מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

Summary

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

Abstract

טרנסגנזה בדרוזופילה היא גישה חיונית לחקר תפקוד גנים ברמת האורגניזם. מיקרו-הזרקה של עוברים היא צעד מכריע לבניית זבובים טרנסגניים. מיקרו-הזרקה דורשת סוגים מסוימים של ציוד, כולל מיקרו-מזרק, מיקרומניפולטור, מיקרוסקופ הפוך ומיקרוסקופ סטריאו. פלסמידים מבודדים עם ערכת מיני הכנה פלסמיד מוסמכים למיקרו-הזרקה. עוברים בשלב הפרה-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי, שבו גרעינים חולקים ציטופלסמה משותפת, נתונים למיקרו-הזרקה. מסננת תאים מקלה על תהליך הדה-כוריוניזציה של עוברים. הזמן האופטימלי לדכוריונציה וייבוש של עוברים צריך להיקבע באופן ניסיוני. כדי להגביר את היעילות של מיקרו-הזרקה עוברית, מחטים שהוכנו על ידי מושך צריכות להיות משופעות על ידי מטחנת מחט. בתהליך השחזת מחטים, אנו משתמשים במשאבת אוויר לרגל עם מד לחץ כדי למנוע את ההשפעה הנימית של קצה המחט. אנו מזריקים באופן שגרתי 120-140 עוברים לכל פלסמיד ומשיגים לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים. מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך integrase phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול מפורט למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה.

Introduction

זבוב הפירות Drosophila melanogaster מקובל מאוד על מניפולציה גנטית וניתוח גנטי. זבובי פירות טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. מאז שפותחה בתחילת שנות השמונים, טרנסגנזה בתיווך טרנספוזון של אלמנט P הייתה הכרחית למחקר דרוזופילה ¹. בתרחישים מסוימים, טרנספוזונים אחרים, כגון piggyBac ומינוס שימשו לטרנסגנזה גם בדרוזופילה ². טרנסגנים באמצעות טרנספוזון מוחדרים באופן אקראי לגנום דרוזופילה, ורמות הביטוי של טרנסגנים באתרים גנומיים שונים עשויות להשתנות בהתאם להשפעות המיקום ולכן לא^{ניתן להשוות 2}. חסרונות אלה התגברו על ידי טרנסגנזה ספציפית לאתר^בתיווך phiC31 3. הגן phiC31 של הבקטריופאג' מקודד אינטגראז המתווך רקומבינציה ספציפית לרצף בין אתרי attB ו-attP בדרוזופילה³. אתרי עגינה רבים של attP אופיינו וזמינים במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה 3,4,5,6,7,8,9.

מערכת הטרנסגנזה phiC31 עבור דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב על ידי קהילת הזבובים. מבין אתרי העגינה של attP, attP18 בכרומוזום X, attP40 בכרומוזום השני ו-attP2 בכרומוזום השלישי הם בדרך כלל האתרים המועדפים לשילוב טרנסגנים בכל כרומוזום מכיוון שטרנסגנים בשלושת האתרים מראים רמות גבוהות של ביטוי אינדוקטיבי בעוד רמות נמוכות של ביטוי בסיסי⁵. עם זאת, לאחרונה, ואן דר גראף ועמיתיו מצאו כי אתר attP40, קרוב למוקד הגן Msp300, וטרנסגנים המשולבים ב- attP40 גורמים להתקבצות גרעינית של שרירי הזחל בדרוזופילה¹⁰. במחקר אחר שנערך לאחרונה, דואן ועמיתיו מצאו כי כרומוזום attP40 הומוזיגוטי משבש את הארגון הגלומרולרי הנורמלי של קבוצת נוירוני קולטן הריח Or47b בדרוזופילה¹¹. ממצאים אלה מצביעים על כך שיש לכלול בקרות קפדניות בעת תכנון ניסויים ופירוש נתונים.

