초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

요약

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초록

초파리의 형질전환은 유기체 수준에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적인 접근 방식입니다. 배아 미세주입은 형질전환 파리의 구축을 위한 중요한 단계입니다. 미세주입에는 미세주입기, 미세조작기, 도립 현미경 및 실체 현미경을 포함한 몇 가지 유형의 장비가 필요합니다. plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid는 microinjection에 적합합니다. 핵이 공통 세포질을 공유하는 pre-blastoderm 또는 syncytial blastoderm 단계의 배아는 미세 주입을 받습니다. 세포 여과기는 배아의 탈코리오화 과정을 용이하게 합니다. 배아의 탈응모 및 건조를 위한 최적의 시간은 실험적으로 결정해야 합니다. 배아 미세주입의 효율성을 높이려면 풀러로 준비한 바늘을 니들 그라인더로 경사지게 해야 합니다. 바늘을 가는 과정에서 바늘 끝의 모세관 효과를 피하기 위해 압력 게이지가 있는 발 공기 펌프를 사용합니다. 우리는 일상적으로 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 적어도 하나의 형질전환 라인을 얻습니다. 이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

서문

초파리 Drosophila melanogaster는 유전자 조작 및 유전자 분석에 매우 적합합니다. 형질전환 초파리는 생물학 연구에 널리 사용됩니다. 1980년대 초에 개발된 이래로 P-element transposon-mediated transgenesis는 초파리 연구에 없어서는 안 될 필수 요소였습니다¹. 일부 시나리오에서는 piggyBac 및 Minos와 같은 다른 transposon이 Drosophila의 transgenesis에 사용되기도 했습니다². 트랜스포존을 통한 전이유전자는 초파리 게놈에 무작위로 삽입되며, 위치 효과에 따라 다른 유전체 자리에서 전이유전자의 발현 수준이 달라질 수 있으므로 비교할 수 없다². 이러한 단점은 phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)에 의해 극복되었다³. 박테리오파지 phiC31 유전자는 Drosophila³의 attB와 attP 부위 사이의 염기서열 특이적 재조합을 매개하는 인테그라제를 암호화합니다. 많은 attP 도킹 사이트가 특성화되어 Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9에서 사용할 수 있습니다.

초파리에 대한 phiC31 형질전환 시스템은 파리 커뮤니티에서 널리 사용되었습니다. attP 도킹 부위 중에서, X 염색체의 attP18, 두 번째 염색체의 attP40, 세 번째 염색체의 attP2는 일반적으로 각 염색체의 전이유전자 통합에 선호되는 부위인데, 그 이유는 세 부위의 전이유전자가 낮은 수준의 기저 발현을 보이면서 유도 가능한 발현 수준이 높기 때문이다⁵. 그러나 최근에 van der Graaf와 동료들은 Msp300 유전자 자리에 가까운 attP40 부위와 attP40에 통합된 전이유전자가 Drosophila¹⁰에서 유충 근육 핵 클러스터링을 유발한다는 것을 발견했습니다. 또 다른 최근 연구에서 Duan과 동료들은 동형접합 attP40 염색체가 Drosophila¹¹에서 Or47b 후각 수용체 뉴런 클래스의 정상적인 사구체 조직을 방해한다는 것을 발견했습니다. 이러한 결과는 실험을 설계하고 데이터를 해석할 때 엄격한 통제가 포함되어야 함을 시사합니다.

Drosophila는 짧은 수명주기, 저렴한 비용 및 쉬운 유지 보수로 인해 유전자 기능의 생체 내 조사에 이상적인 모델 유기체입니다. 게놈 전체 유전자 스크리닝은 Drosophila ^12,13,14,15의 게놈 전체 형질전환 라이브러리의 구축에 의존합니다. 당사는 이전에 이진 GAL4/업스트림 활성화 서열(GAL4/UAS) 시스템을 기반으로 5551개의 UAS-cDNA/ORF 구조를 생성했으며, 이는 DGRC(Drosophila Genomics Resource Center) Gold Collection¹⁶에서 인간에서 보존된 초파리 유전자의 83%를 포괄합니다. UAS-cDNA/ORF 플라스미드는 초파리에서 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 효율적인 배아 미세주입 기술은 형질전환 파리 라이브러리의 생성을 가속화할 수 있습니다.

