Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Resumo

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Resumo

A transgênese em Drosophila é uma abordagem essencial para estudar a função do gene no nível do organismo. A microinjeção de embriões é uma etapa crucial para a construção de moscas transgênicas. A microinjeção requer alguns tipos de equipamentos, incluindo um microinjetor, um micromanipulador, um microscópio invertido e um microscópio estéreo. Os plasmídeos isolados com um kit de minipreparação de plasmídeo são qualificados para microinjeção. Embriões no estágio pré-blastoderma ou blastoderma sincicial, onde os núcleos compartilham um citoplasma comum, são submetidos a microinjeção. Um filtro de células facilita o processo de descorionação de embriões. O tempo ideal para descorionação e dessecação de embriões precisa ser determinado experimentalmente. Para aumentar a eficiência da microinjeção de embriões, as agulhas preparadas por um extrator precisam ser chanfradas por um moedor de agulhas. No processo de moagem de agulhas, utilizamos uma bomba de ar de pé com um manômetro para evitar o efeito capilar da ponta da agulha. Injetamos rotineiramente 120-140 embriões para cada plasmídeo e obtemos pelo menos uma linha transgênica para cerca de 85% dos plasmídeos. Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo detalhado para microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila.

Introdução

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é extremamente passível de manipulação genética e análise genética. As moscas-das-frutas transgênicas são amplamente utilizadas em pesquisas biológicas. Desde que foi desenvolvida no início da década de 1980, a transgênese mediada por transposons do elemento P tem sido indispensável para a pesquisa de Drosophila ¹. Em alguns cenários, outros transposons, como piggyBac e Minos, também foram usados para transgênese em Drosophila ². Os transgenes via transposon são inseridos aleatoriamente no genoma da Drosophila, e os níveis de expressão de transgenes em diferentes loci genômicos podem variar devido aos efeitos de posição e, portanto, não podem ser comparados². Essas desvantagens foram superadas pela transgênese site-specific mediada por phiC31³. O gene bacteriófago phiC31 codifica uma integrase que medeia a recombinação específica da sequência entre os sítios attB e attP em Drosophila³. Muitos locais de ancoragem attP foram caracterizados e estão disponíveis no Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

O sistema de transgênese phiC31 para Drosophila tem sido amplamente utilizado pela comunidade de moscas. Entre os locais de encaixe attP, attP18 no cromossomo X, attP40 no segundo cromossomo e attP2 no terceiro cromossomo são geralmente os locais preferidos para integração de transgenes em cada cromossomo porque os transgenes nos três locais mostram altos níveis de expressão induzível enquanto têm baixos níveis de expressão basal⁵. Recentemente, no entanto, van der Graaf e colegas descobriram que o local attP40, próximo ao locus do gene Msp300, e os transgenes integrados no attP40 causam agrupamento nuclear do músculo larval em Drosophila¹⁰. Em outro estudo recente, Duan e colegas descobriram que o cromossomo attP40 homozigoto interrompe a organização glomerular normal da classe de neurônios do receptor olfativo Or47b em Drosophila¹¹. Esses achados sugerem que controles rigorosos devem ser incluídos ao projetar experimentos e interpretar dados.

Drosophila é um organismo modelo ideal para interrogação in vivo da função gênica devido ao seu curto ciclo de vida, baixo custo e fácil manutenção. A triagem genética de todo o genoma depende da construção de bibliotecas transgênicas de todo o genoma em Drosophila 12,13,14,15. Anteriormente, geramos 5551 construções UAS-cDNA / ORF com base no sistema binário GAL4 / sequência ativadora upstream (GAL4 / UAS), cobrindo 83% dos genes de Drosophila conservados em humanos na Coleção de Ouro¹⁶ do Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). Os plasmídeos UAS-cDNA/ORF podem ser usados para a criação de uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila. A tecnologia eficiente de microinjeção de embriões pode acelerar a criação de bibliotecas de moscas transgênicas.

Para microinjeção de embriões, a ponta da agulha é normalmente quebrada contra uma lamínula¹⁷. Assim, as agulhas freqüentemente ficam entupidas ou causam vazamento de grandes quantidades de citoplasma e, quando esses problemas surgem, novas agulhas devem ser empregadas. Embora as agulhas de chanfro possam aumentar a eficiência da microinjeção, a solução de moagem entra na ponta chanfrada durante o processo de moagem. A solução de moagem na ponta chanfrada não evapora rapidamente naturalmente; portanto, as agulhas não podem ser utilizadas para microinjeção diretamente após o chanfro. Esses fatores reduzem a eficiência dos procedimentos de microinjeção de embriões. Aqui, usando a transgênese site-specific mediada por phiC31 em Drosophila como exemplo, apresentamos um protocolo de microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila. Para evitar que a solução de moagem entre na agulha, utilizamos uma bomba de ar para exercer pressão de ar dentro da agulha, evitando assim que a solução de moagem entre na ponta chanfrada. As agulhas chanfradas estão prontas para o carregamento da amostra e microinjeção diretamente após o chanfro.

