Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Resumen

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Resumen

La transgénesis en Drosophila es un enfoque esencial para estudiar la función de los genes a nivel de organismo. La microinyección de embriones es un paso crucial para la construcción de moscas transgénicas. La microinyección requiere algunos tipos de equipos, incluidos un microinyector, un micromanipulador, un microscopio invertido y un microscopio estereoscópico. Los plásmidos aislados con un kit de minipreparación de plásmidos están calificados para microinyección. Los embriones en la etapa pre-blastodermo o blastodermo sincitial, donde los núcleos comparten un citoplasma común, se someten a microinyección. Un filtro de células facilita el proceso de descorionación de los embriones. El momento óptimo para la decorionación y desecación de los embriones debe determinarse experimentalmente. Para aumentar la eficiencia de la microinyección de embriones, las agujas preparadas por un extractor deben ser biseladas por un molinillo de agujas. En el proceso de molienda de agujas, utilizamos una bomba de aire de pie con un manómetro para evitar el efecto capilar de la punta de la aguja. Inyectamos rutinariamente entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtenemos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos. Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo detallado para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila.

Introducción

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es extremadamente susceptible a la manipulación genética y al análisis genético. Las moscas transgénicas de la fruta son ampliamente utilizadas en la investigación biológica. Desde que se desarrolló a principios de la década de 1980, la transgénesis mediada por transposones del elemento P ha sido indispensable para la investigación de Drosophila ¹. En algunos escenarios, otros transposones, como piggyBac y Minos, también se han utilizado para la transgénesis en Drosophila ². Los transgenes a través de transposones se insertan aleatoriamente en el genoma de Drosophila, y los niveles de expresión de los transgenes en diferentes loci genómicos pueden variar debido a los efectos de posición y, por lo tanto, no se pueden comparar². Estos inconvenientes fueron superados por la transgénesis específica del sitio³ mediada por phiC31. El gen bacteriófago phiC31 codifica una integrasa que media la recombinación específica de la secuencia entre los sitios attB y attP en Drosophila³. Muchos sitios de acoplamiento attP han sido caracterizados y están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

El sistema de transgénesis phiC31 para Drosophila ha sido ampliamente utilizado por la comunidad de moscas. Entre los sitios de acoplamiento de attP, attP18 en el cromosoma X, attP40 en el segundo cromosoma y attP2 en el tercer cromosoma suelen ser los sitios preferidos para la integración de transgenes en cada cromosoma porque los transgenes en los tres sitios muestran altos niveles de expresión inducible mientras que tienen bajos niveles de expresión basal⁵. Recientemente, sin embargo, van der Graaf y sus colegas descubrieron que el sitio attP40, cerca del locus del gen Msp300, y los transgenes integrados en attP40 causan el agrupamiento nuclear del músculo larvario en Drosophila¹⁰. En otro estudio reciente, Duan y sus colegas encontraron que el cromosoma homocigoto attP40 interrumpe la organización glomerular normal de la clase de neuronas receptoras olfativas Or47b en Drosophila¹¹. Estos hallazgos sugieren que se deben incluir controles rigurosos al diseñar experimentos e interpretar los datos.

Drosophila es un organismo modelo ideal para la interrogación in vivo de la función génica debido a su corto ciclo de vida, bajo costo y fácil mantenimiento. El cribado genético de todo el genoma se basa en la construcción de bibliotecas de transgénicos de todo el genoma en Drosophila 12,13,14,15. Previamente generamos 5551 construcciones UAS-cDNA/ORF basadas en el sistema binario GAL4/secuencia activadora ascendente (GAL4/UAS), que cubren el 83% de los genes de Drosophila conservados en humanos en la Colección de Oro del Centro de Recursos Genómicos de Drosophila (DGRC)¹⁶. Los plásmidos UAS-cDNA/ORF se pueden utilizar para la creación de una biblioteca transgénica de UAS-cDNA/ORF en Drosophila. La tecnología eficiente de microinyección de embriones puede acelerar la creación de bibliotecas de moscas transgénicas.