배아 미세주입의 경우, 바늘 끝은 일반적으로 커버슬립(^coverslip)17에 부러진다. 이로 인해 바늘이 막히거나 많은 양의 세포질이 누출되는 경우가 많으며, 이러한 문제가 발생하면 새로운 바늘을 사용해야 합니다. 베벨링 니들은 미세 사출 효율을 향상시킬 수 있지만 연삭 용액은 연삭 공정 중에 베벨 팁으로 들어갑니다. 비스듬한 팁의 분쇄 용액은 자연적으로 빠르게 증발하지 않습니다. 따라서 베벨 링 직후 바늘을 미세 주입에 사용할 수 없습니다. 이러한 요인들은 배아 미세주입 절차의 효율성을 감소시킵니다. 여기에서는 Drosophila 의 phiC31 매개 부위 특이적 transgenesis를 예로 들어 Drosophila의 transgenesis를 위한 배아 미세주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 연삭 용액이 바늘에 들어가는 것을 방지하기 위해 공기 펌프를 사용하여 바늘 내부에 공기 압력을 가하여 연삭 용액이 비스듬한 팁으로 들어가는 것을 방지합니다. 베벨 니들은 베벨링 직후 시료 로딩 및 미세 주입이 가능합니다.

프로토콜

1. 플라스미드의 제조

1. plasmid miniprep kit를 사용하여 하룻밤 동안 배양한 4mL의 박테리아에서 플라스미드를 분리합니다. 40 μL의 용리 버퍼로 용리합니다.
   NOTE: plasmid midi-prep kit를 사용하여 plasmid를 분리할 필요는 없습니다. plasmid miniprep kit는 배아 미세주입에 대한 실험 요구 사항을 완전히 충족할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 제조된 UAS-cDNA/ORF 플라스미드는 UAS의 10개 카피, Hsp70 최소 프로모터, attB site, mini-white 유전자 및 관심 유전자를 포함합니다.
2. 분광광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 측정하고 -80 °C 냉동고에 보관합니다.
   참고: 20 ng/μL - 1683 ng/μL 범위의 플라스미드 농도가 초파리 의 형질전환(transgenesis)에 효과적이기 때문에 플라스미드 농도는 성공적인 배아 미세주입에 중요하지 않습니다(보충 표 1).
3. 미세주입 직전에 플라스미드와 원심분리기를 13000 x g 에서 5분 동안 해동합니다.
4. 액체의 상부 층에서 각 플라스미드 10 μL를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

2. 바늘 당기기

1. 선택한 설정(열: 500, 당기기: 50, 벨: 60, 지연: 90, 압력: 200, 램프 테스트: 510)으로 바늘 풀러를 켭니다.
2. 붕규산 유리 모세관(외경 1.0mm, 내경 0.75mm, 길이 10cm)을 바늘 풀러에 삽입하고 뚜껑을 닫습니다.
3. 당김 버튼을 누릅니다. 각 유리 모세관은 두 개의 바늘을 만듭니다.