Protocolo

1. Preparação de plasmídeos

1. Isole plasmídeos de culturas bacterianas de 4 mL durante a noite usando um kit de minipreparação de plasmídeo. Eluir com 40 μL de tampão de eluição.
   NOTA: O isolamento de plasmídeos usando um kit de preparação midi de plasmídeo não é necessário. Um kit de minipreparação de plasmídeo pode atender totalmente aos requisitos experimentais para microinjeção de embriões. Neste protocolo, os plasmídeos UAS-cDNA/ORF preparados contêm dez cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, um sítio attB, um gene mini-branco e um gene de interesse.
2. Determinar a concentração de ADN plasmídico utilizando um espectrofotómetro e armazená-lo a -80 °C de congelador.
   NOTA: A concentração de plasmídeo não é crítica para uma microinjeção de embrião bem-sucedida, pois as concentrações de plasmídeo variando de 20 ng/μL a 1683 ng/μL funcionam bem para transgênese em Drosophila (Tabela Suplementar 1).
3. Pouco antes da microinjeção, descongele os plasmídeos e centrifugue a 13000 x g por 5 min.
4. Transfira 10 μL de cada plasmídeo da camada superior do líquido para um novo tubo de 1,5 mL.

2. Puxando agulhas

1. Ligue um extrator de agulhas com as configurações selecionadas (Calor: 500, Tração: 50, Vel: 60, Atraso: 90, Pressão: 200, Teste de rampa: 510).
2. Insira um capilar de vidro borossilicato (diâmetro externo 1.0 mm, diâmetro interno 0.75 mm, 10 cm de comprimento) no extrator de agulha e feche a tampa.
3. Pressione o botão Puxar . Cada capilar de vidro faz duas agulhas.

3. Agulhas de moagem (Figura 1)

1. Use um moedor de agulhas montado com uma placa abrasiva apropriada (para tamanhos de ponta de 0,7-2,0 μm) de um moedor de agulhas.
2. Molhe o pano (fio de referência) com solução de moagem (100 mL de água destilada com 0,9 g de NaCl, 1 mL de agente umectante) e fixe o pano.
3. Ligue o moedor de agulhas e mantenha a placa de moagem girando.
4. Conecte uma agulha a uma bomba de ar de pé com um manômetro por meio de um tubo capilar de silicone e, em seguida, monte a agulha em um porta-agulha do moedor de agulhas. Ajuste o ângulo da agulha em relação à placa de moagem para 35° (Figura 1A, B).
5. Ajuste a posição da ponta da agulha logo acima da superfície da placa de moagem usando um botão de controle grosso sob o microscópio (Figura 1C).
   NOTA: As agulhas puxadas obtidas na seção 2 têm um cone de 6-8 mm e uma ponta inferior a 1 μm (Figura 1D), conforme descrito no manual do usuário do extrator.
6. Mantenha a pressão interna da agulha em 40 psi usando a bomba de ar do pé. Ajuste a posição da ponta da agulha usando um botão de controle fino sob o microscópio e faça a ponta da agulha tocar a placa de moagem.
7. Moer por 3-5 s. Quando pequenas bolhas de ar saírem da ponta da agulha, descarregue a agulha (Figura 1E).
   NOTA: No processo de moagem, o uso de uma bomba de ar evita que a solução de moagem seja sifonada.
8. Coloque as agulhas moídas em um estojo de armazenamento.
   NOTA: Use agulhas moídas na hora o máximo possível, embora as agulhas moídas possam ser mantidas em um estojo de armazenamento por pelo menos algumas semanas antes da microinjeção.

4. Preparação de pipetas para carregamento de plasmídeos

1. Aquecer uma pipeta de 200 μL com a chama exterior de um queimador de álcool.
2. Quando começar a derreter, estique a pipeta.
3. Corte a extremidade selada da pipeta esticada com uma tesoura e a pipeta esticada está pronta para carregar o DNA em uma agulha moída.
   NOTA: Alternativamente, pontas extremamente longas e finas para encher agulhas moídas estão disponíveis comercialmente.
4. Coloque essas pipetas em uma caixa plástica autoclavada.

