Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Riepilogo

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Abstract

La transgenesi in Drosophila è un approccio essenziale per studiare la funzione genica a livello dell'organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. La microiniezione richiede alcuni tipi di apparecchiature, tra cui un microiniettore, un micromanipolatore, un microscopio invertito e uno stereomicroscopio. I plasmidi isolati con un kit di miniprep plasmidico sono qualificati per la microiniezione. Gli embrioni allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, in cui i nuclei condividono un citoplasma comune, vengono sottoposti a microiniezione. Un colino cellulare facilita il processo di dechorionizzazione degli embrioni. Il momento ottimale per la decorionazione e l'essiccazione degli embrioni deve essere determinato sperimentalmente. Per aumentare l'efficienza della microiniezione di embrioni, gli aghi preparati da un estrattore devono essere smussati da una smerigliatrice ad aghi. Nel processo di rettifica degli aghi, utilizziamo una pompa dell'aria a pedale con un manometro per evitare l'effetto capillare della punta dell'ago. Iniettiamo abitualmente 120-140 embrioni per ogni plasmide e otteniamo almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi. Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.

Introduzione

Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è estremamente suscettibile di manipolazione genetica e analisi genetica. I moscerini della frutta transgenici sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Da quando è stata sviluppata nei primi anni '80, la transgenesi mediata da trasposoni di elementi P è stata indispensabile per la^{ricerca sulla} Drosophila. In alcuni scenari, altri trasposoni, come piggyBac e Minos sono stati utilizzati per la transgenesi in Drosophila ². I transgeni tramite trasposone vengono inseriti casualmente nel genoma di Drosophila e i livelli di espressione dei transgeni in diversi loci genomici possono variare a causa degli effetti di posizione e quindi non possono essere confrontati². Questi inconvenienti sono stati superati dalla transgenesi sito-specifica 3 mediata da phiC31^. Il gene del batteriofago phiC31 codifica per un'integrasi che media la ricombinazione sequenza-specifica tra i siti attB e attP in Drosophila³. Molti siti di attracco attP sono stati caratterizzati e sono disponibili nel Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

Il sistema di transgenesi phiC31 per Drosophila è stato ampiamente utilizzato dalla comunità delle mosche. Tra i siti di aggancio di attP, attP18 sul cromosoma X, attP40 sul secondo cromosoma e attP2 sul terzo cromosoma sono solitamente i siti preferiti per l'integrazione del transgene su ciascun cromosoma perché i transgeni nei tre siti mostrano alti livelli di espressione inducibile pur avendo bassi livelli di espressione basale⁵. Recentemente, tuttavia, van der Graaf e colleghi hanno scoperto che il sito attP40, vicino al locus del gene Msp300, e i transgeni integrati in attP40 causano il raggruppamento nucleare del muscolo larvale in Drosophila¹⁰. In un altro studio recente, Duan e colleghi hanno scoperto che il cromosoma omozigote attP40 interrompe la normale organizzazione glomerulare della classe di neuroni del recettore olfattivo Or47b in Drosophila¹¹. Questi risultati suggeriscono che dovrebbero essere inclusi controlli rigorosi nella progettazione degli esperimenti e nell'interpretazione dei dati.

La Drosophila è un organismo modello ideale per l'interrogazione in vivo della funzione genica grazie al suo breve ciclo di vita, al basso costo e alla facile manutenzione. Lo screening genetico dell'intero genoma si basa sulla costruzione di librerie transgeniche dell'intero genoma in Drosophila 12,13,14,15. In precedenza abbiamo generato 5551 costrutti UAS-cDNA/ORF basati sul sistema binario GAL4/upstream activating sequence (GAL4/UAS), che coprono l'83% dei geni di Drosophila conservati nell'uomo nella Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection¹⁶. I plasmidi UAS-cDNA/ORF possono essere utilizzati per la creazione di una libreria transgenica UAS-cDNA/ORF in Drosophila. Un'efficiente tecnologia di microiniezione di embrioni può accelerare la creazione di librerie di mosche transgeniche.

Per la microiniezione di embrioni, la punta dell'ago è normalmente rotta contro un vetrino coprioggetti¹⁷. In tal modo, gli aghi spesso si intasano o causano la fuoriuscita di grandi quantità di citoplasma e, quando si verificano questi problemi, è necessario utilizzare nuovi aghi. Sebbene gli aghi smussati possano migliorare l'efficienza della microiniezione, la soluzione di macinazione entra nella punta smussata durante il processo di macinazione. La soluzione di macinazione nella punta smussata non evapora rapidamente in modo naturale; pertanto, gli aghi non possono essere utilizzati per la microiniezione direttamente dopo la smussatura. Questi fattori riducono l'efficienza delle procedure di microiniezione embrionale. Qui, utilizzando come esempio la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31 in Drosophila , presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per evitare che la soluzione di macinazione entri nell'ago, utilizziamo una pompa dell'aria per esercitare una pressione dell'aria all'interno dell'ago, impedendo così alla soluzione di macinazione di entrare nella punta smussata. Gli aghi smussati sono pronti per il caricamento del campione e la microiniezione subito dopo la smussatura.

