Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Resumen

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Resumen

La experiencia sensorial olfativa temprana induce una dramática remodelación de los glomérulos sinápticos en el cerebro juvenil de Drosophila , que depende de la dosis de la experiencia, está restringida temporalmente y es transitoriamente reversible solo en un período crítico corto y bien definido. La direccionalidad de la remodelación de la conectividad sináptica de los circuitos cerebrales está determinada por el odorante específico que actúa sobre la clase de receptores respondientes de las neuronas sensoriales olfativas. En general, cada clase de neurona expresa un solo receptor odorizante e inerva un solo glomérulo sináptico olfativo. En el modelo genético de Drosophila , la gama completa de glomérulos olfativos se ha mapeado con precisión mediante la capacidad de respuesta del odorante y la producción conductual. El odorante de butirato de etilo (EB) activa las neuronas receptoras Or42a que inervan el glomérulo VM7. Durante el período crítico de los primeros años de vida, la experiencia de EB impulsa la eliminación de sinapsis dependiente de la dosis en las neuronas sensoriales olfativas Or42a. Los períodos cronometrados de exposición al odorante EB dosificado permiten investigar la poda de la conectividad del circuito dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La microscopía confocal de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal se realiza con marcadores transgénicos impulsados por el receptor Or42a que proporcionan cuantificación del número de sinapsis y el volumen de inervación. El sofisticado conjunto de herramientas genéticas de Drosophila permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la remodelación de los circuitos cerebrales.

Introducción

La remodelación de los circuitos cerebrales juveniles durante los primeros años de vida representa la última oportunidad para que los cambios en la conectividad sináptica a gran escala coincidan con el entorno altamente variable e impredecible en el que nace un animal. Como el grupo más abundante de animales, los insectos comparten^{este mecanismo de} remodelación del período crítico fundamental y conservado evolutivamente. Los períodos críticos se abren con el inicio de la entrada sensorial, exhiben cambios de circuito reversibles para optimizar la conectividad y luego se cierran cuando las fuerzas de estabilización se resisten a una mayor remodelación². Los insectos dependen particularmente de la información sensorial olfativa y muestran un período crítico olfativo bien definido. Drosophila proporciona un excelente modelo genético para investigar este período crítico dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La experiencia odorífera durante los primeros días después de la eclosión provoca cambios sorprendentes en la conectividad del circuito en los glomérulos sinápticos identificados individualmente ^3,4. La dirección de la remodelación depende de la experiencia específica del odorante de entrada. Algunos odorantes causan un aumento en el volumen del glomérulo sináptico durante un par de días después de la eclosión (dpe)3,5,6,7, mientras que otros odorantes causan una rápida eliminación de sinapsis durante el período crítico de 0-2 dpe, lo que resulta en una disminución del volumen de inervación ^8,9,10. Específicamente, la experiencia odorífera del butirato de etilo (EB) impulsa la poda sináptica dependiente de la dosis de las neuronas receptoras olfativas Or42a solo durante este período crítico de vida temprana⁸. La eliminación de sinapsis es completamente reversible mediante la modulación de la entrada de odorante EB dentro del período crítico, pero se vuelve permanente después del cierre del período crítico. Esta poda sináptica dependiente de la experiencia olfativa proporciona un valioso sistema experimental para dilucidar los mecanismos temporalmente restringidos que subyacen a la remodelación de los circuitos cerebrales juveniles.