Para la microinyección de embriones, la punta de la aguja normalmente se rompe contra un cubreobjetos¹⁷. Por lo tanto, las agujas con frecuencia se obstruyen o causan fugas de grandes cantidades de citoplasma, y cuando surgen estos problemas, se deben emplear nuevas agujas. Aunque las agujas de biselado pueden mejorar la eficiencia de la microinyección, la solución de molienda ingresa a la punta biselada durante el proceso de molienda. La solución de molienda en la punta biselada no se evapora rápidamente de forma natural; Por lo tanto, las agujas no se pueden utilizar para la microinyección directamente después del biselado. Estos factores reducen la eficiencia de los procedimientos de microinyección de embriones. Aquí, utilizando como ejemplo la transgénesis específica mediada por phiC31 en Drosophila , presentamos un protocolo para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila. Para evitar que la solución de molienda ingrese a la aguja, utilizamos una bomba de aire para ejercer presión de aire dentro de la aguja, evitando así que la solución de molienda ingrese a la punta biselada. Las agujas biseladas están listas para la carga de muestras y la microinyección directamente después del biselado.

Protocolo

1. Preparación de plásmidos

1. Aísle plásmidos de cultivos bacterianos nocturnos de 4 mL utilizando un kit de minipreparación de plásmidos. Elución con 40 μL de tampón de elución.
   NOTA: No es necesario el aislamiento de plásmidos mediante un kit de preparación midi de plásmidos. Un kit de minipreparación de plásmidos puede cumplir plenamente con los requisitos experimentales para la microinyección de embriones. En este protocolo, los plásmidos UAS-cDNA/ORF preparados contienen diez copias de UAS, un promotor mínimo Hsp70, un sitio attB, un gen mini-blanco y un gen de interés.
2. Determine la concentración de ADN plasmídico utilizando un espectrofotómetro y guárdelo a -80 °C en el congelador.
   NOTA: La concentración de plásmidos no es crítica para el éxito de la microinyección de embriones, ya que las concentraciones de plásmidos que oscilan entre 20 ng/μL y 1683 ng/μL funcionan bien para la transgénesis en Drosophila (Tabla suplementaria 1).
3. Justo antes de la microinyección, descongele los plásmidos y centrifugue a 13000 x g durante 5 min.
4. Transfiera 10 μL de cada plásmido de la capa superior del líquido a un nuevo tubo de 1,5 mL.

2. Tirar de las agujas

1. Encienda un extractor de agujas con los ajustes seleccionados (Calor: 500, Tirón: 50, Vela: 60, Retardo: 90, Presión: 200, Prueba de rampa: 510).
2. Inserte un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,75 mm, 10 cm de longitud) en el extractor de agujas y cierre la tapa.
3. Presione el botón Tirar . Cada capilar de vidrio forma dos agujas.

3. Agujas de molienda (Figura 1)

1. Utilice una amoladora de agujas montada con una placa abrasiva adecuada (para tamaños de punta de 0,7-2,0 μm) de una amoladora de agujas.
2. Humedecer el paño (hilo de referencia) con solución de molienda (100 ml de agua destilada con 0,9 g de NaCl, 1 ml de agente humectante) y fijar el paño.
3. Encienda la amoladora de agujas y mantenga la placa de molienda girando.
4. Conecte una aguja a una bomba de aire de pie con un manímetro a través de un tubo capilar de silicona y, a continuación, monte la aguja en un soporte de aguja de la amoladora de agujas. Ajuste el ángulo de la aguja con respecto a la placa de molienda a 35° (Figura 1A, B).
5. Ajuste la posición de la punta de la aguja justo por encima de la superficie de la placa de molienda utilizando una perilla de control gruesa debajo del microscopio (Figura 1C).
   NOTA: Las agujas estiradas obtenidas en la sección 2 tienen un cono de 6-8 mm y una punta inferior a 1 μm (Figura 1D), tal y como se describe en el manual de usuario del extractor.
6. Mantenga la presión interna de la aguja a 40 psi usando la bomba de aire de pie. Ajuste la posición de la punta de la aguja usando una perilla de control fino debajo del microscopio y haga que la punta de la aguja toque la placa de molienda.
7. Moler durante 3-5 s. Cuando salgan pequeñas burbujas de aire de la punta de la aguja, descargue la aguja (Figura 1E).
   NOTA: En el proceso de molienda, el uso de una bomba de aire evita que la solución de molienda se desvíe.
8. Coloque las agujas molidas en un estuche de almacenamiento.
   NOTA: Use agujas recién molidas tanto como sea posible, aunque las agujas molidas se pueden guardar en un estuche de almacenamiento durante al menos unas semanas antes de la microinyección.

4. Preparación de pipetas para la carga de plásmidos

1. Calentar una pipeta de 200 μL con la llama exterior de un quemador de alcohol.
2. Una vez que empiece a derretirse, estira la pipeta.
3. Corte el extremo sellado de la pipeta estirada con unas tijeras, y la pipeta estirada estará lista para cargar el ADN en una aguja rectificada.
   NOTA: Alternativamente, se comercializan puntas extremadamente largas y finas para llenar agujas molidas.
4. Coloque estas pipetas en una caja de plástico esterilizada en autoclave.

