre altri odoranti causano una rapida eliminazione delle sinapsi durante il periodo critico 0-2 dpe, con conseguente diminuzione del volume di innervazione ^8,9,10. In particolare, l'esperienza con gli odori del butirrato di etile (EB) guida la potatura sinaptica dose-dipendente dei neuroni del recettore olfattivo Or42a solo durante questo periodo critico della prima infanzia⁸. L'eliminazione delle sinapsi è completamente reversibile modulando l'apporto di odorizzante EB entro il periodo critico ma diventa permanente dopo la chiusura del periodo critico. Questa potatura sinaptica dipendente dall'esperienza olfattiva fornisce un prezioso sistema sperimentale per chiarire i meccanismi temporalmente limitati alla base del rimodellamento del circuito cerebrale giovanile.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato utilizzato per indurre e analizzare la potatura sinaptica EB dipendente dall'esperienza dei neuroni sensoriali olfattivi del recettore Or42a durante il periodo critico precoce della vita. Mostriamo che i terminali sinaptici di Or42a nel glomerulo VM7 del lobo antennale possono essere marcati in modo specifico guidando transgenicamente un marcatore mCD8::GFP legato alla membrana, fuso direttamente con il promotore di Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ o utilizzando il sistema di espressione binaria Gal4/UAS (Or42a-Gal4 che guida UAS-mCD8::GFP)¹². Le singole sinapsi dei neuroni Or42a possono essere marcate in modo simile utilizzando l'espressione transgenica mirata di marcatori presinaptici della zona attiva fusi a una serie di tag fluorescenti (ad esempio, Bruchpilot::RFP)⁸ o un segnale ad alta densità di elettroni per analisi di sinapsi ultrastrutturali (ad esempio, miniSOG-mCherry)⁸. I terminali sinaptici Or42a possono essere visualizzati con una combinazione di microscopia confocale a scansione laser e microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che la potatura dei glomeruli sinaptici Or42a è dose-dipendente dall'EB, scalando alla concentrazione dell'esperienza odorizzante temporizzata. La percentuale di odorizzante EB disciolto nell'olio minerale utilizzato come veicolo può essere variata, così come la durata temporizzata dell'esposizione all'odorizzante negli animali in fase di sviluppo. Infine, mostriamo i metodi utilizzati per analizzare l'entità della potatura dei glomeruli sinaptici misurando l'intensità e il volume della fluorescenza dell'innervazione VM7. Il numero di sinapsi può anche essere quantificato contando i punti sinaptici marcati e misurando i parametri dell'ultrastruttura sinaptica utilizzando la microscopia elettronica^{a trasmissione 8}. Nel complesso, il protocollo mostrato qui è un approccio potente che consente la dissezione sistematica dei meccanismi cellulari e molecolari che mediano la potatura della connettività sinaptica del circuito olfattivo di Drosophila durante un periodo critico giovanile. La configurazione generale dell'esposizione agli odori descritta in questo studio è stata utilizzata in studi precedenti utilizzando altri odori e analizzando altri glomeruli ^3,7.

Protocollo

1. Esposizione agli odori

1. Usando un pennello fine, selezionare 40-50 animali in fase di sviluppo come pupe scure di farato (90+ ore dopo la nascita a 25 °C) in fiale di polistirene Drosophila da 25 mm x 95 mm contenenti cibo standard per melassa di farina di mais (Figura 1A).
2. Posizionare una sottile rete metallica in acciaio inossidabile sull'estremità delle fiale di Drosophila per contenere le mosche e consentire anche un buon flusso d'aria. Fissare i tappi di rete metallica con una pellicola trasparente nastrata sul lato dei flaconcini di Drosophila .
3. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, inserire 1 mL di olio minerale al 100% (controllo del veicolo) o sciogliere l'odorizzante etilbutirrato (EB) nell'olio minerale in un'altra provetta per produrre la concentrazione desiderata (ad es. 15% (150 μL) o 25% (250 μL)).
4. Posizionare le provette per microcentrifuga per il controllo del veicolo o per l'odorizzante in posizione verticale all'interno di un contenitore ermetico Glasslock da 3700 mL. Utilizzando del nastro adesivo, ancorare saldamente i tubi al centro delle camere degli odori insieme alle fiale di Drosophila (Figura 1B).
5. Collocare le camere sigillate di controllo del veicolo e le camere di odorante EB contenenti le fiale di pupe di Drosophila pharate in un incubatore umidificato (70%) a temperatura controllata (25 °C) con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore.
6. Rimuovere le mosche appena chiuse dopo 4 ore di esposizione in camera di odorante e trasferire rapidamente 20-25 mosche in fiale di Drosophila fresche in camere con odorizzante appena fatto (Figura 1A, B). Scartare le pupe non chiuse.
7. Conservare le mosche nelle loro camere odorose sigillate nelle incubatrici per un totale di 24 ore. Per un dosaggio più lungo dell'odorizzante, trasferire rapidamente le mosche in nuove fiale di Drosophila in camere odorizzanti appena fatte ogni 24 ore.
8. Anestetizzare i moscerini in fase di sviluppo immergendoli in una capsula di etanolo al 70% per 1 minuto in preparazione per la dissezione cerebrale immediata e l'elaborazione immunocitochimica.