3. 연삭 바늘(그림 1)

1. 니들 그라인더의 적절한 연마판(팁 크기 0.7-2.0μm)이 장착된 니들 그라인더를 사용하십시오.
2. 천(기준선)을 연삭액(증류수 100mL, NaCl 0.9g, 습윤제 1mL)으로 적시고 천을 고정합니다.
3. 니들 그라인더를 켜고 그라인딩 플레이트가 회전하도록 합니다.
4. 실리콘 모세관을 통해 압력계가 있는 풋 에어 펌프에 바늘을 연결한 다음 바늘을 바늘 그라인더의 바늘 홀더에 장착합니다. 연삭 플레이트에 대한 바늘의 각도를 35°로 조정합니다(그림 1A, B).
5. 현미경 아래의 거친 제어 손잡이를 사용하여 연삭 플레이트 표면 바로 위에 있는 바늘 끝의 위치를 조정합니다(그림 1C).
   알림: 섹션 2에서 얻은 뽑은 바늘에는 풀러의 사용 설명서에 설명된 대로 6-8mm 테이퍼와 1μm 미만의 팁이 있습니다(그림 1D).
6. 풋 에어 펌프를 사용하여 바늘의 내부 압력을 40psi로 유지합니다. 현미경 아래의 미세한 조절 손잡이를 사용하여 바늘 끝의 위치를 조정하고 바늘 끝이 연삭판에 닿도록 합니다.
7. 3-5초 동안 갈아줍니다. 바늘 끝에서 작은 기포가 나오면 바늘을 빼냅니다(그림 1E).
   알림: 연삭 과정에서 공기 펌프를 사용하면 분쇄 용액이 사이펀되는 것을 방지할 수 있습니다.
8. 연마 바늘을 보관 케이스에 넣으십시오.
   알림: 갓 갈은 바늘을 가능한 한 많이 사용하되, 분쇄된 바늘은 미세 주입 전에 최소 몇 주 동안 보관 케이스에 보관할 수 있습니다.

4. plasmid를 로딩하기 위한 피펫 준비

1. 알코올 버너의 외부 불꽃으로 200μL 피펫을 가열합니다.
2. 녹기 시작하면 피펫을 늘립니다.
3. 늘어난 피펫의 밀봉된 끝을 가위로 자르면 늘어난 피펫이 DNA를 분쇄된 바늘에 넣을 준비가 됩니다.
   알림: 또는 그라운드 니들을 채우기 위한 매우 길고 미세한 팁이 시판되고 있습니다.
4. 이 피펫을 고압멸균된 플라스틱 상자에 넣습니다.

5. 배아 채취

1. 50개의 바이알에서 부화한 후 3일 후에 phiC31 integrase를 발현하고 attP2 도킹 부위를 지니는 파리(vas-phiC31; + ; attP2)를 수집하여 케이지(φ 90mm x 150mm)로 옮깁니다. 각 포도 한천 접시¹⁸의 중앙에 약간의 신선한 이스트 페이스트를 추가합니다.
2. 2-4 개의 파리 케이지를 준비하십시오. 케이지와 플레이트를 25°C로 유지하고 2-4일 동안 매일 플레이트를 교체합니다.
   참고: 이 연구는 첫 번째 염색체에 vas-phiC31 전이 유전자(Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center)와 세 번째 염색체에 attP2 전이 유전자(Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center)를 결합했습니다. 결과 스톡(vas-phiC31; + ; attP2)이 이 프로토콜에 사용됩니다. 이스트 페이스트는 매일 준비해야 하며 신선한 이스트 페이스트를 파리에게 먹여야 합니다. 교체된 케이지는 케이지에 남아 있는 배아를 제거하기 위해 청소하고 건조시켜야 합니다.
3. 미세주입 당일에는 아침에 케이지와 플레이트를 교체합니다. 그런 다음 30분마다 플레이트를 교체하고 이 플레이트에서 배아를 수집합니다. 모든 케이지와 플레이트를 실온(RT)에서 교체한 후 케이지와 플레이트를 25°C로 유지합니다.
   참고: 일부 프로토콜은 알을 낳기 위해 케이지와 플레이트를 18°C에서 배양하는 것을 선호합니다. 미세주입에 필요한 배아의 수에 따라 다릅니다.