5. Recolección de embriones

1. Recoja moscas (vas-phiC31; + ; attP2) que expresen la integrasa phiC31 y lleven el sitio de acoplamiento attP2 3 días después de que hayan eclosionado de 50 viales y transfiéralas a una jaula (φ 90 mm x 150 mm). Agregue un poco de pasta de levadura fresca en el centro de cada plato de agar uva¹⁸.
2. Prepara de 2 a 4 jaulas de moscas. Mantenga las jaulas y las placas a 25 °C y cambie las placas todos los días durante 2-4 días.
   NOTA: Este estudio combinó el transgén vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) en el primer cromosoma y el transgén attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) en el tercer cromosoma. El stock resultante (vas-phiC31; + ; attP2) se utiliza en este protocolo. La pasta de levadura debe prepararse a diario, y la pasta de levadura fresca debe alimentarse con las moscas. Las jaulas reemplazadas deben limpiarse y secarse para deshacerse de los embriones restantes en las jaulas.
3. El día de la microinyección, cambie las jaulas y las placas por la mañana. Luego, cambie las placas cada 30 minutos y recoja los embriones de estas placas. Cambie todas las jaulas y placas a temperatura ambiente (RT) y luego mantenga las jaulas y placas a 25 °C.
   NOTA: Algunos protocolos prefieren incubar las jaulas y placas a 18 °C para la puesta de huevos. Depende del número de embriones que se necesiten para la microinyección.

6. Embriones descorionantes

1. Prepare lejía al 30% mezclando 60 mL de lejía (con un contenido de cloro activo de 34-46 g/L) y 140 mL de agua bidestilada.
2. Retire las moscas restantes en las placas de agar jugo de uva con un cepillo o pinzas, y enjuague los embriones en un colador de células con agua destilada doble.
3. Seque el colador de células que contiene los embriones con papel de seda.
4. Colóquelo en una placa de Petri que contenga un 30% de lejía y agite el colador de celdas con la mano o con un agitador horizontal durante 1,5 min a 60 rpm.
   NOTA: El enjuague es un paso crítico. Si el tiempo de enjuague no es lo suficientemente largo, la cáscara de un embrión no se desprenderá por completo. Si el tiempo de enjuague es demasiado largo, hará que el embrión se ablande y se rompa fácilmente. El colador de células debe estar completamente sumergido en el 30% de lejía. Use un par de guantes de goma y una bata de laboratorio para evitar lesiones causadas por la lejía.
5. Enjuague los embriones durante 2 minutos con agua destilada doble almacenada en una botella de lavado de plástico de laboratorio para eliminar la lejía residual. Elige los embriones flotantes para la alineación.

7. Alinear embriones

1. Corta el agar jugo de uva sólido en tiras largas con una cuchilla.
   NOTA: Use jugo de uva morada para que sea más fácil alinear los embriones blancos.
2. Transfiera los embriones a una tira larga con un pincel.
3. Alinee alrededor de 60 embriones con una aguja de disección a lo largo del borde de una tira larga con sus partes posteriores mirando hacia el exterior de la tira. Alinee alrededor de 60 embriones en 5 minutos.
   NOTA: El micrópilo es una protuberancia en forma de cono en el polo anterior del embrión, a través de la cual entran los espermatozoides para fecundar el ovocito (Figura 2A). Por lo tanto, a partir de la protuberancia en forma de cono en el polo anterior del embrión, es fácil determinar la parte posterior del embrión decorionado.
4. Coloque una cinta adhesiva de doble cara de 18 mm a lo largo del borde de un cubreobjetos (18 mm x 18 mm) y retire el soporte de papel. Presione suavemente el cubreobjetos sobre los embriones alineados. Asegúrate de que los embriones estén pegados al centro de la cinta.

8. Desecación de embriones

1. Coloque el cubreobjetos con los embriones alineados en una caja que contenga desecante. El tiempo de secado varía en función de la temperatura y la humedad.
   NOTA: El tiempo de secado es crítico para la microinyección y debe determinarse experimentalmente. El tiempo de secado suele ser de 9-10 min en verano y de 17-18 min en invierno.
2. Cubre los embriones con aceite de halocarbono.
   NOTA: No deje caer demasiado aceite sobre los embriones, ya que el aceite adicional puede desbordar el adhesivo. La relación de volumen del aceite de halocarbono 700 y el aceite de halocarbono 27 es de 1:3.

