Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Résumé

L’identification et la caractérisation des lymphocytes T spécifiques de l’antigène au cours de la santé et de la maladie restent essentielles pour améliorer notre compréhension de la physiopathologie immunitaire. Les défis techniques du suivi des populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans le répertoire des lymphocytes T endogènes ont été considérablement avancés par le développement de réactifs peptide :tétramère CMH. Ces multimères solubles marqués par fluorescence de molécules du CMH de classe I ou de classe II complexées à des épitopes peptidiques antigéniques se lient directement aux lymphocytes T avec la spécificité correspondante du récepteur des lymphocytes T (TCR) et peuvent donc identifier les populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans leur état natif sans qu’il soit nécessaire de disposer d’une réponse fonctionnelle induite par ex vivo stimulation. Pour les populations extrêmement rares, les lymphocytes T liés aux tétramères peuvent être enrichis magnétiquement pour augmenter la sensibilité et la fiabilité de la détection.

À mesure que l’étude de l’immunité des lymphocytes T résidents des tissus s’approfondit, il est urgent d’identifier les lymphocytes T spécifiques de l’antigène qui circulent vers les tissus non lymphoïdes et y résident. Dans ce protocole, nous présentons un ensemble détaillé d’instructions pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes T spécifiques de l’antigène présents dans les poumons de souris. Cela implique l’isolement des lymphocytes T à partir de tissus pulmonaires digérés, suivi d’une étape générale d’enrichissement magnétique des lymphocytes T et d’une coloration au tétramère pour l’analyse et le tri par cytométrie en flux. Les étapes mises en évidence dans ce protocole utilisent des techniques courantes et des réactifs facilement disponibles, ce qui le rend accessible à presque tous les chercheurs engagés dans l’immunologie des lymphocytes T de souris, et sont hautement adaptables pour une variété d’analyses en aval de toute population de lymphocytes T spécifiques à l’antigène à basse fréquence résidant dans les poumons.

Introduction

Au cœur du système immunitaire adaptatif se trouve la capacité d’un lymphocyte T à reconnaître et à répondre à un antigène spécifique. Le moment et l’endroit où un lymphocyte T répond à son antigène apparenté déterminent l’équilibre entre l’infection et l’auto-immunité, l’homéostasie et le cancer, la santé et la maladie¹. Il s’ensuit que l’étude des lymphocytes T dans un contexte spécifique d’immunité devrait se concentrer sur les cellules présentant une spécificité pour un antigène pertinent d’intérêt. Parmi les avancées technologiques qui ont considérablement amélioré la capacité à caractériser les populations de lymphocytes T spécifiques de ....

Protocole

Les procédures décrites dans ce protocole sont approuvées et élaborées conformément aux lignes directrices établies par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Massachusetts General Hospital, un programme de gestion des animaux accrédité par l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Des expériences ont été réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines sur un fond génétique C57BL/6 élevé et maintenu dans l’animalerie de l’HGM dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes.

1. Préparation des solutions mères

1. Préparez le tampo....

Discussion

Les caractérisations antérieures des lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons ont bénéficié du nombre robuste de lymphocytes T spécifiques de l’antigène qui se développent à la suite d’un événement d’amorçage aigu tel qu’une immunisation intranasale ou une infection 20,21,22^. Cependant, les populations de lymphocytes T plus rares dans les poumons, telles que les lymphocytes T spécifiques .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm cell strainer	Fisher Scientific	22-363-549
10x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	46-013-CM
1x PBS without Ca++ or Mg++	Corning	21-031-CV
AccuCheck Counting Beads	Invitrogen	PCB100
Aminoguanidine Hemisulfate Salt	Sigma-Aldrich	A7009
CD90.2 microbeads, mouse	Miltenyi	130-121-278
Cell separation magnet (MidiMACS Separator)	Miltenyi	130-042-302	Holds single LS column
Cell separation magnet (QuadroMACS Separator)	Miltenyi	130-090-976	Holds 4 LS columns
Dasatinib	Sigma-Aldrich	CDS023389
DNase I	Roche	10104159001
Eagle’s Ham’s Amino Acids medium	Sigma-Aldrich	C5572
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235	Automated tissue dissociator
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237	Automated tissue dissociator tubes
Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++	Corning	21-020-CM
HEPES	Gibco	15630080
Ketamine	Vedco	NDC 50989-996-06
Liberase TM	Roche	5401119001
Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11)	Biolegend	103126
Paramagnetic cell separation columns (LS Columns)	Miltenyi	130-042-401	Comes with plunger
Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93)	Biolegend	101302
RPMI 1640 medium without L-glutamine	Corning	15-040-CM
Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline)	Cytiva	Z1376
Xylazine	Pivetal	NDC 466066-750-02