דרוזופילה היא אורגניזם מודל אידיאלי לחקירה in vivo של תפקוד גנים בשל מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה ותחזוקה קלה. סריקה גנטית כלל-גנומית מסתמכת על בניית ספריות טרנסגניות כלל-גנומיות בדרוזופילה 12,13,14,15. יצרנו בעבר 5551 מבני UAS-cDNA/ORF המבוססים על מערכת רצף ההפעלה הבינארי GAL4/upstream (GAL4/UAS), המכסים 83% מהגנים של דרוזופילה השמורים בבני אדם באוסף הזהב של מרכז המשאבים לגנומיקה דרוזופילה (DGRC)¹⁶. פלסמידים UAS-cDNA/ORF יכולים לשמש ליצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה. טכנולוגיית מיקרו-הזרקה יעילה של עוברים יכולה להאיץ את יצירתן של ספריות זבובים טרנסגניות.

עבור מיקרו-הזרקה עוברית, קצה המחט נשבר בדרך כלל כנגד כיסוי¹⁷. לכן, מחטים לעיתים קרובות נסתמות או גורמות לדליפה של כמויות גדולות של ציטופלסמה, וכאשר בעיות אלה מתעוררות, יש להשתמש במחטים חדשות. למרות שמחטים משופעות יכולות לשפר את יעילות המיקרו-הזרקה, תמיסת השחזה נכנסת לקצה המשופע במהלך תהליך השחזה. תמיסת השחזה בקצה המשופע אינה מתאדה במהירות באופן טבעי; לכן, מחטים לא ניתן להשתמש עבור microinjection מיד לאחר שיקוע. גורמים אלה מפחיתים את היעילות של הליכי מיקרו-הזרקה עובריים. כאן, תוך שימוש בטרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31 בדרוזופילה כדוגמה, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה. כדי למנוע מתמיסת השחזה להיכנס למחט, אנו משתמשים במשאבת אוויר כדי להפעיל לחץ אוויר בתוך המחט, ובכך למנוע מתמיסת השחזה להיכנס לקצה המשופע. מחטים משופעות מוכנות להעמסת דגימות ולמיקרו-הזרקה מיד לאחר השיקוע.

Protocol

1. הכנת פלסמידים

1. בודדו פלסמידים מתרביות חיידקים של 4 מ"ל למשך הלילה באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. Elute עם 40 μL של חיץ elution.
   הערה: בידוד פלסמידים באמצעות ערכת הכנת פלסמיד מידי אינו הכרחי. ערכת מיני הכנה פלסמיד יכולה לעמוד באופן מלא בדרישות הניסוי למיקרו-הזרקה עוברית. בפרוטוקול זה, פלסמידים מוכנים של UAS-cDNA/ORF מכילים עשרה עותקים של כטב"ם, מקדם מינימלי Hsp70, אתר attB, גן מיני לבן וגן מעניין.
2. לקבוע את ריכוז ה- DNA פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותו במקפיא -80 ° C.
   הערה: ריכוז פלסמיד אינו קריטי למיקרו-הזרקה מוצלחת של עוברים, מכיוון שריכוזי פלסמיד הנעים בין 20 ננוגרם/מיקרוליטר ל-1683 ננוגרם/מיקרוליטר פועלים היטב עבור טרנסגנזה בדרוזופילה (טבלה משלימה 1).
3. ממש לפני מיקרו-הזרקה, הפשירו פלסמידים וצנטריפוגות ב 13000 x גרם במשך 5 דקות.
4. מעבירים 10 μL מכל פלסמיד מהשכבה העליונה של הנוזל לצינור חדש של 1.5 מ"ל.

2. משיכת מחטים

1. הפעל מושך מחטים עם הגדרות נבחרות (חום: 500, משיכה: 50, Vel: 60, עיכוב: 90, לחץ: 200, מבחן רמפה: 510).
2. הכנס נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.75 מ"מ, אורך 10 ס"מ) למושך המחט וסגור את המכסה.
3. לחץ על לחצן משיכה . כל נימי זכוכית מייצרים שתי מחטים.