2. Dissezione cerebrale

1. Contrassegnare le fiale come veicolo di controllo (solo olio minerale al 100%) o EB esposte (% EB) etichettandole e mantenere queste designazioni per l'intera durata della dissezione cerebrale e della successiva elaborazione. Processa 10-20 animali per ogni genotipo/condizione odorizzante.
2. Usando una pinza, trasferisci una singola mosca anestetizzata in una piccola piastra di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) appena ^preparata13. Immergere la mosca nel PBS e continuare la dissezione completa del cervello con la mosca completamente sommersa.
3. Con una pinza affilata (#5) fine in entrambe le mani, posizionare la mosca con il lato ventrale rivolto verso l'alto e afferrare la parte superiore del torace con una pinza e la testa sotto la proboscide con l'altra pinza. Fare attenzione a non penetrare nel cervello.
4. Rimuovere la testa dal resto del corpo tirando delicatamente in direzioni opposte con entrambe le mani. La testa dovrebbe staccarsi facilmente dal torace; lasciare la testa isolata per la dissezione (Figura 1C).
5. Far scorrere la pinza precedentemente utilizzata per afferrare il torace sotto il lato opposto della proboscide. Inizia a tirare delicatamente la cuticola dell'esoscheletro in direzioni opposte in modo che si strappi tra gli occhi per rivelare il cervello.
6. Durante la trazione, i lobi ottici del cervello possono separarsi insieme all'esoscheletro. Per evitare ciò, utilizzare una trazione lenta e costante con le due pinze mentre si rimuove la cuticola dell'esoscheletro (Figura 1C, al centro).
7. Continua a rimuovere la cuticola dell'esoscheletro dalla testa. Assicurarsi che tutte le parti dell'esoscheletro siano state rimosse. Rimuovere tutti i tessuti attaccati al cervello, compreso il corpo grasso e qualsiasi trachea sporgente.
8. Per evitare che si attacchi, sciacquare il puntale di una pipetta P20 con PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Immediatamente dopo la dissezione, trasferire il cervello nella soluzione di fissaggio (4% paraformaldeide (PFA) + 4% saccarosio) in una provetta tappata (Figura 1C, D).

3. Immunocitochimica cerebrale

1. Fissare il cervello per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) con rotazione end-over-end. Tenendo il cervello nella provetta, pipettare e smaltire correttamente il fissativo pericoloso. Lavare rapidamente i cervelli fissi 3 volte con PBS (Figura 1D).
2. I cervelli possono spesso essere trovati bloccati nel tappo dei tubi dopo la rotazione. Per evitare la perdita accidentale del cervello, che è un pericolo costante in tutti i trasferimenti, utilizzare un microscopio da dissezione durante il pipettaggio dei liquidi.
3. In preparazione per la marcatura degli anticorpi, bloccare i cervelli fissi per 1 ora a RT in PBST + 1% albumina sierica bovina (BSA) + 0,5% siero di capra normale (NGS) con rotazione costante end-over-end (Figura 1D).
4. Rimuovere il blocco e incubare il cervello con l'anticorpo primario selezionato diluito in modo appropriato in PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubare il cervello per una notte (14-16 ore) a 4 °C con rotazione costante.
   NOTA: Esempi di anticorpi utilizzati: anti-CadN di ratto (diluizione 1:50)¹⁴ per marcare i glomeruli sinaptici e anti-GFP di pollo (1:1000)⁸ per marcare Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipettare l'anticorpo primario. Lavare il cervello 3 volte per 20 minuti ciascuno con PBST. Incubare cervelli con anticorpi secondari diluiti in PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS per 2 ore a RT con rotazione costante.
   NOTA: In alternativa, incubare il cervello per una notte (14-16 ore) a 4 °C. Diluire gli anticorpi in PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS; Anticorpi secondari utilizzati qui: 488 capra anti-pollo (1:250) e 546 capra anti-ratto (1:250).
6. Pipettare gli anticorpi secondari. Lavare il cervello 3 volte per 20 minuti ciascuno con PBST. Terminare lavando il cervello per 20 minuti con PBS (Figura 1D).
7. Preparare i vetrini da microscopio in vetro (75 mm x 25 mm) aggiungendo due sottili strisce di nastro biadesivo al vetrino a ~25 mm di distanza l'una dall'altra. Questo fornisce un distanziatore per evitare di schiacciare il cervello.
8. Pipettare ~10-15 μL di terreno di montaggio tra le due strisce di nastro per montare i cervelli. Con un puntale per pipetta P20 pre-risciacquato con PBST, trasferire i cervelli marcati sul vetrino del microscopio (Figura 1E).
9. Una volta che i cervelli sono stati trasferiti, usa un pennello fine per allinearli, assicurandoti che i lobi antennali siano rivolti verso l'alto. Cerca il lato che ha la gobba arcuata, che conterrà i lobi antennali.
10. Una volta che i cervelli sono orientati correttamente, coprirli con un vetrino coprioggetti di vetro (n. 1.5H), assicurandosi che il vetrino coprioggetti sia ben saldo sul nastro. Quindi, riempire i lati del vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio aggiuntivo (Figura 1E).
11. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Lasciare asciugare completamente il vetrino, quindi conservarlo in frigorifero per l'imaging successivo.

