胚胎显微注射用于果蝇转基因

摘要

本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了一种优化的胚胎显微注射方案，这是创造转基因果蝇的关键步骤。

摘要

果蝇的转基因是在生物体水平上研究基因功能的重要方法。胚胎显微注射是构建转基因果蝇的关键步骤。显微注射需要某些类型的设备，包括显微注射器、显微操作器、倒置显微镜和立体显微镜。使用质粒小量制备试剂盒分离的质粒可用于显微注射。对胚层前或合胞体胚层阶段的胚胎进行显微注射，其中细胞核共享一个共同的细胞质。细胞过滤器简化了胚胎去绒毛的过程。胚胎去绒毛膜和干燥的最佳时间需要通过实验确定。为了提高胚胎显微注射的效率，由拉拔器制备的针头需要由针磨机进行斜面处理。在磨针的过程中，我们采用带有压力表的脚踏气泵，以避免针尖的毛细效应。我们为每个质粒常规注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系。本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了果蝇胚胎显微注射转基因的详细方案。

引言

果蝇 Drosophila melanogaster 极易接受基因操作和遗传分析。转基因果蝇广泛用于生物学研究。自 1980 年代初开发以来，P 元件转座子介导的转基因一直是果蝇研究中不可或缺的¹。在某些情况下，其他转座子（如 piggyBac 和 Minos）也已用于果蝇的转基因²。通过转座子的转基因被随机插入果蝇基因组中，不同基因组位点的转基因表达水平可能因位置效应而发生变化，因此无法进行比较²。phiC31 介导的位点特异性转基因³ 克服了这些缺点。噬菌体 phiC31 基因编码一种整合酶，该整合酶介导果蝇³ 中 attB 和 attP 位点之间的序列特异性重组。许多 attP 停靠位点已被表征，可在布卢明顿果蝇库存中心 3,4,5,6,7,8,9 中使用。

研究方案

1. 质粒的制备

1. 使用质粒小量制备试剂盒从 4 mL 过夜细菌培养物中分离质粒。用 40 μL 洗脱缓冲液洗脱。
   注：无需使用质粒 midi 制备试剂盒分离质粒。质粒小量制备试剂盒可以完全满足胚胎显微注射的实验要求。在该方案中，制备的 UAS-cDNA/ORF 质粒包含 10 个拷贝的 UAS、一个 Hsp70 最小启动子、一个 attB 位点、一个迷你白基因和一个感兴趣的基因。
2. 使用分光光度计测定质粒DNA浓度，并将其储存在-80°C冰箱中。
   注：质粒浓度对于成功的胚胎显微注射并不重要，因为质粒浓度范围为 20 ng/μL 至 1683 ng/μL，适用于果 蝇 的转基因（补充表 1）。
3. 在显微注射之前，解冻质粒并以 13000 x g 离心 5 分钟。
4. 将 10 μL 每个质粒从液体的上层转移到新的 1.5 mL 试管中。

2. 拉针

1. 使用选定的设置（热量：500，拉力：50，Vel：60，延迟：90，压力：200，斜坡测试：510）打开拔针器。
2. 将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm、内径 0.75 mm、长度 10 cm）插入拔针器并盖上盖子。
3. 按下 P....

讨论

在这里，我们提出了一种用于果 蝇转基因的胚胎显微注射方案。对于 phiC31 介导的位点特异性转基因，我们为每个质粒注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系（补充表 2）。根据我们的经验，通过质粒小量制备试剂盒分离的质粒 DNA 足以在 果蝇中转基因。质粒 DNA 浓度范围为 20 ng/μL 至 1683 ng/μL，可能对转基因成功率没有明显影响，因为它们中的大.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745