3. טחינת מחטים (איור 1)

1. השתמש במטחנת מחטים המורכבת עם פלטת שחיקה מתאימה (עבור גדלים של 0.7-2.0 מיקרומטר קצה) של מטחנת מחט.
2. להרטיב את הבד (חוט ייחוס) עם תמיסת השחזה (100 מ"ל של מים מזוקקים עם 0.9 גרם של NaCl, 1 מ"ל של חומר הרטבה) ולתקן את המטלית.
3. הפעל את מטחנת המחטים ושמור על צלחת השחזה מסתובבת.
4. חבר מחט למשאבת אוויר ברגל עם מד לחץ באמצעות צינור סיליקון נימי, ולאחר מכן הרכיב את המחט על מחזיק מחט של מטחנת המחט. התאימו את זווית המחט ביחס לצלחת השחזה ל-35° (איור 1A, B).
5. התאימו את מיקום קצה המחט ממש מעל משטח צלחת השחזה באמצעות ידית בקרה גסה מתחת למיקרוסקופ (איור 1C).
   הערה: המחטים שנמשכו במקטע 2 הן בעלות חידוד של 6-8 מ"מ וקצה של פחות ממיקרומטר אחד (איור 1D), כפי שמתואר במדריך למשתמש של המושך.
6. שמור על הלחץ הפנימי של המחט על 40 psi באמצעות משאבת האוויר ברגל. התאימו את מיקום קצה המחט באמצעות ידית בקרה עדינה מתחת למיקרוסקופ, וגרמו לקצה המחט לגעת בצלחת השחזה.
7. טוחנים במשך 3-5 שניות. כאשר בועות אוויר זעירות יוצאות מקצה המחט, פרקו את המחט (איור 1E).
   הערה: בתהליך השחזה, שימוש במשאבת אוויר מונע את ניפוי תמיסת הטחינה.
8. הכניסו את מחטי הקרקע למארז אחסון.
   הערה: השתמש במחטים טחונות טריות ככל האפשר, אם כי ניתן לשמור את המחטים הטחונות במארז אחסון לפחות מספר שבועות לפני המיקרו-הזרקה.

4. הכנת פיפטות להעמסת פלסמידים

1. מחממים פיפטה של 200 μL עם הלהבה החיצונית של מבער אלכוהול.
2. ברגע שהוא מתחיל להמיס, למתוח את פיפטה.
3. חותכים את הקצה האטום של פיפטה מתוחה עם מספריים, ואת פיפטה מתוח אז מוכן לטעון DNA לתוך מחט הקרקע.
   הערה: לחלופין, טיפים ארוכים ועדינים במיוחד למילוי מחטים טחונות זמינים מסחרית.
4. מניחים פיפטות אלה בקופסת פלסטיק autoclaved.

5. איסוף עוברים

1. אספו זבובים (vas-phiC31; +; attP2) המבטאים אינטגראז phiC31 ונושאים את אתר העגינה attP2 3 ימים לאחר בקיעתם מ-50 בקבוקונים והעבירו אותם לכלוב (φ 90 מ"מ x 150 מ"מ). מוסיפים מעט ממרח שמרים טריים למרכז כל צלחת אגר ענבים¹⁸.
2. הכינו 2-4 כלובים של זבובים. שמור את הכלובים והצלחות ב 25 ° C ולשנות את הצלחות כל יום במשך 2-4 ימים.
   הערה: מחקר זה שילב את הטרנסגן vas-phiC31 (סטוק # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) על הכרומוזום הראשון ואת טרנסגן attP2 (סטוק # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) על הכרומוזום השלישי. המלאי המתקבל (vas-phiC31; + ; attP2) משמש בפרוטוקול זה. יש להכין משחת שמרים מדי יום, ויש להאכיל את משחת השמרים הטריים לזבובים. יש לנקות ולייבש את הכלובים המוחלפים כדי להיפטר מהעוברים הנותרים בכלובים.
3. ביום המיקרו-הזרקה, החליפו את הכלובים והצלחות בבוקר. לאחר מכן, החליפו את הצלחות כל 30 דקות ואספו עוברים מצלחות אלה. החליפו את כל הכלובים והצלחות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן שמרו על הכלובים והצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
   הערה: פרוטוקולים מסוימים מעדיפים לדגור על הכלובים והצלחות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס להטלת ביצים. זה תלוי במספר העוברים שצריך למיקרו-הזרקה.

