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Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
In questo articolo
Riepilogo
Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.
Abstract
La transgenesi in Drosophila è un approccio essenziale per studiare la funzione genica a livello dell'organismo. La microiniezione di embrioni è un passaggio cruciale per la costruzione di mosche transgeniche. La microiniezione richiede alcuni tipi di apparecchiature, tra cui un microiniettore, un micromanipolatore, un microscopio invertito e uno stereomicroscopio. I plasmidi isolati con un kit di miniprep plasmidico sono qualificati per la microiniezione. Gli embrioni allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, in cui i nuclei condividono un citoplasma comune, vengono sottoposti a microiniezione. Un colino cellulare facilita il processo di dechorionizzazione degli embrioni. Il momento ottimale per la decorionazione e l'essiccazione degli embrioni deve essere determinato sperimentalmente. Per aumentare l'efficienza della microiniezione di embrioni, gli aghi preparati da un estrattore devono essere smussati da una smerigliatrice ad aghi. Nel processo di rettifica degli aghi, utilizziamo una pompa dell'aria a pedale con un manometro per evitare l'effetto capillare della punta dell'ago. Iniettiamo abitualmente 120-140 embrioni per ogni plasmide e otteniamo almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi. Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo dettagliato per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila.
Introduzione
Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster è estremamente suscettibile di manipolazione genetica e analisi genetica. I moscerini della frutta transgenici sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Da quando è stata sviluppata nei primi anni '80, la transgenesi mediata da trasposoni di elementi P è stata indispensabile per laricerca sulla Drosophila. In alcuni scenari, altri trasposoni, come piggyBac e Minos sono stati utilizzati per la transgenesi in Drosophila 2. I transgeni tramite trasposone vengono inseriti casualmente nel genoma di Drosophila e i livelli di espress....
Protocollo
1. Preparazione di plasmidi
- Isolare i plasmidi da 4 mL di colture batteriche durante la notte utilizzando un kit di miniprep plasmidico. Eluire con 40 μl di tampone di eluizione.
NOTA: L'isolamento dei plasmidi utilizzando un kit di preparazione al plasmide midi-prep non è necessario. Un kit di miniprep plasmidico può soddisfare pienamente i requisiti sperimentali per la microiniezione di embrioni. In questo protocollo, i plasmidi UAS-cDNA/ORF preparati contengono dieci copie di UAS, un promotore minimo Hsp70, un sito attB, un gene mini-bianco e un gene di interesse. - Determinare la concentrazione di DNA plasmidico utilizzando un....
Risultati Rappresentativi
La punta di un ago per iniezione è smussata da una smerigliatrice ad aghi (Figura 1). Si possono smussare 50-60 aghi in un'ora. Il DNA viene microiniettato nella parte posteriore di un embrione allo stadio di pre-blastoderma o blastoderma sinciziale, dove i nuclei condividono un citoplasma comune (Figura 2A). La parte posteriore di un embrione può essere facilmente localizzata in base al micropilo nella parte anteriore dell'embrione (Figur.......
Discussione
Qui, presentiamo un protocollo per la microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila. Per la transgenesi sito-specifica mediata da phiC31, abbiamo iniettato 120-140 embrioni per ciascun plasmide e ottenuto almeno una linea transgenica per circa l'85% dei plasmidi (Tabella supplementare 2). Nella nostra esperienza, il DNA plasmidico isolato da un kit di miniprep plasmidico è sufficiente per la transgenesi in Drosophila. Concentrazioni di DNA plasmidico comprese tra 20 ng/μ.......
Divulgazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Riconoscimenti
Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo per la ricerca scientifica per talenti di alto livello, Università della Cina meridionale.
....Materiali
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
Riferimenti
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.
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