Protocollo

1. Preparazione di plasmidi

1. Isolare i plasmidi da 4 mL di colture batteriche durante la notte utilizzando un kit di miniprep plasmidico. Eluire con 40 μl di tampone di eluizione.
   NOTA: L'isolamento dei plasmidi utilizzando un kit di preparazione al plasmide midi-prep non è necessario. Un kit di miniprep plasmidico può soddisfare pienamente i requisiti sperimentali per la microiniezione di embrioni. In questo protocollo, i plasmidi UAS-cDNA/ORF preparati contengono dieci copie di UAS, un promotore minimo Hsp70, un sito attB, un gene mini-bianco e un gene di interesse.
2. Determinare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro e conservarlo in congelatore a -80 °C.
   NOTA: La concentrazione di plasmidi non è fondamentale per il successo della microiniezione di embrioni, poiché le concentrazioni di plasmidi che vanno da 20 ng/μL a 1683 ng/μL funzionano bene per la transgenesi in Drosophila (Tabella supplementare 1).
3. Poco prima della microiniezione, scongelare i plasmidi e centrifugare a 13000 x g per 5 minuti.
4. Trasferire 10 μl di ciascun plasmide dallo strato superiore del liquido in una nuova provetta da 1,5 mL.

2. Tirare gli aghi

1. Accendere un estrattore dell'ago con le impostazioni selezionate (Calore: 500, Trazione: 50, Vel: 60, Ritardo: 90, Pressione: 200, Test di rampa: 510).
2. Inserire un capillare in vetro borosilicato (diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,75 mm, lunghezza 10 cm) nell'estrattore dell'ago e chiudere il coperchio.
3. Premere il pulsante Pull . Ogni capillare di vetro forma due aghi.

3. Aghi abrasivi (Figura 1)

1. Utilizzare una smerigliatrice ad aghi montata con una piastra abrasiva appropriata (per punte di dimensioni 0,7-2,0 μm) di una smerigliatrice ad ago.
2. Inumidire il panno (filo di riferimento) con una soluzione di macinazione (100 ml di acqua distillata con 0,9 g di NaCl, 1 ml di agente umettante) e fissare il panno.
3. Accendere la smerigliatrice ad aghi e mantenere la piastra di macinazione in rotazione.
4. Collegare un ago a una pompa dell'aria a pedale con un manometro tramite un tubo capillare in silicone, quindi montare l'ago su un supporto per aghi della smerigliatrice per aghi. Regolare l'angolo dell'ago rispetto alla piastra di macinazione a 35° (Figura 1A, B).
5. Regolare la posizione della punta dell'ago appena sopra la superficie della piastra di macinazione utilizzando una manopola di controllo grossolana sotto il microscopio (Figura 1C).
   NOTA: Gli aghi tirati ottenuti nella sezione 2 hanno una conicità di 6-8 mm e una punta inferiore a 1 μm (Figura 1D), come descritto nel manuale d'uso dell'estrattore.
6. Mantenere la pressione interna dell'ago a 40 psi utilizzando la pompa dell'aria a pedale. Regolare la posizione della punta dell'ago utilizzando una manopola di controllo fine sotto il microscopio e fare in modo che la punta dell'ago tocchi la piastra di macinazione.
7. Macinare per 3-5 s. Quando minuscole bolle d'aria fuoriescono dalla punta dell'ago, scaricare l'ago (Figura 1E).
   NOTA: Durante il processo di macinazione, l'utilizzo di una pompa ad aria impedisce il sifonamento della soluzione di macinazione.
8. Metti gli aghi macinati in una custodia.
   NOTA: Utilizzare il più possibile aghi appena macinati, anche se gli aghi macinati possono essere conservati in una custodia per almeno alcune settimane prima della microiniezione.

4. Preparazione delle pipette per il caricamento dei plasmidi

1. Scaldare una pipetta da 200 μl con la fiamma esterna di un bruciatore ad alcool.
2. Una volta che inizia a sciogliersi, allungare la pipetta.
3. Tagliare l'estremità sigillata della pipetta allungata con le forbici e la pipetta allungata è quindi pronta per caricare il DNA in un ago rettificato.
   NOTA: In alternativa, sono disponibili in commercio punte estremamente lunghe e sottili per il riempimento degli aghi rettificati.
4. Collocare queste pipette in una scatola di plastica autoclavata.