4. Imaging confocale

1. Accecare tutti i vetrini cerebrali sia al genotipo che alle condizioni di esperienza prima dell'imaging contrassegnando il vetrino con un'etichetta codificata per la successiva decodifica.
2. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo a immersione in olio 63x. In tutte le immagini mostrate qui utilizziamo un microscopio Zeiss 510 META (Figura 1F).
3. Utilizzare linee laser appropriate per i fluorofori utilizzati. In questo caso, utilizzare un laser Argon 488 e HeNe 543 per i glomeruli sinaptici del lobo antennale e l'imaging dei neuroni sensoriali olfattivi Or42a (Figura 2).
4. Determina il guadagno e l'offset ottimali per entrambi i canali, mantenendo idealmente il guadagno per entrambi i canali <750 e l'offset ≈0. Questo viene fatto per garantire che il rapporto segnale-rumore sia ottimale, limitando al contempo lo sfondo.
5. Posizionare l'imaging al centro del cervello. Durante l'imaging, i glomeruli VM7 risiedono prossimalmente al foro lasciato al centro del cervello dopo la rimozione dell'esofago durante la dissezione (Figura 2A).
   NOTA: I glomeruli VM7 saranno sempre vicini all'apertura dell'esofago. Tuttavia, la posizione e le dimensioni esatte variano leggermente in base alla dissezione cerebrale e alle differenze di montaggio, quindi tenetene conto durante l'imaging.
6. Selezionare la risoluzione dell'immagine e lo spessore della fetta ottica. In questo caso, viene utilizzata una risoluzione di 1024 x 1024 con uno spessore della fetta Z-stack di 0,37 μm.
7. Prendi un'intera proiezione confocale Z-stack attraverso il lobo antennale, assicurando la cattura dell'intera innervazione neuronale Or42a dei glomeruli VM7.

5. Misure sinaptiche

1. Caricare l'immagine in cieco genotipo/condizione in Fiji (1.54f). Dividi i canali della linea laser facendo clic su Immagine > Colore > Dividi canali.
2. Nel canale sensoriale olfattivo Or42a, determina quali fette contengono l'innervazione Or42a scorrendo l'intero Z-stack, identificando dove inizia e finisce la fluorescenza.
3. Creare una proiezione di fette di somma che includa solo le sezioni contenenti l'innervazione del neurone Or42a facendo clic su Immagine > Pile > Progetto Z > Somma fette e inserendo l'intervallo desiderato.
4. Nelle Figi, fare clic sullo strumento Lazo nella barra superiore per tracciare il contorno dell'innervazione del neurone Or42a nel glomerulo VM7, trattando ciascun glomerulo del lato del cervello in modo indipendente (Figura 3).
5. Moltiplica la circonferenza per il numero di fette Z-stack e lo spessore di ciascuna fetta per ottenere il volume di innervazione del glomerulo sinaptico VM7. Per quantificare il numero di sinapsi, lo strumento find maxima può essere utilizzato insieme alla macro find maxima stacks per contare i punti di sinapsi nella regione delineata ^8,15.

Risultati

La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per l'esposizione agli odori del periodo critico dipendente dall'esperienza olfattiva e i metodi di imaging cerebrale. Il protocollo inizia con l'abbinamento per età delle pupe scure del farato immediatamente prima dell'eclosion (Figura 1A). Le pupe vengono poste in camere odorizzanti per 4 ore, quindi gli adulti appena chiusi vengono capovolti in fiale fresche nel controllo del veicolo o ...

Discussione

Il protocollo di esposizione agli odori e di imaging cerebrale qui presentato può essere utilizzato per indurre e quantificare in modo affidabile la potatura dei glomeruli sinaptici dei neuroni sensoriali olfattivi dipendenti dall'esperienza durante un periodo critico precoce della vita. Studi precedenti che utilizzavano questo paradigma di trattamento per esplorare il rimodellamento del circuito olfattivo hanno iniziato l'esposizione agli odori il 2^° giorno dopo l'eclosion<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f