Aquí, presentamos un protocolo detallado utilizado para inducir y analizar la poda sináptica dependiente de la experiencia EB de las neuronas sensoriales olfativas del receptor Or42a durante el período crítico de la vida temprana. Demostramos que los terminales sinápticos de Or42a en el glomérulo del lóbulo antenal VM7 pueden marcarse específicamente mediante la conducción transgénica de un marcador mCD8::GFP unido a la membrana, ya sea fusionado directamente con el promotor de Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ o utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS (Or42a-Gal4 impulsando UAS-mCD8::GFP)¹². Las sinapsis individuales de las neuronas Or42a pueden marcarse de manera similar utilizando la expresión transgénica dirigida de marcadores de zona activa presinápticos fusionados con una matriz de etiquetas fluorescentes (p. ej., Bruchpilot::RFP)⁸ o una señal densa en electrones para análisis de sinapsis ultraestructural (p. ej., miniSOG-mCherry)⁸. Las imágenes de los terminales sinápticos Or42a se pueden obtener con una combinación de microscopía confocal de barrido láser y microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que la poda de glomérulos sinápticos de Or42a depende de la dosis de EB, escalando a la concentración de la experiencia odorífera cronometrada. El porcentaje de odorante EB disuelto en el aceite mineral utilizado como vehículo puede variar, al igual que la duración programada de la exposición al odorante en animales en etapa de desarrollo. Por último, se muestran los métodos utilizados para analizar el alcance de la poda sináptica de los glomérulos mediante la medición de la intensidad y el volumen de la fluorescencia de inervación de VM7. El número de sinapsis también se puede cuantificar mediante el recuento de puntos sinápticos marcados y la medición de los parámetros de la ultraestructura sináptica mediante microscopía electrónica de transmisión⁸. En general, el protocolo que se muestra aquí es un enfoque poderoso que permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la poda de conectividad sináptica del circuito olfativo de Drosophila durante un período crítico juvenil. La configuración general de exposición a olores descrita en este estudio se ha utilizado en estudios previos utilizando otros olores y ensayando otros glomérulos ^3,7.

Protocolo

1. Exposición a olores

1. Con un pincel fino, clasifique 40-50 animales en etapa de desarrollo como pupas oscuras de farato (90+ h después de la puparición a 25 °C) en viales de poliestireno Drosophila de 25 mm x 95 mm que contienen alimento estándar de melaza de harina de maíz (Figura 1A).
2. Coloque una malla fina de alambre de acero inoxidable sobre el extremo de los viales de Drosophila para contener las moscas y al mismo tiempo permitir un buen flujo de aire. Asegure las tapas de malla de alambre con una película transparente pegada con cinta adhesiva en el costado de los viales de Drosophila .
3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, coloque 1 mL de aceite 100% mineral (control de vehículos) o disuelva el odorante de butirato de etilo (EB) en aceite mineral en otro tubo para producir la concentración deseada (por ejemplo, 15% (150 μL) o 25% (250 μL)).
4. Coloque los tubos de microcentrífuga de control del vehículo o odorante en posición vertical dentro de un recipiente hermético Glasslock de 3700 ml. Con cinta adhesiva, ancle los tubos de forma segura en el centro de las cámaras de odorante junto con los viales de Drosophila (Figura 1B).
5. Coloque las cámaras selladas de control del vehículo y de odorizante EB que contienen los viales de pupas de pharate de Drosophila en una incubadora humidificada (70%) y con temperatura controlada (25 °C) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
6. Retire las moscas recién encerradas después de 4 h de exposición a la cámara de odorante y transfiera rápidamente de 20 a 25 moscas a viales frescos de Drosophila en cámaras con odorante recién hecho (Figura 1A, B). Deseche las pupas sin cerrar.
7. Mantenga las moscas en sus cámaras odoríferas selladas en las incubadoras durante un total de 24 h. Para una dosificación de odorante más prolongada, transfiera rápidamente las moscas a nuevos viales de Drosophila en cámaras odoríferas recién hechas cada 24 h.
8. Anestesiar a las moscas en etapa de desarrollo sumergiéndolas en un plato de etanol al 70% durante 1 minuto en preparación para la disección inmediata del cerebro y el procesamiento inmunocitoquímico.

