胚胎显微注射用于果蝇转基因

摘要

本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了一种优化的胚胎显微注射方案，这是创造转基因果蝇的关键步骤。

摘要

果蝇的转基因是在生物体水平上研究基因功能的重要方法。胚胎显微注射是构建转基因果蝇的关键步骤。显微注射需要某些类型的设备，包括显微注射器、显微操作器、倒置显微镜和立体显微镜。使用质粒小量制备试剂盒分离的质粒可用于显微注射。对胚层前或合胞体胚层阶段的胚胎进行显微注射，其中细胞核共享一个共同的细胞质。细胞过滤器简化了胚胎去绒毛的过程。胚胎去绒毛膜和干燥的最佳时间需要通过实验确定。为了提高胚胎显微注射的效率，由拉拔器制备的针头需要由针磨机进行斜面处理。在磨针的过程中，我们采用带有压力表的脚踏气泵，以避免针尖的毛细效应。我们为每个质粒常规注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系。本文以果蝇中 phiC31 整合酶介导的转基因为例，提出了果蝇胚胎显微注射转基因的详细方案。

引言

果蝇 Drosophila melanogaster 极易接受基因操作和遗传分析。转基因果蝇广泛用于生物学研究。自 1980 年代初开发以来，P 元件转座子介导的转基因一直是果蝇研究中不可或缺的¹。在某些情况下，其他转座子（如 piggyBac 和 Minos）也已用于果蝇的转基因²。通过转座子的转基因被随机插入果蝇基因组中，不同基因组位点的转基因表达水平可能因位置效应而发生变化，因此无法进行比较²。phiC31 介导的位点特异性转基因³ 克服了这些缺点。噬菌体 phiC31 基因编码一种整合酶，该整合酶介导果蝇³ 中 attB 和 attP 位点之间的序列特异性重组。许多 attP 停靠位点已被表征，可在布卢明顿果蝇库存中心 3,4,5,6,7,8,9 中使用。

果蝇的 phiC31 转基因系统已被果蝇群落广泛使用。在 attP 停靠位点中，X 染色体上的 attP18、第二条染色体上的 attP40 和第三条染色体上的 attP2 通常是每条染色体上转基因整合的首选位点，因为这三个位点的转基因显示出高水平的诱导表达，而基础表达水平较低⁵。然而，最近，van der Graaf 及其同事发现，靠近 Msp300 基因位点的 attP40 位点和整合到 attP40 的转基因会导致果蝇¹⁰ 中的幼虫肌肉核聚集。在最近的另一项研究中，Duan 及其同事发现，纯合子 attP40 染色体破坏了果蝇¹¹ 中 Or47b 嗅觉受体神经元类的正常肾小球组织。这些发现表明，在设计实验和解释数据时应包括严格的控制。

果蝇由于其生命周期短、成本低、易于维护，是体内询问基因功能的理想模式生物。全基因组遗传筛选依赖于果蝇 12,13,14,15 中全基因组转基因文库的构建。我们之前基于二元 GAL4/上游激活序列 （GAL4/UAS） 系统生成了 5551 个 UAS-cDNA/ORF 构建体，涵盖了果蝇基因组学资源中心 （DGRC） 黄金收藏¹⁶ 中人类保守的果蝇基因的 83%。UAS-cDNA/ORF 质粒可用于在果蝇中创建转基因 UAS-cDNA/ORF 文库。高效的胚胎显微注射技术可以加速转基因果蝇文库的创建。

对于胚胎显微注射，针尖通常靠在盖玻片¹⁷ 上折断。因此，针头经常堵塞或导致大量细胞质泄漏，当这些问题出现时，必须使用新的针头。尽管斜面针可以提高显微注射效率，但研磨液在研磨过程中会进入斜面尖端。斜面尖端中的研磨溶液不会迅速自然蒸发;因此，针头不能在坡口后直接用于显微注射。 这些因素降低了胚胎显微注射程序的效率。在这里，以果 蝇 中 phiC31 介导的位点特异性转基因为例，我们提出了一种用于果 蝇转基因的胚胎显微注射方案。为了防止研磨液进入针头，我们利用气泵在针内施加气压，从而防止研磨液进入斜面尖端。斜面针头在斜面后即可直接用于样品加载和显微注射。

研究方案

1. 质粒的制备

1. 使用质粒小量制备试剂盒从 4 mL 过夜细菌培养物中分离质粒。用 40 μL 洗脱缓冲液洗脱。
   注:无需使用质粒 midi 制备试剂盒分离质粒。质粒小量制备试剂盒可以完全满足胚胎显微注射的实验要求。在该方案中，制备的 UAS-cDNA/ORF 质粒包含 10 个拷贝的 UAS、一个 Hsp70 最小启动子、一个 attB 位点、一个迷你白基因和一个感兴趣的基因。
2. 使用分光光度计测定质粒DNA浓度，并将其储存在-80°C冰箱中。
   注:质粒浓度对于成功的胚胎显微注射并不重要，因为质粒浓度范围为 20 ng/μL 至 1683 ng/μL，适用于果 蝇 的转基因（补充表 1）。
3. 在显微注射之前，解冻质粒并以 13000 x g 离心 5 分钟。
4. 将 10 μL 每个质粒从液体的上层转移到新的 1.5 mL 试管中。