5. Raccolta di embrioni

1. Raccogliere i moscerini (vas-phiC31; + ; attP2) che esprimono l'integrasi phiC31 e che recano il sito di aggancio attP2 da 50 fiale 3 giorni dopo la schiusa e trasferirli in una gabbia (φ 90 mm x 150 mm). Aggiungere un po' di pasta di lievito fresco al centro di ogni piastra di agar d'uva¹⁸.
2. Prepara 2-4 gabbie di mosche. Mantenere le gabbie e le piastre a 25 °C e cambiare le piastre ogni giorno per 2-4 giorni.
   NOTA: Questo studio ha combinato il transgene vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sul primo cromosoma e il transgene attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) sul terzo cromosoma. Il materiale risultante (vas-phiC31; + ; attP2) viene utilizzato in questo protocollo. La pasta di lievito deve essere preparata quotidianamente e la pasta di lievito fresca deve essere somministrata alle mosche. Le gabbie sostituite devono essere ripulite e asciugate per eliminare gli embrioni rimanenti nelle gabbie.
3. Il giorno della microiniezione, cambiare le gabbie e le piastre al mattino. Quindi, cambia le piastre ogni 30 minuti e raccogli gli embrioni da queste piastre. Sostituire tutte le gabbie e le piastre a temperatura ambiente (RT) e successivamente mantenere le gabbie e le piastre a 25 °C.
   NOTA: Alcuni protocolli preferiscono incubare le gabbie e le piastre a 18 °C per la deposizione delle uova. Dipende dal numero di embrioni di cui si ha bisogno per la microiniezione.

6. Dechorionare gli embrioni

1. Preparare il 30% di candeggina mescolando 60 ml di candeggina (contenente un contenuto di cloro attivo di 34-46 g/L) e 140 ml di acqua distillata doppia.
2. Rimuovere le mosche rimanenti sulle piastre di agar al succo d'uva con un pennello o una pinza e sciacquare gli embrioni in un colino cellulare con acqua distillata doppia.
3. Asciugare il colino cellulare contenente gli embrioni con carta velina.
4. Metterlo in una capsula di Petri contenente il 30% di candeggina e agitare il colino cellulare a mano o con uno shaker orizzontale per 1,5 minuti a 60 giri/min.
   NOTA: Il risciacquo è una fase fondamentale. Se il tempo di risciacquo non è abbastanza lungo, il guscio di un embrione non si staccherà completamente. Se il tempo di risciacquo è troppo lungo, l'embrione diventerà morbido e si romperà facilmente. Il filtro cellulare deve essere completamente immerso nel candeggina al 30%. Indossa un paio di guanti di gomma e un camice da laboratorio per evitare lesioni causate dalla candeggina.
5. Sciacquare gli embrioni per 2 minuti con acqua distillata doppia conservata in un flacone di plastica da laboratorio per rimuovere la candeggina residua. Scegli gli embrioni galleggianti per la line-up.

7. Allineare gli embrioni

1. Tagliare l'agar di succo d'uva solido a strisce lunghe usando una lama.
   NOTA: Usa il succo d'uva viola per facilitare l'allineamento degli embrioni bianchi.
2. Trasferisci gli embrioni su una lunga striscia usando un pennello.
3. Allinea circa 60 embrioni con un ago da dissezione lungo il bordo di una lunga striscia con la parte posteriore rivolta verso l'esterno della striscia. Allinea circa 60 embrioni entro 5 minuti.
   NOTA: Il micropilo è una sporgenza a forma di cono al polo anteriore dell'embrione, attraverso la quale lo spermatozoo entra per fecondare l'ovocita (Figura 2A). Pertanto, in base alla sporgenza a forma di cono al polo anteriore dell'embrione, è facile determinare la parte posteriore dell'embrione dechorionato.
4. Posizionare un nastro biadesivo da 18 mm nel senso della lunghezza lungo il bordo di un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm) e rimuovere il supporto di carta. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti sugli embrioni allineati. Assicurati che gli embrioni siano incollati al centro del nastro.

8. Essiccazione degli embrioni

1. Metti il vetrino coprioggetti con gli embrioni allineati in una scatola contenente essiccante. Il tempo di asciugatura varia a seconda della temperatura e dell'umidità.
   NOTA: Il tempo di asciugatura è fondamentale per la microiniezione e deve essere determinato sperimentalmente. Il tempo di asciugatura è solitamente di 9-10 minuti in estate e di 17-18 minuti in inverno.
2. Coprire gli embrioni con olio di alocarburi.
   NOTA: Non far cadere troppo olio sugli embrioni, poiché l'olio in eccesso potrebbe far traboccare l'adesivo. Il rapporto in volume dell'olio alocarbonico 700 e dell'olio alocarbonico 27 è 1:3.