6. 탈코리오네이션 배아

1. 30mL의 표백제(34-46g/L의 활성 염소 함량 포함)와 30mL의 이중 증류수를 혼합하여 46% 표백제를 준비합니다.
2. 브러시나 집게로 포도 주스 한천 판에 남아 있는 파리를 제거하고 배아를 이중 증류수로 세포 여과기에 헹굽니다.
3. 배아가 들어있는 세포 여과기를 티슈 페이퍼로 건조시킵니다.
4. 30% 표백제가 포함된 페트리 접시에 넣고 셀 여과기를 손으로 또는 수평 셰이커로 1.5rpm에서 60분 동안 휘젓습니다.
   참고: 헹굼은 중요한 단계입니다. 헹굼 시간이 충분히 길지 않으면 배아의 껍질이 완전히 벗겨지지 않습니다. 헹굼 시간이 너무 길면 배아가 부드러워지고 쉽게 부서집니다. 세포 여과기는 30% 표백제에 완전히 담가야 합니다. 표백제로 인한 부상을 방지하기 위해 고무 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오.
5. 실험실 플라스틱 세척 병에 저장된 이중 증류수로 배아를 2분 동안 헹구어 잔류 표백제를 제거합니다. 라인업을 위해 떠 있는 배아를 선택합니다.

7. 배아 정렬하기

1. 단단한 포도 주스 한천을 칼날을 사용하여 긴 스트립으로 자릅니다.
   알림: 흰색 배아를 더 쉽게 정렬할 수 있도록 보라색 포도 주스를 사용하십시오.
2. 페인트브러시를 사용하여 배아를 긴 스트립에 옮깁니다.
3. 약 60개의 배아를 긴 스트립의 가장자리를 따라 해부 바늘로 정렬하고 뒤쪽이 스트립의 바깥쪽을 향하도록 합니다. 5분 이내에 약 60개의 배아를 정렬합니다.
   참고: 마이크로파일(micropyle)은 배아의 전극에 있는 원뿔 모양의 돌출부로, 정자가 난모세포를 수정시키기 위해 들어가는 곳입니다(그림 2A). 따라서, 배아의 전극에 있는 원뿔 모양의 돌출부에 기초하여, 탈융모화된 배아의 후방을 쉽게 결정할 수 있다.
4. 커버슬립(18mm x 18mm)의 가장자리를 따라 18mm 양면 테이프를 세로로 붙이고 뒷면을 제거합니다. 커버슬립을 정렬된 배아에 부드럽게 누릅니다. 배아가 테이프 중앙에 붙어 있는지 확인합니다.

8. 배아 건조

1. 일렬로 늘어선 배아와 함께 커버슬립을 건조제가 들어 있는 상자에 넣습니다. 건조 시간은 온도와 습도에 따라 다릅니다.
   참고: 건조 시간은 미세 주입에 매우 중요하며 실험적으로 결정해야 합니다. 건조 시간은 일반적으로 여름에는 9-10분, 겨울에는 17-18분입니다.
2. 배아를 할로카본 오일로 덮습니다.
   알림: 여분의 기름이 접착제를 넘칠 수 있으므로 배아에 너무 많은 기름을 떨어뜨리지 마십시오. 할로카본 오일 700과 할로카본 오일 27의 부피 비율은 1:3입니다.