5. Coleta de embriões

1. Recolher moscas (vas-phiC31; + ; attP2) que expressam a integrase phiC31 e que ostentam o local de ancoragem do attP2 3 dias após a eclosão de 50 frascos para injetáveis e transferi-las para uma gaiola (φ 90 mm x 150 mm). Adicione um pouco de pasta de fermento fresco no centro de cada placa de ágar uva¹⁸.
2. Prepare 2-4 gaiolas de moscas. Mantenha as gaiolas e placas a 25 °C e troque as placas todos os dias durante 2-4 dias.
   NOTA: Este estudo combinou o transgene vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) no primeiro cromossomo e o transgene attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) no terceiro cromossomo. O estoque resultante (vas-phiC31; +; attP2) é usado neste protocolo. A pasta de fermento precisa ser preparada diariamente e a pasta de fermento fresca deve ser fornecida às moscas. As gaiolas substituídas precisam ser limpas e secas para se livrar dos embriões restantes nas gaiolas.
3. No dia da microinjeção, troque as gaiolas e placas pela manhã. Em seguida, troque as placas a cada 30 minutos e colete os embriões dessas placas. Substituir todas as gaiolas e placas à temperatura ambiente (RT) e depois manter as gaiolas e placas a 25 °C.
   NOTA: Alguns protocolos preferem incubar as gaiolas e placas a 18 °C para postura de ovos. Depende do número de embriões necessários para a microinjeção.

6. Embriões descorionantes

1. Prepare alvejante a 30% misturando 60 mL de alvejante (contendo teor de cloro ativo de 34-46 g/L) e 140 mL de água bidestilada
2. Remova as moscas restantes nas placas de ágar suco de uva com uma escova ou pinça e enxágue os embriões em um filtro de células com água destilada duplamente.
3. Seque o filtro de células contendo os embriões com papel de seda.
4. Coloque-o em uma placa de Petri contendo 30% de água sanitária e gire o filtro de células com a mão ou um agitador horizontal por 1,5 min a 60 rpm.
   NOTA: O enxágue é uma etapa crítica. Se o tempo de enxágue não for longo o suficiente, a casca de um embrião não sairá completamente. Se o tempo de enxágue for muito longo, fará com que o embrião fique macio e quebre facilmente. O filtro celular deve ser completamente submerso no alvejante a 30%. Use um par de luvas de borracha e um jaleco para evitar ferimentos causados por alvejante.
5. Enxágue os embriões por 2 min com água bidestilada armazenada em um frasco de lavagem de plástico de laboratório para remover o alvejante residual. Escolha os embriões flutuantes para o line-up.

7. Alinhando embriões

1. Corte o ágar suco de uva sólido em tiras longas usando uma lâmina.
   NOTA: Use suco de uva roxa para facilitar o alinhamento de embriões brancos.
2. Transfira os embriões para uma tira longa usando um pincel.
3. Alinhe cerca de 60 embriões com uma agulha de dissecação ao longo da borda de uma longa tira com seus posteriores voltados para fora da tira. Alinhe cerca de 60 embriões em 5 min.
   NOTA: A micrópila é uma saliência em forma de cone no pólo anterior do embrião, através da qual o espermatozoide entra para fertilizar o oócito (Figura 2A). Portanto, com base na protrusão em forma de cone no pólo anterior do embrião, é fácil determinar a parte posterior do embrião descorionado.
4. Coloque uma fita dupla-face de 18 mm longitudinalmente ao longo da borda de uma lamínula (18 mm x 18 mm) e remova o suporte do papel. Pressione suavemente a lamínula nos embriões alinhados. Certifique-se de que os embriões estejam colados no centro da fita.

8. Embriões dessecantes

1. Coloque a lamínula com os embriões alinhados em uma caixa contendo dessecante. O tempo de secagem varia de acordo com a temperatura e a umidade.
   NOTA: O tempo de secagem é crítico para a microinjeção e precisa ser determinado experimentalmente. O tempo de secagem é geralmente de 9 a 10 minutos no verão e de 17 a 18 minutos no inverno.
2. Cubra os embriões com óleo de halocarbono.
   NOTA: Não deixe cair muito óleo nos embriões, pois o óleo extra pode transbordar o adesivo. A proporção de volume do óleo halocarbono 700 e do óleo halocarbono 27 é de 1:3.