2. Disección cerebral

1. Marque los viales como control de vehículo (100% aceite mineral solamente) o expuestos a EB (% EB) mediante el etiquetado y mantenga estas designaciones durante toda la disección del cerebro y el procesamiento posterior. Procese de 10 a 20 animales para cada condición de genotipo/olor.
2. Con fórceps, transfiera una sola mosca anestesiada a un plato pequeño de solución salina tamponada con fosfato (PBS) recién ^hecha13. Sumerja la mosca en PBS y continúe con la disección completa del cerebro con la mosca completamente sumergida.
3. Con pinzas finas # 4 afiladas en ambas manos, coloque la mosca con el lado ventral hacia arriba y agarre la parte superior del tórax con una pinza y la cabeza debajo de la probóscide con las otras pinzas. Tenga cuidado de no penetrar en el cerebro.
4. Retire la cabeza del resto del cuerpo tirando suavemente en direcciones opuestas con ambas manos. La cabeza debe desprenderse fácilmente del tórax; dejar la cabeza aislada para la disección (Figura 1C).
5. Deslice las pinzas utilizadas anteriormente para agarrar el tórax por debajo del lado opuesto de la probóscide. Comience a tirar suavemente de la cutícula del exoesqueleto en direcciones opuestas para que se desgarre entre los ojos y revele el cerebro.
6. Al tirar, los lóbulos ópticos del cerebro pueden separarse junto con el exoesqueleto. Para evitar esto, use un tirón lento y constante con las dos pinzas mientras retira la cutícula del exoesqueleto (Figura 1C, centro).
7. Continúe retirando la cutícula del exoesqueleto de la cabeza. Asegúrese de que se hayan retirado todas las partes del exoesqueleto. Extirpa todos los tejidos adheridos al cerebro, incluido el cuerpo graso y la tráquea que sobresalga.
8. Para evitar que se pegue, enjuague la punta de una pipeta P20 con PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Inmediatamente después de la disección, transfiera los cerebros a la solución de fijación (4% de paraformaldehído (PFA) + 4% de sacarosa) en un tubo tapado (Figura 1C, D).

3. Inmunocitoquímica cerebral

1. Fije el cerebro durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) con rotación de extremo a extremo. Mientras mantiene los cerebros en el tubo, pipetee y deseche adecuadamente el fijador peligroso. Lave rápidamente los cerebros fijos 3 veces con PBS (Figura 1D).
2. Los cerebros a menudo se pueden encontrar atascados en la tapa de los tubos después de la rotación. Para evitar la pérdida accidental de cerebros, que es un peligro constante en todas las transferencias, use un microscopio de disección mientras pipetea líquidos.
3. En preparación para el marcaje de anticuerpos, bloquee los cerebros fijos durante 1 h en RT en PBST + 1% de albúmina sérica bovina (BSA) + 0,5% de suero normal de cabra (NGS) con rotación constante de extremo a extremo (Figura 1D).
4. Retire el bloqueo e incube los cerebros con el anticuerpo primario seleccionado diluido adecuadamente en PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubar los cerebros durante la noche (14-16 h) a 4 °C con rotación constante.
   NOTA: Ejemplos de anticuerpos utilizados: anti-CadN de rata (dilución 1:50)¹⁴ para marcar glomérulos sinápticos y anti-GFP de pollo (1:1000)⁸ para marcar Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipetear el anticuerpo primario. Lave los cerebros 3 veces durante 20 minutos cada uno con PBST. Incubar cerebros con anticuerpos secundarios diluidos en PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS durante 2 h en RT con rotación constante.
   NOTA: Alternativamente, incubar los cerebros durante la noche (14-16 h) a 4 °C. Diluir anticuerpos en PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS; Anticuerpos secundarios utilizados aquí: 488 cabras anti-gallinas (1:250) y 546 cabras anti-ratas (1:250).
6. Pipetear los anticuerpos secundarios. Lave los cerebros 3 veces durante 20 minutos cada uno con PBST. Termine lavando los cerebros durante 20 minutos con PBS (Figura 1D).
7. Prepare portaobjetos de microscopio de vidrio (75 mm x 25 mm) añadiendo dos tiras finas de cinta adhesiva de doble cara al portaobjetos a una distancia de ~25 mm entre sí. Esto proporciona un espaciador para evitar aplastar los cerebros.
8. Pipetea ~10-15 μL de medio de montaje entre las dos tiras de cinta para montar los cerebros. Con una punta de pipeta P20 previamente enjuagada con PBST, transfiera los cerebros marcados al portaobjetos del microscopio (Figura 1E).
9. Una vez que se hayan transferido los cerebros, use un pincel fino para alinearlos, asegurándose de que los lóbulos de las antenas estén hacia arriba. Busque el lado que tiene la joroba arqueada, que contendrá los lóbulos de las antenas.
10. Una vez que los cerebros estén correctamente orientados, cúbralos con un cubreobjetos de vidrio (n.º 1.5H), asegurándose de que el cubreobjetos esté seguro en la cinta. A continuación, rellene los lados del cubreobjetos con un medio de montaje adicional (Figura 1E).
11. Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje que el portaobjetos se seque completamente y luego guárdelo en el refrigerador para obtener imágenes posteriores.