2. 拉针

1. 使用选定的设置（热量:500，拉力:50，Vel:60，延迟:90，压力:200，斜坡测试:510）打开拔针器。
2. 将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.0 mm、内径 0.75 mm、长度 10 cm）插入拔针器并盖上盖子。
3. 按下 Pull 按钮。每个玻璃毛细管制成两个针头。

3. 磨针（图 1）

1. 使用装有适当磨料板（适用于 0.7-2.0 μm 尖端尺寸）的针式研磨机。
2. 用研磨溶液（100 mL 蒸馏水和 0.9 g NaCl、1 mL 润湿剂）润湿布（参考丝）并固定布。
3. 打开针式研磨机并保持研磨板旋转。
4. 通过硅胶毛细管将针连接到带有压力表的脚踏气泵上，然后将针安装到针式研磨机的持针器上。将针相对于磨板的角度调整到 35°（图 1A、B）。
5. 通过在显微镜下使用粗略的控制旋钮调整研磨板表面上方的针尖位置（图 1C）。
   注意:如拉拔器用户手册中所述，在第 2 部分获得的拉针具有 6-8 mm 的锥度和小于 1 μm 的尖端（图 1D）。
6. 使用脚踏气泵将针的内部压力保持在 40 psi。在显微镜下使用精细的控制旋钮调整针尖的位置，使针尖接触磨板。
7. 研磨 3-5 秒。当微小气泡从针尖出来时，卸下针头（图 1E）。
   注意: 在研磨过程中，使用气泵可防止研磨液虹吸。
8. 将接地针放入储物箱中。
   注意:尽可能使用新鲜研磨的针头，但研磨针头可以在显微注射前至少保存在储存箱中几周。

4. 准备用于加载质粒的移液器

1. 用酒精燃烧器的外火焰加热 200 μL 移液器。
2. 一旦它开始融化，拉伸移液器。
3. 用剪刀剪掉拉伸移液管的密封端，然后用拉伸的移液管将 DNA 加载到研磨针中。
   注意:或者，市面上有用于填充研磨针的极长和细的尖端。
4. 将这些移液器放入高压灭菌的塑料盒中。

5. 收集胚胎

1. 从 50 个小瓶中孵化 3 天后收集表达 phiC31 整合酶并带有 attP2 对接位点的果蝇 （vas-phiC31; + ; attP2），并将它们转移到笼子 （φ 90 mm x 150 mm） 中。在每个葡萄琼脂板的中心加入少许新鲜酵母酱¹⁸.
2. 准备 2-4 笼苍蝇。将笼子和板保持在 25 °C，每天更换板 2-4 天。
   注意:本研究结合了第一条染色体上的 vas-phiC31 转基因（库存 # 36313，布卢明顿 果蝇 库存中心）和第三条染色体上的 attP2 转基因（库存 # 36313，布卢明顿 果蝇 库存中心）。所得原液 （vas-phiC31; + ; attP2） 用于该方案。酵母糊需要每天准备，新鲜的酵母糊必须喂给果蝇。更换的笼子需要清理和干燥，以去除笼子中剩余的胚胎。
3. 在显微注射当天，早上更换笼子和板。然后，每 30 分钟更换一次板并从这些板中收集胚胎。在室温 （RT） 下更换所有笼子和板，然后将笼子和板保持在 25 °C。
   注意:一些方案喜欢在 18 °C 下孵育笼子和板以进行产蛋。这取决于显微注射所需的胚胎数量。

6. 去绒毛胚胎

1. 将 60 mL 漂白剂（活性氯含量为 34-46 g/L）和 140 mL 双蒸水混合，制备 140% 漂白剂。
2. 用刷子或镊子去除葡萄汁琼脂平板上剩余的果蝇，然后用双蒸水将胚胎冲洗到细胞过滤器中。
3. 用薄纸擦干含有胚胎的细胞过滤器。
4. 将其置于含有 30% 漂白剂的培养皿中，用手或水平振荡器以 60 rpm 旋转细胞过滤器 1.5 分钟。
   注意:冲洗是一个关键步骤。如果冲洗时间不够长，胚胎的壳就不会完全脱落。如果冲洗时间过长，会导致胚胎变软，容易破裂。细胞过滤器应完全浸没在 30% 漂白剂中。戴上橡胶手套和实验服，以避免漂白剂造成伤害。
5. 用储存在实验室塑料洗涤瓶中的双蒸水冲洗胚胎 2 分钟，以去除残留的漂白剂。为阵容挑选漂浮胚胎。