6. עוברים dechorionating

1. מכינים 30% אקונומיקה על ידי ערבוב 60 מ"ל אקונומיקה (המכילה תכולת כלור פעילה של 34-46 גרם/ליטר) ו-140 מ"ל מים מזוקקים כפול.
2. מוציאים את הזבובים הנותרים על צלחות אגר מיץ ענבים עם מברשת או מלקחיים, ושוטפים עוברים לתוך מסננת תאים עם מים מזוקקים כפול.
3. יבש את מסננת התאים המכילה את העוברים עם נייר טישו.
4. מניחים אותו בכלי פטרי המכיל 30% אקונומיקה, ומערבלים את מסננת התא ביד או בשייקר אופקי למשך דקה וחצי ב-60 סל"ד.
   הערה: שטיפה היא שלב קריטי. אם זמן השטיפה אינו ארוך מספיק, הקליפה של עובר לא תרד לחלוטין. אם זמן השטיפה ארוך מדי, זה יגרום לעובר להיות רך ולהישבר בקלות. מסננת התאים צריכה להיות שקועה לחלוטין באקונומיקה של 30%. לבשו זוג כפפות גומי ומעיל מעבדה כדי למנוע פציעות הנגרמות מאקונומיקה.
5. יש לשטוף עוברים במשך 2 דקות במים מזוקקים כפולים המאוחסנים בבקבוק שטיפה מפלסטיק במעבדה כדי להסיר את שאריות האקונומיקה. בחר את העוברים הצפים להרכב.

7. סידור עוברים בשורה

1. חותכים את אגר מיץ הענבים המוצקים לרצועות ארוכות בעזרת להב.
   הערה: השתמשו במיץ ענבים סגול כדי להקל על סידור עוברים לבנים.
2. מעבירים את העוברים לרצועה ארוכה בעזרת מברשת.
3. סדרו כ-60 עוברים בשורה עם מחט חותכת לאורך קצה רצועה ארוכה כאשר אחוריהם פונים לחלק החיצוני של הרצועה. העמידו בשורה כ-60 עוברים תוך 5 דקות.
   הערה: המיקרופייל הוא בליטה בצורת חרוט בקוטב הקדמי של העובר, שדרכה הזרע נכנס כדי להפרות את הביצית (איור 2A). לכן, בהתבסס על בליטה בצורת חרוט בקוטב הקדמי של העובר, קל לקבוע את החלק האחורי של העובר dechorionated.
4. הניחו סרט דו-צדדי בקוטר 18 מ"מ לאורכו לאורך קצה הכיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ) והסר את גב הנייר. לחץ בעדינות על המכסה על העוברים המיושרים. ודא שהעוברים מודבקים למרכז סרט הדבק.

8. ייבוש עוברים

1. הניחו את תלוש הכיסוי עם העוברים המרופדים בקופסה המכילה חומר ייבוש. זמן הייבוש משתנה בהתאם לטמפרטורה וללחות.
   הערה: זמן הייבוש הוא קריטי עבור מיקרו-הזרקה ויש לקבוע אותו באופן ניסיוני. זמן הייבוש הוא בדרך כלל 9-10 דקות בקיץ ו 17-18 דקות בחורף.
2. מכסים את העוברים בשמן הלוקרבון.
   הערה: אין להפיל יותר מדי שמן על העוברים, שכן השמן הנוסף עלול לעלות על גדותיו של הדבק. יחס הנפח של שמן halocarbon 700 ושמן halocarbon 27 הוא 1: 3.