4. Imagen confocal

1. Ciega todas las láminas cerebrales tanto al genotipo como a las condiciones de experiencia antes de la obtención de imágenes marcando la lámina con una etiqueta codificada para su posterior decodificación.
2. Utilice un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 63x. Utilizamos un microscopio Zeiss 510 META en todas las imágenes que se muestran aquí (Figura 1F).
3. Utilice líneas láser apropiadas para los fluoróforos empleados. En este caso, se utiliza un láser Argon 488 y HeNe 543 para obtener imágenes de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal y de las neuronas sensoriales olfativas Or42a (Figura 2).
4. Determine la ganancia y el desplazamiento óptimos para ambos canales, manteniendo idealmente la ganancia para ambos canales <750 y el desplazamiento ≈0. Esto se hace para garantizar que la relación señal-ruido sea óptima al tiempo que se limita el fondo.
5. Coloque las imágenes en el centro del cerebro. Al tomar imágenes, los glomérulos VM7 residen proximalmente al orificio que queda en el centro del cerebro después de la extirpación del esófago durante la disección (Figura 2A).
   NOTA: Los glomérulos VM7 siempre estarán cerca de la abertura del esófago. Sin embargo, la ubicación y el tamaño exactos varían ligeramente en función de la disección del cerebro y las diferencias de montaje, así que tenga esto en cuenta al tomar imágenes.
6. Seleccione la resolución de imagen y el grosor óptico del corte. En este caso, se utiliza una resolución de 1024 x 1024 con un grosor de corte de pila Z de 0,37 μm.
7. Tome una proyección confocal completa de la pila Z a través del lóbulo antenal, asegurando la captura de la inervación completa de la neurona Or42a de los glomérulos VM7.

5. Mediciones sinápticas

1. Cargue la imagen cegada por genotipo/condición en Fiji (1.54f). Divida los canales de línea láser haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales.
2. En el canal sensorial olfativo Or42a, determine qué cortes contienen la inervación de Or42a desplazándose por la totalidad de la pila Z, identificando dónde comienza y termina la fluorescencia.
3. Cree una proyección de segmentos de suma que incluya solo segmentos que contengan inervación de neuronas Or42a haciendo clic en Imagen > Pilas > Proyecto Z > Segmentos de suma e ingresando el rango deseado.
4. En Fiji, haga clic en la herramienta Lazo en la barra superior para trazar el contorno de la inervación de las neuronas Or42a en el glomérulo VM7, tratando cada glomérulo del lado del cerebro de forma independiente (Figura 3).
5. Multiplique la circunferencia por el número de cortes de la pila Z y el grosor de cada corte para obtener el volumen de inervación del glomérulo sináptico VM7. Para cuantificar el número de sinapsis, se puede utilizar la herramienta encontrar máximos junto con la macro encontrar pilas de máximos para contar los puntos de sinapsis en la región descrita ^8,15.

Resultados

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para los métodos de imagen cerebral, exposición a odorantes y período crítico dependientes de la experiencia olfativa. El protocolo comienza con la coincidencia de edad de las pupas oscuras de farato inmediatamente antes de la eclosión (Figura 1A). Las pupas se colocan en cámaras odoríferas durante 4 h, y luego los adultos recién encerrados se voltean a viales nuevos en las cámara...

Discusión

La exposición a olores y el protocolo de imágenes cerebrales presentados aquí se pueden utilizar para inducir y cuantificar de manera confiable la poda de glomérulos sinápticos de las neuronas sensoriales olfativas dependientes de la experiencia durante un período crítico en los primeros años de vida. Los estudios anteriores que utilizaron este paradigma de tratamiento para explorar la remodelación del circuito olfativo comenzaron la exposición al odorante el^{segundo día d...}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
For Odor Exposure
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Mineral oil	Sigma Aldrich	M3516
Odor chambers	Glasslock
Paint brushes	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Wire mesh	Scienceware	378460000
Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluted to 70%
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyde	Electron Microscope Sciences	157-8	Diluted to 4%
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluted to 1x
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
546 goat anti-rat	Invitrogen	A11081
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9647
Chicken anti-GFP	Abcam	13970
Coverslips	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Double-sided tape	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nail polish	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analysis
Any computer/laptop
Confocal microscope	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Version 2.14.0/1.54f