9. Microinyección de embriones

1. Cargue 2 μL de ADN en la aguja utilizando la pipeta estirada. Asegúrese de que no haya burbujas en la aguja. Coloque la aguja en el portaagujas del micromanipulador.
2. Coloque los embriones alineados cubiertos con aceite de halocarbono bajo un microscopio invertido. Asegúrese de que los extremos posteriores de los embriones miren hacia la aguja.
3. Utilice el micromanipulador para acercar la aguja a los embriones. Limpie la aguja. Asegúrese de que una gota de líquido que sale de la aguja sea visible. A partir de una presión de inyección de 300 hPa y una presión de equilibrio de 20 hPa, ajuste la presión de inyección y la presión de equilibrio para garantizar el tamaño óptimo de la gota de líquido.
4. Utilice el micromanipulador para insertar la aguja en los extremos posteriores de los embriones, y utilice el pedal de control conectado al microinyector para inyectar el ADN (Figura 2). Si hay un pequeño halo visible, el ADN se inyecta con éxito en el embrión.
   NOTA: Seleccione los embriones multinucleados para la inyección y mate los embriones más viejos usando el botón "limpiar". Si se filtra una gran cantidad de citoplasma después de la inyección, los embriones no se secan lo suficiente. Si solo se filtra una pequeña cantidad o ninguna cantidad de citoplasma después de la inyección, las inyecciones se consideran exitosas. Si más de un tercio de los embriones pierden citoplasma después de la inyección, prolongue el tiempo de secado entre 1 y 2 minutos. Si más de un tercio de los embriones se han secado en exceso, acorte el tiempo de secado en 1-2 minutos.
5. Retire la aguja del embrión. Mueva la aguja hasta el extremo posterior del siguiente embrión. Repita los pasos anteriores.
6. Coloque los embriones inyectados en una placa de agar. Coloque la placa en una habitación a 18-20 °C. Al día siguiente, transfiera la placa a una incubadora a una temperatura de 25 °Cy una humedad del 50%-60%, e incube durante 1 día.
   NOTA: Después de la inyección, mantener los embriones a una temperatura de 18-20 °C para ralentizar su desarrollo, facilitar la integración del ADN plasmídico en el genoma de Drosophila y aumentar la tasa de supervivencia de los embriones inyectados.

10. Recolección de larvas

1. Use una aguja de disección para raspar y aflojar la comida en un frasco. Suministra la comida con unas gotas de agua destilada.
   NOTA: Permita que el agua destilada se absorba en la comida para evitar que las larvas se ahoguen.
2. Saque las placas de la incubadora.
3. Recoja las larvas eclosionadas con un pincel bajo un microscopio estereoscópico y transfiéralas al vial.
4. Coloque el vial en una incubadora a una temperatura de 25 °Cy una humedad del50%-60%.

11. Obtención de moscas transgénicas

1. Recoja las moscas eclosionadas después de incubar el vial a 25 °Cdurante 10 días.
2. Cruce una sola mosca macho con tres moscas hembra vírgenes de los balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ , y cruce una sola mosca hembra con tres moscas macho de los balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ .
3. Coloque las cruces en una incubadora a una temperatura de 25 °C y una humedad del 50%-60%.
4. Examina la progenie en busca de moscas con ojos naranjas. Estas son las moscas transgénicas (Figura 3A-C).
   NOTA: Las moscas portadoras de una copia del transgén en el sitio de acoplamiento attP2 tienen ojos anaranjados.
5. Cruce una sola mosca macho de ojos naranjas con tres moscas hembra vírgenes de los balanceadores TM2/TM6C Sb¹ Tb¹ para establecer una población.
   NOTA: Es necesario establecer más de una generación de cruzamientos para eliminar el transgén phiC31 en el primer cromosoma.

Resultados

La punta de una aguja de inyección es biselada por un molinillo de agujas (Figura 1). Se pueden biselar 50-60 agujas en una hora. El ADN se microinyecta en la parte posterior de un embrión en la etapa pre-blastodermo o blastodermo sincitial, donde los núcleos comparten un citoplasma común (Figura 2A). La parte posterior de un embrión se puede localizar fácilmente en función del micrópilo en la parte anterior del embrión (Figura 2A

Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo de microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila. Para la transgénesis específica del sitio mediada por phiC31, inyectamos entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtuvimos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos (Tabla suplementaria 2). En nuestra experiencia, el ADN plasmídico aislado por un kit de minipreparación de plásmidos es suficiente para la transgénesis en Drosophila. Las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745