9. 배아 미세주입

1. 늘어난 피펫을 사용하여 2μL의 DNA를 바늘에 로드합니다. 바늘에 기포가 없는지 확인하십시오. 마이크로 매니퓰레이터의 바늘 홀더에 바늘을 넣습니다.
2. 할로카본 오일로 덮인 정렬된 배아를 도립 현미경 아래에 놓습니다. 배아의 뒤쪽 끝이 바늘을 향하도록 합니다.
3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 배아에 가깝게 가져옵니다. 바늘을 비우십시오. 바늘에서 나오는 액체 한 방울이 보이는지 확인하십시오. 300hPa 사출 압력과 20hPa 평형 압력에서 시작하여 주입 압력과 평형 압력을 조정하여 액체 방울의 최적 크기를 보장합니다.
4. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 배아의 뒤쪽 끝에 삽입하고 마이크로 인젝터에 연결된 풋 컨트롤을 사용하여 DNA를 주입합니다(그림 2). 작은 후광이 보이면 DNA가 배아에 성공적으로 주입된 것입니다.
   참고: 주입할 다핵 배아를 선택하고 "clean" 버튼을 사용하여 더 오래된 배아를 죽입니다. 주입 후 많은 양의 세포질이 누출되면 배아는 건조되지 않습니다. 주입 후 세포질이 소량 누출되거나 전혀 누출되지 않으면 주입이 성공한 것으로 간주됩니다. 주입 후 배아의 1/3 이상에서 세포질이 누출되면 건조 시간을 1-2분 연장합니다. 배아의 1/3 이상이 과도하게 건조된 경우 건조 시간을 1-2분 단축합니다.
5. 배아에서 바늘을 제거합니다. 바늘을 다음 배아의 뒤쪽 끝으로 이동합니다. 위의 단계를 반복합니다.
6. 주입된 배아를 한천 접시에 넣습니다. 18-20 °C의 방에 플레이트를 놓습니다. 다음날 플레이트를 온도 25°C, 습도 50%-60%의 인큐베이터로 옮기고 1일 동안 배양합니다.
   참고: 주입 후에는 배아를 18-20 °C의 온도로 유지하여 배아의 발달을 늦추고, 플라스미드 DNA를 초파리 게놈에 통합하는 것을 용이하게 하며, 주입된 배아의 생존율을 높이십시오.

10. 유충 채취

1. 해부 바늘을 사용하여 바이알의 음식을 긁어내고 풉니다. 식품에 증류수 몇 방울을 공급하십시오.
   알림: 유충이 익사하는 것을 방지하기 위해 증류수가 음식에 흡수되도록 하십시오.
2. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.
3. 실체 현미경 아래에서 붓으로 부화한 유충을 모아 바이알로 옮깁니다.
4. 바이알을 25°C의 온도와 50%-60%의습도에서 인큐베이터에 넣습니다.

11. 유전자 변형 파리 얻기

1. 바이알을 25°C에서 10일 동안 배양한 후 부화한 파리를 수집합니다.
2. TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 밸런서의 처녀 암컷 파리 3마리와 수컷 파리 한 마리를 교배하고, TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 밸런서의 수컷 파리 3마리와 한 마리의 암컷 파리를 교배합니다.
3. 십자가를 25 °C의 온도와 50%-60%의 습도에서 인큐베이터에 넣습니다.
4. 주황색 눈을 가진 파리가 있는지 자손을 선별하십시오. 이들은 형질전환 파리입니다(그림 3A-C).
   참고: attP2 도킹 사이트에서 전이유전자 사본을 가진 파리는 주황색 눈을 가지고 있습니다.
5. 주황색 눈의 수컷 파리 한 마리를 TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ 밸런서의 처녀 암컷 파리 3마리와 교배하여 스톡을 설정합니다.
   참고: 첫 번째 염색체에서 phiC31 전이유전자를 제거하기 위해서는 한 세대 이상의 교배를 설정해야 합니다.

결과

주사 바늘의 끝은 니들 그라인더에 의해 비스듬히 깎여 있습니다(그림 1). 한 시간에 50-60개의 바늘을 베벨 할 수 있습니다. DNA는 핵이 공통 세포질을 공유하는 배배엽 전(pre-blastoderm) 또는 세포융합 배배엽(syncytial blastoderm) 단계에서 배아의 후방에 미세주입됩니다(그림 2A). 배아의 후방은 배아의 전방에 있는 마이크로파일(micropyle)을 기반으로 쉽게 위치?...

토론

여기에서는 Drosophila의 transgenesis를 위한 배아 미세주입에 대한 프로토콜을 제시합니다. phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)의 경우, 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 하나 이상의 형질전환 라인(transgenic line)을 수득하였다(보충 표 2). 우리의 경험에 따르면, plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid DNA는 Drosophila의 transg...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745