9. Microinjeção de embriões

1. Carregue 2 μL de DNA na agulha usando a pipeta esticada. Certifique-se de que não haja bolhas na agulha. Coloque a agulha no porta-agulha do micromanipulador.
2. Coloque os embriões alinhados cobertos com óleo de halocarbono sob um microscópio invertido. Certifique-se de que as extremidades posteriores dos embriões estejam voltadas para a agulha.
3. Use o micromanipulador para aproximar a agulha dos embriões. Limpe a agulha. Certifique-se de que uma gota de líquido saindo da agulha esteja visível. A partir de 300 hPa de pressão de injeção e 20 hPa de pressão de equilíbrio, ajuste a pressão de injeção e a pressão de equilíbrio para garantir o tamanho ideal da gota de líquido.
4. Use o micromanipulador para inserir a agulha nas extremidades posteriores dos embriões e use o pedal de controle conectado ao microinjetor para injetar o DNA (Figura 2). Se um pequeno halo for visível, o DNA é injetado com sucesso no embrião.
   NOTA: Selecione os embriões multinucleados para injeção e mate os embriões mais velhos usando o botão "limpar". Se uma grande quantidade de citoplasma vazar após a injeção, os embriões são sub-secos. Se apenas uma pequena quantidade ou nenhuma quantidade de citoplasma vazar após a injeção, as injeções são consideradas bem-sucedidas. Se mais de um terço dos embriões vazarem citoplasma após a injeção, estenda o tempo de secagem em 1-2 min. Se mais de um terço dos embriões estiverem secos demais, reduza o tempo de secagem em 1-2 min.
5. Remova a agulha do embrião. Mova a agulha para a extremidade posterior do próximo embrião. Repita as etapas acima.
6. Coloque os embriões injetados em uma placa de ágar. Coloque o prato em uma sala a 18-20 °C. No dia seguinte, transfira a placa para uma incubadora a uma temperatura de 25 °Ce umidade de 50%-60%, e incube por 1 dia.
   NOTA: Após a injeção, mantenha os embriões a uma temperatura de 18-20 ° C para retardar seu desenvolvimento, facilitar a integração do DNA do plasmídeo no genoma da Drosophila e aumentar a taxa de sobrevivência dos embriões injetados.

10. Coletando larvas

1. Use uma agulha de dissecação para raspar e soltar os alimentos em um frasco. Forneça à comida algumas gotas de água destilada.
   NOTA: Deixe a água destilada ser absorvida pelos alimentos para evitar que as larvas se afoguem.
2. Retire as placas da incubadora.
3. Recolha as larvas eclodidas com um pincel sob um microscópio estéreo e transfira-as para o frasco.
4. Coloque o frasco para injetáveis em uma incubadora a uma temperatura de 25 °Ce uma umidade de50%-60%.

11. Obtenção de moscas transgênicas

1. Recolher as moscas eclodidas depois de o frasco para injetáveis ter sido incubado a 25 °Cdurante 10 dias.
2. Cruze uma única mosca macho com três moscas fêmeas virgens dos balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ e cruze uma única mosca fêmea com três moscas machos dos balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ .
3. Coloque as cruzes em uma incubadora a uma temperatura de 25 °C e uma umidade de 50% a 60%.
4. Rastreie a progênie em busca de moscas com olhos laranja. Estas são as moscas transgênicas (Figura 3A-C).
   NOTA: As moscas com uma cópia do transgene no local de ancoragem do attP2 têm olhos laranja.
5. Cruze uma única mosca macho de olhos alaranjados com três moscas fêmeas virgens dos balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ para estabelecer um estoque.
   NOTA: Mais de uma geração de cruzamentos precisa ser configurada para riscar o transgene phiC31 no primeiro cromossomo.

Resultados

A ponta de uma agulha de injeção é chanfrada por um moedor de agulhas (Figura 1). Pode-se chanfrar 50-60 agulhas em uma hora. O DNA é microinjetado na parte posterior de um embrião no estágio pré-blastoderma ou blastoderma sincicial, onde os núcleos compartilham um citoplasma comum (Figura 2A). A parte posterior de um embrião pode ser facilmente localizada com base na micrópila na parte anterior do embrião (Figura 2A). Em...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo de microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila. Para a transgênese específica do local mediada por phiC31, injetamos 120-140 embriões para cada plasmídeo e obtivemos pelo menos uma linha transgênica para cerca de 85% dos plasmídeos (Tabela Suplementar 2). Em nossa experiência, o DNA do plasmídeo isolado por um kit de minipreparação de plasmídeo é suficiente para a transgênese em Drosophila. Concentrações de DNA de plasmídeo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745