用肽：主要组织相容性复合物四聚体鉴定小鼠肺中的稀有抗原特异性 T 细胞

摘要

我们提供了详细的方案，用于通过基于磁珠的 T 细胞富集和肽：主要组织相容性复合物 （MHC） 四聚体来分离和鉴定小鼠肺中罕见的抗原特异性 T 细胞群。

摘要

在健康和疾病过程中抗原特异性 T 细胞的鉴定和表征仍然是提高我们对免疫病理生理学理解的关键。肽：MHC 四聚体试剂的开发大大推进了在内源性 T 细胞库中追踪抗原特异性 T 细胞群的技术挑战。这些荧光标记的 MHC I 类或 II 类分子的可溶性多聚体与抗原肽表位复合，直接与具有相应 T 细胞受体 （TCR） 特异性的 T 细胞结合，因此可以识别天然状态下的抗原特异性 T 细胞群，而无需离 体 诱导的功能反应刺激。对于极其罕见的群体，可以磁性富集四聚体结合的 T 细胞，以提高检测的灵敏度和可靠性。

随着组织驻留 T 细胞免疫研究的深入，迫切需要识别转运到非淋巴组织并驻留在非淋巴组织中的抗原特异性 T 细胞。在该协议中，我们提出了一组详细的说明，用于分离和表征小鼠肺中存在的抗原特异性 T 细胞。这包括从消化的肺组织中分离 T 细胞，然后进行一般的 T 细胞磁性富集步骤和四聚体染色，以进行流式细胞术分析和分选。该方案中强调的步骤利用了常用技术和现成的试剂，使其几乎适用于任何从事小鼠 T 细胞免疫学的研究人员，并且高度适用于驻留在肺内的任何低频抗原特异性 T 细胞群的各种下游分析。

引言

适应性免疫系统的核心在于 T 细胞识别和响应特定抗原的能力。T 细胞何时何地对其同源抗原做出反应，决定了感染与自身免疫、体内平衡与癌症、健康与疾病¹ 的平衡。因此，在免疫的特定背景下对 T 细胞的研究应侧重于对感兴趣的相关抗原具有特异性的细胞。在大大增强表征抗原特异性 T 细胞群能力的技术进步中，主要组织相容性复合体 （MHC） I 类或 II 类分子的荧光标记的可溶性多聚体（通常是四聚体）与抗原肽表位复合，更广为人知的是“肽：MHC 四聚体”2,3,4,5 .通过代表 T 细胞抗原受体 （TCR） 的天然配体，peptide：MHC I 类和 II 类四聚体提供了一种在免疫系统中 T 细胞的内源性库中分别直接识别抗原特异性 CD8⁺ 和 CD4⁺ T 细胞的方法，而无需在测定中对抗原刺激做出反应。与 TCR 转基因 T 细胞过继转移模型相比，四聚体代表了一种更优雅的抗原特异性 T 细胞研究方法⁶，并且已越来越多地用于识别实验小鼠模型和人类疾病中的外源和自身抗原特异性 T 细胞群 ^4....

研究方案

本协议中描述的程序是根据马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 制定的指导方针批准和制定的，该委员会是美国实验动物护理认证协会 （AAALAC） 认可的动物管理计划。在 8-12 周龄雄性和雌性小鼠身上进行了实验，其遗传背景是在 MGH 动物设施中在特定无病原体条件下培育和维持的 C57BL/6 遗传背景。

1. 制备储备液

1. 通过溶解 10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、150 mM NaCl 和 1 mM MgCl₂ 来制备 HEPES 缓冲液，并调节至 pH 7.4。
2. 通过将 700 μg/mL 的 Liberase 嗜热菌蛋白酶培养基 （TM）（参见 材料表）溶解在含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺ 的 Hank 平衡盐溶液中，制备 10x Liberase 储备液（参见 材料表）。
3. 通过将 100 mM 氨基胍半硫酸盐（参见 材料表）溶解在含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺ 的 Hank 平衡盐溶液中，制备 10x 氨基胍储备液（参见 材料表）。
4. 通过将 EH....

讨论

来自肺部的抗原特异性 T 细胞的先前表征受益于抗原特异性 T 细胞的大量生长，这些 T 细胞在急性引发事件（如鼻内免疫或感染）后扩增 20,21,22。然而，如果不对感兴趣的 T 细胞进行某种形式的样本富集，就很难检测到肺部较稀有的 T 细胞群，例如自身抗原特异性 T 细胞或组织驻留记忆 T 细胞 15,16,23。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02