ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

要約

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。

要約

健康および疾患における抗原特異的T細胞の同定と特性評価は、免疫病態生理学の理解を深めるための鍵であり続けています。内因性T細胞レパートリー内の抗原特異的T細胞集団を追跡するという技術的課題は、ペプチド:MHCテトラマー試薬の開発によって大幅に進歩しました。抗原性ペプチドエピトープに複合体を形成したMHCクラスIまたはクラスII分子のこれらの蛍光標識可溶性マルチマーは、対応するT細胞受容体(TCR)特異性を持つT細胞に直接結合するため、 ex vivo によって誘導される機能的応答を必要とせずに、天然状態の抗原特異的T細胞集団を同定できます刺激。非常にまれな集団の場合、四量体に結合したT細胞を磁気的に濃縮して、検出の感度と信頼性を高めることができます。

組織に常在するT細胞免疫の研究が深まるにつれ、非リンパ組織に輸送され、非リンパ組織に存在する抗原特異的T細胞の同定が急務となっています。このプロトコルでは、マウスの肺内に存在する抗原特異的T細胞の単離と特性評価のための詳細な指示を提示します。これには、消化された肺組織からのT細胞の単離と、フローサイトメトリー分析とソーティングのための一般的なT細胞磁気濃縮ステップとテトラマー染色が含まれます。このプロトコルで強調されているステップは、一般的な技術と容易に利用可能な試薬を利用しているため、マウスT細胞免疫学に従事するほぼすべての研究者がアクセスでき、肺内に存在している低頻度抗原特異的T細胞集団のさまざまなダウンストリーム分析に非常に適応性があります。

概要

適応免疫系の中心には、T細胞が特定の抗原を認識して応答する能力があります。T細胞がいつ、どこでその同族抗原に応答するかによって、感染と自己免疫、恒常性と癌、健康と病気のバランスが決まります¹。したがって、免疫の特定の状況におけるT細胞の研究は、関心のある関連抗原に対する特異性を持つ細胞に焦点を当てるべきです。抗原特異的T細胞集団を特徴付ける能力を大幅に向上させた技術的進歩の中には、「ペプチド:MHC四量体」としてよく知られている抗原性ペプチドエピトープに複合体化された主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII分子の蛍光標識可溶性多量体(通常は四量体)があります2,3,4,5 .ペプチド:MHCクラスIおよびクラスII四量体は、T細胞抗原受容体(TCR)の天然リガンドを発現することにより、免疫系のT細胞の内因性レパートリー内の抗原特異的CD8⁺およびCD4⁺ T細胞をそれぞれ直接同定する手段を提供します。四量体は、抗原特異的T細胞の研究において、TCRトランスジェニックT細胞養子導入モデル⁶よりもエレガントなアプローチであり、....

プロトコル

このプロトコルに記載されている手順は、米国実験動物ケア認定協会(AAALAC)認定の動物管理プログラムであるマサチューセッツ総合病院の動物管理委員会(IACUC)が定めたガイドラインに従って承認および開発されています。実験は、MGH動物施設で特定の病原体のない条件下で飼育および維持されたC57BL / 6遺伝的背景で、8〜12週齢の雄および雌マウスで行われました。

1. 原液の調製

1. 10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、150 mM NaCl、および1 mM MgCl₂を溶解してHEPES緩衝液を調製し、pH 7.4に調整します。
2. 700 μg/mL のリベラーゼサーモリシン培地(TM)( 材料表を参照)を Ca⁺⁺ および Mg⁺⁺ を含む Hank's Balanced Salt Solution ( 材料表を参照) に溶解し、10x リベラーゼストック溶液を調製します。
3. 100 mMアミノグアニジン半硫酸塩( 材料表を参照)をCa⁺⁺ およびMg⁺⁺ ( 材料表を参照)を含むハンク平衡....

ディスカッション

肺からの抗原特異的T細胞の以前の特性評価は、鼻腔内免疫や感染などの急性プライミングイベント後に増殖する抗原特異的T細胞の強力な数の恩恵を受けてきました20,21,22。しかし、自己抗原特異的T細胞や組織常在メモリーT細胞など、肺内のまれなT細胞集団は、目的のT細胞15,16,23に対する何らかの形のサンプル濃縮なし?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02