초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

요약

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초록

초파리의 형질전환은 유기체 수준에서 유전자 기능을 연구하는 데 필수적인 접근 방식입니다. 배아 미세주입은 형질전환 파리의 구축을 위한 중요한 단계입니다. 미세주입에는 미세주입기, 미세조작기, 도립 현미경 및 실체 현미경을 포함한 몇 가지 유형의 장비가 필요합니다. plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid는 microinjection에 적합합니다. 핵이 공통 세포질을 공유하는 pre-blastoderm 또는 syncytial blastoderm 단계의 배아는 미세 주입을 받습니다. 세포 여과기는 배아의 탈코리오화 과정을 용이하게 합니다. 배아의 탈응모 및 건조를 위한 최적의 시간은 실험적으로 결정해야 합니다. 배아 미세주입의 효율성을 높이려면 풀러로 준비한 바늘을 니들 그라인더로 경사지게 해야 합니다. 바늘을 가는 과정에서 바늘 끝의 모세관 효과를 피하기 위해 압력 게이지가 있는 발 공기 펌프를 사용합니다. 우리는 일상적으로 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 적어도 하나의 형질전환 라인을 얻습니다. 이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

서문

초파리 Drosophila melanogaster는 유전자 조작 및 유전자 분석에 매우 적합합니다. 형질전환 초파리는 생물학 연구에 널리 사용됩니다. 1980년대 초에 개발된 이래로 P-element transposon-mediated transgenesis는 초파리 연구에 없어서는 안 될 필수 요소였습니다¹. 일부 시나리오에서는 piggyBac 및 Minos와 같은 다른 transposon이 Drosophila의 transgenesis에 사용되기도 했습니다². 트랜스포존을 통한 전이유전자는 초파리 게놈에 무작위로 삽입되며, 위치 효과에 따라 다른 유전체 자리에서 전이유전자의 발현 수준이 달라질 수 있으므로 비교할 수 없다². 이러한 단점은 phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)에 의해 극복되었다³. 박테리오파지 phiC31 유전자는 Drosophila³의 attB와 attP 부위 사이의 염기서열 특이적 재조합을 매개하는 인테그라제를 암호화합니다. 많은....

프로토콜

1. 플라스미드의 제조

1. plasmid miniprep kit를 사용하여 하룻밤 동안 배양한 4mL의 박테리아에서 플라스미드를 분리합니다. 40 μL의 용리 버퍼로 용리합니다.
   NOTE: plasmid midi-prep kit를 사용하여 plasmid를 분리할 필요는 없습니다. plasmid miniprep kit는 배아 미세주입에 대한 실험 요구 사항을 완전히 충족할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 제조된 UAS-cDNA/ORF 플라스미드는 UAS의 10개 카피, Hsp70 최소 프로모터, attB site, mini-white 유전자 및 관심 유전자를 포함합니다.
2. 분광광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 측정하고 -80 °C 냉동고에 보관합니다.
   참고: 20 ng/μL - 1683 ng/μL 범위의 플라스미드 농도가 초파리 의 형질전환(transgenesis)에 효과적이기 때문에 플라스미드 농도는 성공적인 배아 미세주입에 중요하지 않습니다(보충 표 1).
3. 미세주입 직전에 플라스미드와 원심분리기를 13000 x g 에서 5분 동안 해동합니다.
4. 액체의 상부 층에서 각 플라스미드 10 μL를 새로운 1.5 mL 튜브로 ....

토론

여기에서는 Drosophila의 transgenesis를 위한 배아 미세주입에 대한 프로토콜을 제시합니다. phiC31 매개 부위 특이적 형질전환(site-specific transgenesis)의 경우, 각 플라스미드에 대해 120-140개의 배아를 주입하고 플라스미드의 약 85%에 대해 하나 이상의 형질전환 라인(transgenic line)을 수득하였다(보충 표 2). 우리의 경험에 따르면, plasmid miniprep kit로 분리한 plasmid DNA는 Drosophila의 transg.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745