9. מיקרוהזרקת עוברים

1. טען 2 μL של DNA לתוך המחט באמצעות פיפטה מתוחה. ודא שאין בועות במחט. הכנס את המחט למחזיק המחט של המיקרומניפולטור.
2. הניחו את העוברים המיושרים מכוסים בשמן הלוקרבון תחת מיקרוסקופ הפוך. ודא כי הקצוות האחוריים של העוברים פונים אל המחט.
3. השתמש במיקרומניפולטור כדי לקרב את המחט לעוברים. נקה את המחט. ודא כי טיפת נוזל יוצא מהמחט גלוי. החל מלחץ הזרקה של 300 hPa ולחץ שיווי משקל של 20 hPa, התאם את לחץ ההזרקה ולחץ שיווי המשקל כדי להבטיח את הגודל האופטימלי של טיפת הנוזל.
4. השתמשו במיקרומניפולטור כדי להחדיר את המחט לקצוות האחוריים של העוברים, והשתמשו בבקרת כף הרגל שמחוברת למיקרו-מזרק כדי להזריק את הדנ"א (איור 2). אם נראית הילה קטנה, הדנ"א מוזרק בהצלחה לעובר.
   הערה: בחר את העוברים הרב-גרעיניים להזרקה והרוג את העוברים המבוגרים יותר באמצעות כפתור "נקי". אם כמות גדולה של ציטופלסמה דולפת לאחר ההזרקה, העוברים מיובשים בחסר. אם רק כמות קטנה של ציטופלסמה דולפת או ללא כמות דולפת לאחר ההזרקה, זריקות נחשבות מוצלחות. אם יותר משליש מהעוברים דולפים ציטופלסמה לאחר ההזרקה, האריכו את זמן הייבוש ב-1-2 דקות. אם יותר משליש מהעוברים מיובשים יתר על המידה, קצרו את זמן הייבוש ב-1-2 דקות.
5. הסר את המחט מהעובר. הזיזו את המחט לקצה האחורי של העובר הבא. חזור על השלבים לעיל.
6. הכניסו את העוברים המוזרקים לצלחת אגר. מניחים את הצלחת בחדר ב 18-20 מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוסולחות של 50%-60%, ולדגור במשך יום אחד.
   הערה: לאחר ההזרקה, לשמור על עוברים בטמפרטורה של 18-20 מעלות צלזיוס כדי להאט את התפתחותם, להקל על שילוב DNA פלסמיד לתוך גנום דרוזופילה , ולהגדיל את שיעור ההישרדות של העוברים המוזרקים.

10. איסוף זחלים

1. השתמש במחט ניתוח כדי לגרד ולשחרר את המזון בבקבוקון. ספקו למזון כמה טיפות מים מזוקקים.
   הערה: יש לאפשר למים המזוקקים להיספג לתוך המזון כדי למנוע מהזחלים לטבוע.
2. מוציאים את הצלחות מהאינקובטור.
3. אספו את הזחלים שבקעו בעזרת מברשת צבע תחת מיקרוסקופ סטריאו והעבירו אותם לבקבוקון.
4. הכניסו את הבקבוקון לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוסולחות של50%-60%.

11. השגת זבובים טרנסגניים

1. לאסוף את הזבובים בקעו לאחר בקבוקון הוא דגירה ב 25 ° Cבמשך 10 ימים.
2. חצו זבוב זכר יחיד לשלוש נקבות זבובים בתוליות של מאזני TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ , וחצו זבוב נקבה אחת לשלושה זבובים זכרים של מאזני TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ .
3. מניחים את הצלבים באינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%.
4. סנן את הצאצאים לזבובים עם עיניים כתומות. אלה הם הזבובים הטרנסגניים (איור 3A-C).
   הערה: לזבובים הנושאים עותק של טרנסגן באתר העגינה attP2 יש עיניים כתומות.
5. חצו זבוב זכר כתום עיניים יחיד לשלוש נקבות זבובים בתוליות של מאזני TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ כדי לבסס מלאי.
   הערה: יש להגדיר יותר מדור אחד של צלבים על מנת לחצות את טרנסגן phiC31 על הכרומוזום הראשון.

תוצאות

קצה של מחט הזרקה משופע על-ידי מטחנת מחטים (איור 1). אפשר לשקוע 50-60 מחטים בשעה אחת. דנ"א מוזרק במיקרו לחלק האחורי של עובר בשלב הקדם-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי, שבו גרעינים חולקים ציטופלסמה משותפת (איור 2A). החלק האחורי של עובר יכול להיות ממוקם בקלות בהתבסס...

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה. עבור טרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31, הזרקנו 120-140 עוברים לכל פלסמיד וקיבלנו לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים (טבלה משלימה 2). מניסיוננו, DNA פלסמיד שבודד על ידי ערכת הכנה פלסמיד מספיק לטרנסגנזה בדר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745