7. 排列胚胎

1. 用刀片将固体葡萄汁琼脂切成长条。
   注意:使用紫葡萄汁，以便更容易排列白色胚胎。
2. 使用画笔将胚胎转移到一条长条上。
3. 用解剖针沿着长条的边缘排列大约 60 个胚胎，它们的后部面向条带的外侧。在 60 分钟内排列大约 5 个胚胎。
   注意:小孔是胚胎前极的锥形突起，精子通过该突起进入卵母细胞受精（图 2A）。因此，根据胚胎前极的锥形突起，很容易确定去绒毛膜胚胎的后部。
4. 沿盖玻片边缘纵向放置 18 mm 双面胶带 （18 mm x 18 mm），然后取下纸基。轻轻地将盖玻片压在对齐的胚胎上。确保胚胎粘在胶带的中心。

8. 干燥胚胎

1. 将盖玻片和排列好的胚胎放入装有干燥剂的盒子中。干燥时间因温度和湿度而异。
   注意:干燥时间对于显微注射至关重要，需要通过实验确定。干燥时间通常在夏季为 9-10 分钟，冬季为 17-18 分钟。
2. 用卤烃油覆盖胚胎。
   注意:不要在胚胎上滴太多油，因为多余的油可能会溢出粘合剂。卤烃油 700 和卤烃油 27 的体积比为 1:3。

9. 胚胎显微注射

1. 使用加长移液管将 2 μL DNA 加载到针头中。确保针头中没有气泡。将针头放入显微操作器的持针器中。
2. 将覆盖有卤代烃油的对齐胚胎置于倒置显微镜下。确保胚胎的后端面向针头。
3. 使用显微操作器将针头靠近胚胎。清除针头。确保可以看到从针头流出的一滴液体。从 300 hPa 注射压力和 20 hPa 平衡压力开始，调整注射压力和平衡压力，以确保液滴的最佳大小。
4. 使用显微操作器将针头插入胚胎的后端，并使用连接到显微注射器的脚踏控制器注射 DNA（图 2）。如果可以看到一个小光晕，则 DNA 被成功注射到胚胎中。
   注意:选择要注射的多核胚胎，并使用"清洁"按钮杀死较旧的胚胎。如果注射后有大量细胞质泄漏，则胚胎干燥不足。如果注射后只有少量或没有细胞质泄漏，则认为注射成功。如果注射后超过三分之一的胚胎渗漏细胞质，请将干燥时间延长 1-2 分钟。如果超过三分之一的胚胎过度干燥，请将干燥时间缩短 1-2 分钟。
5. 从胚胎中取出针头。将针头移动到下一个胚胎的后端。重复上述步骤。
6. 将注射的胚胎放入琼脂平板中。将板放在 18-20 °C 的房间里。 第二天，将板转移到温度为 25 °C、湿度为 50%-60% 的培养箱中，孵育 1 天。
   注意:注射后，将胚胎保持在 18-20 °C 的温度下以减缓其发育，促进质粒 DNA 整合到 果蝇 基因组中，并提高注射胚胎的存活率。

10. 收集幼虫

1. 使用解剖针刮擦并松开小瓶中的食物。给食物加几滴蒸馏水。
   注意:让蒸馏水被食物吸收，以防止幼虫溺水。
2. 从培养箱中取出板。
3. 在立体显微镜下用画笔收集孵化的幼虫，并将它们转移到小瓶中。
4. 将样品瓶放入温度为 25 °C、湿度为50%-60% 的培养箱中。

11. 获取转基因果蝇

1. 将小瓶在 25 °C下孵育 10 天后收集孵化的果蝇。
2. 将一只雄蝇与 TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 平衡器的三只原始雌蝇杂交，并将一只雌蝇与 TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 平衡器的三只雄蝇杂交。
3. 将杂交架放入温度为 25 °C、湿度为 50%-60% 的培养箱中。
4. 用橙色的眼睛筛选苍蝇的后代。这些是转基因果蝇（图 3A-C）。
   注意:在 attP2 对接位点携带转基因拷贝的果蝇有橙色的眼睛。
5. 将一只橙眼雄蝇与 TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 平衡机的三只处女雌蝇杂交以建立种群。
   注:需要建立不止一代杂交，才能在第一条染色体上交叉 phiC31 转基因。

结果

注射针的尖端由针式研磨机斜面（图 1）。一个人可以在一小时内斜切 50-60 根针。DNA 在胚层前或合体胚层阶段显微注射到胚胎的后部，其中细胞核共享一个共同的细胞质（图 2A）。胚胎的后部可以根据胚胎前部的小孔很容易定位（图 2A）。细胞胚层和原肠胚形成阶段的胚胎不能用于注射，因为在这些阶段每个细胞核都被细胞膜包...

讨论

在这里，我们提出了一种用于果 蝇转基因的胚胎显微注射方案。对于 phiC31 介导的位点特异性转基因，我们为每个质粒注射 120-140 个胚胎，并为大约 85% 的质粒获得至少一个转基因系（补充表 2）。根据我们的经验，通过质粒小量制备试剂盒分离的质粒 DNA 足以在 果蝇中转基因。质粒 DNA 浓度范围为 20 ng/μL 至 1683 ng/μL，可能对转基因成功率没有明显影响，因为它们中的大...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745