9. Microiniezione di embrioni

1. Caricare 2 μL di DNA nell'ago utilizzando la pipetta allungata. Assicurarsi che non ci siano bolle nell'ago. Posizionare l'ago nel supporto dell'ago del micromanipolatore.
2. Posizionare gli embrioni allineati ricoperti di olio di alocarburi al microscopio invertito. Assicurati che le estremità posteriori degli embrioni siano rivolte verso l'ago.
3. Usa il micromanipolatore per avvicinare l'ago agli embrioni. Elimina l'ago. Assicurarsi che sia visibile una goccia di liquido che fuoriesce dall'ago. A partire da una pressione di iniezione di 300 hPa e una pressione di equilibrio di 20 hPa, regolare la pressione di iniezione e la pressione di equilibrio per garantire la dimensione ottimale della goccia di liquido.
4. Utilizzare il micromanipolatore per inserire l'ago nelle estremità posteriori degli embrioni e utilizzare il comando a pedale collegato al microiniettore per iniettare il DNA (Figura 2). Se è visibile un piccolo alone, il DNA viene iniettato con successo nell'embrione.
   NOTA: Seleziona gli embrioni multinucleati per l'iniezione e uccidi gli embrioni più vecchi utilizzando il pulsante "pulisci". Se una grande quantità di citoplasma fuoriesce dopo l'iniezione, gli embrioni sono poco essiccati. Se dopo l'iniezione fuoriesce solo una piccola quantità o nessuna quantità di citoplasma, le iniezioni sono considerate riuscite. Se più di un terzo degli embrioni perde citoplasma dopo l'iniezione, prolungare il tempo di asciugatura di 1-2 minuti. Se più di un terzo degli embrioni è troppo essiccato, accorciare il tempo di asciugatura di 1-2 minuti.
5. Rimuovere l'ago dall'embrione. Sposta l'ago all'estremità posteriore dell'embrione successivo. Ripeti i passaggi precedenti.
6. Metti gli embrioni iniettati in una piastra di agar. Posizionare la piastra in una stanza a 18-20 °C. Il giorno successivo, trasferire la piastra in un'incubatrice a una temperatura di 25 °Ce un'umidità del 50%-60% e incubare per 1 giorno.
   NOTA: Dopo l'iniezione, mantenere gli embrioni a una temperatura di 18-20 °C per rallentarne lo sviluppo, facilitare l'integrazione del DNA plasmidico nel genoma di Drosophila e aumentare il tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati.

10. Raccolta delle larve

1. Usa un ago da dissezione per raschiare e allentare il cibo in una fiala. Fornire al cibo alcune gocce di acqua distillata.
   NOTA: Lasciare che l'acqua distillata venga assorbita nel cibo per evitare che le larve anneghino.
2. Estrarre le piastre dall'incubatrice.
3. Raccogli le larve schiuse con un pennello sotto uno stereomicroscopio e trasferiscile nella fiala.
4. Mettere il flaconcino in un'incubatrice a una temperatura di 25 °Ce un'umidità del50%-60%.

11. Ottenere mosche transgeniche

1. Raccogliere le mosche schiuse dopo che la fiala è stata incubata a 25 °Cper 10 giorni.
2. Incrocia una singola mosca maschio con tre mosche femmine vergini dei bilanciatori TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ e incrocia una singola mosca femmina con tre mosche maschi dei bilanciatori TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ .
3. Mettere le croci in un'incubatrice a una temperatura di 25 °C e un'umidità del 50%-60%.
4. Esamina la progenie alla ricerca di mosche con gli occhi arancioni. Queste sono le mosche transgeniche (Figura 3A-C).
   NOTA: I moscerini che portano una copia del transgene nel sito di attracco attP2 hanno gli occhi arancioni.
5. Incrocia una singola mosca maschio dagli occhi arancioni con tre mosche femmine vergini dei bilanciatori TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ per stabilire uno stock.
   NOTA: È necessario impostare più di una generazione di incroci per incrociare il transgene phiC31 sul primo cromosoma.

Risultati

La punta di un ago per iniezione è smussata da una smerigliatrice ad aghi (Figura 1). Si possono smussare 50-60 aghi in un'ora. Il DNA viene microiniettato nella parte posteriore di un embrione allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, dove i nuclei condividono un citoplasma comune (Figura 2A). La parte posteriore di un embrione può essere facilmente localizzata in base al micropilo nella parte anteriore dell'embrione (Figur...

Discussione

Qui, presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31, abbiamo iniettato 120-140 embrioni per ciascun plasmide e ottenuto almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi (Tabella supplementare 2). Nella nostra esperienza, il DNA plasmidico isolato da un kit di miniprep plasmidico è sufficiente per la transgenesi in Drosophila. Concentrazioni di DNA plasmidico comprese tra 20 ng/μ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745